李立煊 張克英 丁雪梅 白世平 王建萍 呂 莉 玄 玥 曾秋鳳
(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所,動物抗病營養(yǎng)教育部、農(nóng)業(yè)部和四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 611130)
植物精油(essential oil,EO)是由草本植物的花、葉、根、樹皮等通過蒸餾、壓榨等方法提取[1-2],根據(jù)其活性成分主要分為4個種類,分別為萜類化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物和氮硫化合物[3],具有抗真菌[4]、抗炎[5-6]、保護(hù)腸道屏障[7]等功能。劉嬌等[8]研究表明,在大腸桿菌攻毒肉鴨的飼糧中添加200 mg/kg主要成分為香芹酚、χ-萜品醇、傘花烴和百里香酚的精油產(chǎn)品,可不同程度地增加肉鴨體重和平均日增重,降低料重比。吳昊等[9]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加有效成分為百里香酚、香芹酚、肉桂醛的復(fù)合EO可以改善麻黃肉雞的血清抗氧化能力,并會對其胸肌肉品質(zhì)產(chǎn)生影響。Su等[10]以愛拔益加(AA)肉雞為研究對象,評估了有效成分為百里酚、香芹酚和肉桂醛的EO添加量的作用效果,發(fā)現(xiàn)EO的添加量對肉雞生長性能無顯著影響;但隨EO添加量的增加,飼糧干物質(zhì)、總能和粗脂肪的消化率顯著增加,且空腸絨隱比增加。但Xue等[11]研究發(fā)現(xiàn),飼糧添加100 mg/kg有效成分為桉樹油、香芹酚、肉桂醛、辣椒素的EO混合物對肉雞生長性能、胴體性狀、腸道形態(tài)均無顯著影響。以上研究結(jié)果提示,EO的作用效果受EO有效成分、添加量、穩(wěn)定性、加工工藝及動物種類、年齡等的影響[12-13]。
因傳統(tǒng)EO在體外和體內(nèi)均不穩(wěn)定,如檸檬草精油、牛至精油等,常溫下多處于液體狀態(tài),暴露空氣中具有易揮發(fā)、氣味大、適口性差等[14-17]特性,使其在飼料加工制粒、膨化及儲存中極其不穩(wěn)定,影響其在動物體內(nèi)的效價,且EO中的活性物質(zhì)易受到空氣、光線、水分、溫度等[18]外界因素的影響,對環(huán)境非常敏感,這使得EO在實(shí)際生產(chǎn)中存在很多局限性。為了避免EO的揮發(fā),使其免受高溫、氧化和紫外線等外界環(huán)境因素的影響[18-19],有必要對EO進(jìn)行制劑技術(shù)處理。晶體工程技術(shù)可以將藥物活性成分(active pharmaceutical ingredient,API)與其他配體以氫鍵、π-π堆積作用、范德華力和其他非共價鍵相連可控地構(gòu)筑在同一晶格中[20],在不改變API結(jié)構(gòu)及生物活性的同時,改善其理化性質(zhì),包括提高溶解度和溶出速率,改善化學(xué)穩(wěn)定性、機(jī)械性能和生物利用度等[21]。因此,本研究擬以櫻桃谷肉鴨為試驗(yàn)動物,通過考察肉鴨生長性能及腸道形態(tài)、消化酶活性及抗氧化能力來評估植物精油共晶的作用效果,并通過線性和二次回歸分析確定其在肉鴨飼糧中的適宜添加量,為肉鴨飼糧中抗生素替代品的篩選提供理論和技術(shù)支撐。
植物精油共晶為百里香酚和香芹酚1∶1的結(jié)晶,產(chǎn)品有效含量為50%,由上海某藥物所提供。
采用單因素試驗(yàn)設(shè)計,選擇480只1日齡櫻桃谷肉鴨,隨機(jī)分為5組,植物精油共晶添加量分別為0(對照)、15、30、60和120 mg/kg,每組6個重復(fù),每個重復(fù)16只。試驗(yàn)期35 d,分為前期(1~14日齡)和后期(15~35日齡)2個階段。試驗(yàn)期間自由采食和飲水。
