飼糧中添加反式茴香腦對肉雞體內(nèi)外抗氧化能力的影響

齊 茜 于彩云 齊麗娜 張 鑫 張莉莉 王 恬

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京 210095)

在自然界中存在順式和反式2種茴香腦(anethole)異構(gòu)體，2種異構(gòu)體的活性和香氣不同，順式茴香腦(cis-anethole)具有高毒性以及酸味、辛辣味、樟腦味等刺激性氣味，在生產(chǎn)中常被當(dāng)作廢料棄去。反式茴香腦(trans-anethole, AN)又稱茴香烯，屬苯丙素類化合