基礎(chǔ)飼糧參照《肉鴨飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 2122—2012)配制。基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型飼糧,其組成及營養(yǎng)水平見表1。飼糧采用顆粒料,前期顆粒大小為2 mm,后期為3.5 mm。按正常免疫程序進(jìn)行免疫接種,在相同溫度環(huán)境中進(jìn)行籠養(yǎng)。1~3日齡30~32 ℃,4~7日齡28~30 ℃,以后每周降低2 ℃,直到24 ℃,并維持在24 ℃,其他管理按照常規(guī)進(jìn)行。1~14日齡飼養(yǎng)階段相對濕度維持在60%~70%,以后逐漸下降,15日齡以后維持在55%左右。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))
續(xù)表1項目Items含量 Content1~14日齡 1 to 14 days of age15~35日齡 15 to 35 days of age礦物質(zhì)預(yù)混料 Mineral premix1)0.500.50統(tǒng)糠 Unite bran0.052.79合計 Total100.00100.00營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)代謝能 ME/(MJ/kg)11.9212.13粗蛋白質(zhì) CP19.5016.50鈣 Ca0.800.80非植酸磷 NPP0.400.40可消化賴氨酸 DLys1.100.85可消化蛋氨酸 DMet0.450.40可消化蘇氨酸 DThr0.780.68可消化色氨酸 DTry0.220.20
1.4.1 樣品采集
在14和35日齡時,稱重后以重復(fù)為單位隨機(jī)選取接近均重的肉鴨1只(n=6)。計重后通過頸部放血屠宰,分離腸段,取空腸中點(diǎn)(約2 cm長),用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,并將其放入10%甲醇中固定,后用于測量空腸組織形態(tài);屠宰分離腸段后即刻擠出剩余空腸中的全部內(nèi)容物,迅速均勻攪拌后收集的樣品即時置于-20 ℃冰箱中凍存,用于后續(xù)分析;分離回腸,剖開腸段,用生理鹽水將內(nèi)容物清洗干凈,平鋪于濾紙上,用載玻片快速刮取其黏膜,并裝入2 mL凍存管中,于液氮速凍,-80 ℃保存?zhèn)溆茫糜跈z測抗氧化能力;分離盲腸,收集盲腸食糜,-80 ℃保存?zhèn)溆茫糜跈z測盲腸微生物含量。
1.4.2 指標(biāo)測定
生長性能:記錄肉鴨1日齡的體重。在肉鴨14和35日齡時,以重復(fù)為單位記錄肉鴨體重。肉鴨在稱重前,斷料8 h,結(jié)算余料。計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)。每天觀察并記錄死亡鴨的只數(shù)和體重,計算死亡率,并用死亡率校正F/G。計算公式如下:
F/G=總增重/總采食量;
ADFI=ADG×F/G;
死亡率(%)=(死亡鴨只數(shù)/
試驗(yàn)開始時總鴨只數(shù))×100。
空腸組織形態(tài):將4%多聚甲醛固定的空腸腸段中部進(jìn)行石蠟包埋切片后,蘇木素-伊紅(HE)染色封片,使用生物光學(xué)顯微鏡并結(jié)合Image-Pro Plus(IPP)圖像分析軟件進(jìn)行觀察、測量和取圖。每個腸道選取6張切片測量絨毛高度(VH)和隱窩深度(CD),并計算絨隱比(V/C)。
空腸消化酶活性:準(zhǔn)確稱取空腸食糜重量,按重量(g)∶體積(mL)=1∶10比例加入預(yù)冷生理鹽水,高速研磨儀處理,2 500 r/min離心10 min,取上清再用生理鹽水稀釋分裝,根據(jù)試劑盒說明書方法檢測脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶活性,試劑盒購自南京建成生物工程研究所。
回腸黏膜抗氧化能力:回腸黏膜中總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、髓過氧化物酶(MPO)活性和還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量按試劑盒說明書方法檢測,試劑盒購自南京建成生物工程研究所。
盲腸菌群:使用糞便基因組DNA提取試劑盒提取凍存于-80 ℃盲腸食糜微生物的總DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆?。用Nano Drop ND-2000分光光度計檢測DNA的完整性、濃度和純度。根據(jù)細(xì)菌的16S rRNA基因序列設(shè)計沙門氏菌和大腸桿菌的特異性引物及探針,如表2所示。參照本實(shí)驗(yàn)室前期研究[22],使用Bio-Rad公司CFX96實(shí)時定量PCR儀,測定鴨盲腸食糜中大腸桿菌、沙門氏菌和總菌的含量,并用連續(xù)標(biāo)準(zhǔn)模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,以每克內(nèi)容物為檢測單位,通過Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出每份樣品所含拷貝數(shù)。試劑盒購自北京天根生物技術(shù)研究所。
表2 引物及探針序列
試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SAS 9.2統(tǒng)計軟件的one-way ANOVA程序進(jìn)行方差分析,差異顯著時使用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,試驗(yàn)結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示,以P<0.05表示差異顯著。
如表3所示,與對照組相比,飼糧中添加植物精油共晶對肉鴨體重、ADG、ADFI、F/G均無顯著影響(P>0.05),但植物精油共晶線性降低了肉鴨1~14日齡和1~35日齡的死亡率(P<0.05)。
如表4所示,不同添加量的植物精油共晶對肉鴨14日齡的空腸腸道形態(tài)(絨毛高度、隱窩深度、絨隱比)均有顯著影響(P<0.05),與對照組相比,添加60、120 mg/kg的植物精油共晶顯著提高了14日齡肉鴨空腸絨毛高度(P<0.05),不同添加量植物精油共晶顯著提高了14日齡肉鴨空腸隱窩深度(P<0.05),同時還顯著降低了空腸絨隱比(P<0.05),并且隨著植物精油添加量的提高,14日齡肉鴨的腸道形態(tài)有顯著線性和二次曲線變化(P<0.05);35日齡時,與對照組相比,飼糧中添加15、60、120 mg/kg的植物精油共晶顯著降低了肉鴨空腸絨毛高度(P<0.05),不同添加量的植物精油共晶均顯著降低了肉鴨空腸隱窩深度(P<0.05),且隨著植物精油添加量的提高,絨毛高度和隱窩深度有顯著線性和二次曲線變化(P<0.05),飼糧添加30、60 mg/kg的植物精油共晶顯著提高了肉鴨空腸的絨隱比(P<0.05)。
如表5所示,與對照組相比,飼糧中添加120 mg/kg的植物精油共晶顯著提高了肉鴨空腸食糜淀粉酶活性(P<0.05),且空腸食糜消化酶(胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶)活性均隨植物精油共晶添加量的增加呈線性增加(P<0.05),其中空腸食糜脂肪酶和淀粉酶活性有顯著二次曲線變化(P<0.05)。
如表6所示,與對照組相比,在飼糧中添加60和120 mg/kg的植物精油共晶顯著增加了回腸黏膜中MDA含量(P<0.05),并隨著植物精油共晶添加量的增加呈線性和二次曲線變化(P<0.05)。與對照組相比,添加30和120 mg/kg植物精油共晶組回腸黏膜MPO含量顯著升高(P<0.05),隨著植物精油添加量的提高,回腸黏膜MPO活性有顯著線性和二次曲線變化(P<0.05)。同時,隨植物精油共晶添加量的增加回腸黏膜SOD活性呈線性和二次曲線變化(P<0.05)。
表3 植物精油共晶對肉鴨生長性能的影響
表4 植物精油共晶對肉鴨腸道形態(tài)的影響
表5 植物精油共晶對35日齡肉鴨空腸食糜消化酶活性的影響
表6 植物精油共晶對35日齡肉鴨回腸黏膜抗氧化能力的影響
如表7所示,與對照組相比,不同添加量的植物精油共晶對35日齡肉鴨的盲腸食糜微生物總菌、沙門氏菌和大腸桿菌的含量有顯著影響(P>0.05)。
表7 植物精油共晶對肉鴨盲腸食糜中微生物含量的影響
本試驗(yàn)結(jié)果表明,飼糧中添加植物精油共晶對肉鴨生長性能沒有顯著影響。Park等[23]在肉鴨上發(fā)現(xiàn),在肉鴨飼糧中添加不同劑量的牛至干粉,生長性能均沒有表現(xiàn)出顯著差異;Abouelezz等[24]以櫻桃谷肉鴨為研究對象,在飼糧中分別添加50、100 mg/kg有效成分為百里酚和香芹酚的牛至精油和150、300 mg/kg有效成分為肉桂醛和百里酚的精油,肉鴨生長性能未發(fā)現(xiàn)顯著差異,本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果相似。但也有研究表明,在飼糧中添加精油可以一定程度上改善家禽生長性能,如Ruan等[25]研究發(fā)現(xiàn),在飼糧中添加150、300 mg/kg牛至精油,能顯著提高黃羽肉雞30日齡的體重、ADFI和ADG;Youssef等[26]研究發(fā)現(xiàn),在肉雞生長階段,即22~42日齡,在飼糧中添加25.0 mg/kg的八角、迷迭香、百里香牛至精油混合物,可顯著提高體增重;張曉燕等[27]研究結(jié)果表明,混合型EO顯著提高了廣西靈山土雞67日齡的體重、37~67日齡的ADG和ADFI。以上研究結(jié)果存在較大差異的原因可能是因?yàn)榫头N類繁多、成分復(fù)雜、添加劑量不同以及試驗(yàn)動物的品種、年齡等存在較大差異所致。此外,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),肉鴨前期和全期死亡率隨植物精油共晶添加量的增加而線性降低,但關(guān)于精油添加對家禽死亡率的研究報道較少,可能與植物精油共晶能提高肉鴨機(jī)體抗氧化或免疫功能有關(guān),但其機(jī)理值得進(jìn)一步研究解析。
在適當(dāng)范圍內(nèi),腸絨毛越高,表明腸道對各類養(yǎng)分的消化吸收能力越強(qiáng),而隱窩深度越淺,表明腸上皮組織分泌消化液的能力越強(qiáng),但也表示隱窩組織更新能力減慢;絨隱比與腸道的消化吸收功能呈正比例關(guān)系[28-29]。本試驗(yàn)中,添加60 mg/kg植物精油共晶組14日齡肉鴨絨毛更長,隱窩更深,隱窩組織更新速度更快,表明植物精油共晶能促進(jìn)肉鴨生長前期腸道的發(fā)育;而35日齡時,肉鴨腸道發(fā)育基本穩(wěn)定,這時植物精油共晶的添加降低了隱窩深度,且添加30 mg/kg植物精油共晶組35日齡肉鴨絨毛高度較其他植物精油共晶添加量組高,隱窩深度較對照組淺,絨隱比最高;添加120 mg/kg植物精油共晶組35日齡肉鴨空腸隱窩深度最低,表明添加一定劑量的植物精油共晶對腸道的消化吸收有益。徐靜等[30]發(fā)現(xiàn),在蛋雞飲水中添加0.06 mL/L的大蒜精油能夠明顯改善蛋雞十二指腸、空腸和回腸的組織形態(tài),從而提高飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用效率;江小帆等[28]研究發(fā)現(xiàn),在蘆花雞飼糧中添加有效成分為1.13%牛至油的精油可顯著改善回腸和空腸隱窩深度,以及十二指腸絨毛高度;與對照組相比,50、100 mg/kg牛至精油組回腸隱窩深度和空腸隱窩深度分別降低;150 mg/kg牛至精油組十二指腸絨毛高度增加14%,空腸隱窩深度和十二指腸絨毛高度與牛至精油的添加量存在線性和二次曲線關(guān)系。以上研究結(jié)果提示,精油的添加可以改善家禽腸道形態(tài),提高腸道對飼糧養(yǎng)分的消化吸收能力,從而提高生長性能。雖然本研究中的腸道形態(tài)有所改善,但未發(fā)揮促生長作用,這可能與植物精油共晶影響了肉鴨腸道消化酶活性和機(jī)體抗氧化能力有關(guān)。
消化酶是具有特殊功能的蛋白質(zhì),對底物具有專一性,消化酶的作用主要是取決于酶的活性[31],胃腸道消化吸收能力依賴消化酶,消化酶活性增強(qiáng)有助于提高胃腸道消化吸收能力。聞愛友等[32]在肉雞飼糧中分別添加100、200、300 mg/kg柑橘、洋蔥、大蒜、薄荷、藏茴香等多種植物中提取的精油復(fù)合物發(fā)現(xiàn),21日齡時,100、200、300 mg/kg組肉雞胰蛋白酶和淀粉酶活性均隨添加劑量的增加呈逐漸增加的趨勢,且均顯著高于對照組;42日齡時,200、300 mg/kg組胰蛋白酶、淀粉酶活性均顯著提高;100 mg/kg組淀粉酶活性高于對照組。李紅英等[33]以山麻鴨為研究對象,評估了有效成分為百里香酚和肉桂醛的EO添加劑量(50、150、200 mg/kg)的作用效果,發(fā)現(xiàn)飼糧中添加精油,顯著提高了山麻鴨胰腺胰蛋白酶活性,且脂肪酶活性有提高趨勢,飼糧中添加150和200 mg/kg EO顯著提高山麻鴨空腸糜蛋白酶活性。Alagawany等[34]在日本鵪鶉上的研究發(fā)現(xiàn),檸檬草精油添加組腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性顯著提高;但隨著檸檬草精油添加量的增加,消化酶活性呈二次曲線變化。在本研究中,植物精油共晶線性增加了肉鴨35日齡空腸食糜脂肪酶和淀粉酶的活性,表明添加植物精油共晶對肉鴨腸道的消化功能有促進(jìn)作用。
EO含有抗氧化活性成分,具有直接或間接的抗氧化活性[35]。EO發(fā)揮抗氧化活性主要是依靠其含量豐富的酚類成分,作用途徑主要包括清除自由基、與金屬離子螯合、抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化和調(diào)節(jié)抗氧化酶等[36]??寡趸富钚缘淖兓从沉藙游餀C(jī)體抗氧化能力的改變。但本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨植物精油共晶添加量的增加,肉鴨回腸黏膜中SOD活性線性降低,而MDA含量和MPO活性線性增加。MDA含量和MPO活性反映了機(jī)體氧化損傷的程度[37-38],MDA的產(chǎn)生能加劇膜的損傷,而MPO主要存在于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中,是白細(xì)胞分泌的一種酶,催化形成多種活性氧化劑[39],說明本試驗(yàn)中肉鴨機(jī)體的氧化反應(yīng)增強(qiáng),抗氧化能力下降,這與之前研究結(jié)果不一致。Zhang等[40]在肉雞飼糧中分別添加200 mg/kg天然牛至精油和人工合成牛至精油,兩者有效百里酚和香芹酚含量及制備工藝相同,對21和42日齡的血清和腸道黏膜中的抗氧化酶活性都有一定的提高,會導(dǎo)致血清、十二指腸和空腸谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和SOD活性以及血清和十二指腸T-AOC和谷胱甘肽還原酶(GR)活性的增加,MDA含量減少。Ruan等[25]以黃羽肉雞為研究對象,在其飼糧中分別添加150和300 mg/kg的牛至精油發(fā)現(xiàn),150 mg/kg牛至精油顯著提高了空腸和回腸中的T-AOC和空腸中的T-SOD活性及回腸GSH-Px活性;300 mg/kg牛至精油顯著增加了空腸GSH-Px活性。馬偉斌等[41]研究發(fā)現(xiàn),在肉仔雞飼糧中添加200和300 mg/kg的有效成分為肉桂醛、百里香酚和香芹酚的EO,均可顯著提高血清中T-AOC和SOD活性,且精油的添加使血清中的MDA含量降低和GSH-Px活性升高。本試驗(yàn)結(jié)果與以上研究結(jié)果不一致的原因可能在于植物精油共晶具有較強(qiáng)的氧化還原活性,導(dǎo)致肉鴨回腸黏膜發(fā)生劇烈的氧化反應(yīng),但肉鴨死亡率有降低,生長性能也未受影響,其具體的原因有待進(jìn)一步研究。
腸道菌群可以反映腸道的健康狀況,大腸桿菌對維持動物體腸道微環(huán)境及健康很重要,大幅增加會變成致病菌,沙門氏菌是腸道微生物區(qū)系的致病菌[42]。目前,在消殺有害菌的研究中,EO表現(xiàn)出了優(yōu)良的抑制功能。王改琴等[43]通過體外試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),香芹酚、肉桂醛、百里香酚和丁香酚具有較好地抑制大腸桿菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌的效果。腸道菌群的類型和數(shù)量在體內(nèi)是始終處于動態(tài)變化的,飲食是影響腸道菌群組成和活性最重要的因素之一,精油的選擇性抗菌會調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡,改變腸道菌群多樣性和相對豐度[44]。張艷雯等[45]研究發(fā)現(xiàn),在高營養(yǎng)和低營養(yǎng)這2個營養(yǎng)水平飼糧中分別添加0和0.2%的精油對肉雞盲腸微生物總量、乳酸桿菌和大腸桿菌含量均無顯著影響。Cetin等[46]研究表明,在飼糧中添加400 mg/kg的精油混合物(主要成分為牛至、迷迭香、茴香精油混合物)能夠顯著提高肉雞腸道乳酸菌豐度,且降低了大腸桿菌豐度,100 mg/kg牛至精油和迷迭香精油組,大腸桿菌豐度顯著降低。Castaeda-Correa等[47]研究表明,百里香酚能夠調(diào)節(jié)瘤胃微生物的活動,增加有益菌數(shù)量,減少甲烷產(chǎn)量,提高飼料利用率。EO能通過促進(jìn)腸道有益菌生長,抑制有害菌生長,改善腸道菌群平衡,從而保證其消化吸收能力的發(fā)揮。但本研究發(fā)現(xiàn),在飼糧中添加植物精油共晶對肉鴨盲腸食糜中的總菌、大腸桿菌和沙門氏菌的含量均無顯著影響,表明該植物精油共晶在抑菌能力方面并未表現(xiàn)出優(yōu)勢。
在本試驗(yàn)條件下,植物精油共晶作用效果具有劑量依賴性,且不同生物學(xué)標(biāo)識對劑量反應(yīng)的效果不一致,需以不同生物學(xué)標(biāo)識推薦適宜添加量。以生長性能、空腸腸道形態(tài)和回腸黏膜抗氧化能力為標(biāo)識,建議肉鴨生長前期(1~14日齡)飼糧添加60 mg/kg植物精油共晶,后期(15~35日齡)飼糧添加30 mg/kg植物精油共晶。以肉鴨死亡率和空腸消化酶活性為標(biāo)識,推薦肉鴨飼糧添加120 mg/kg植物精油共晶。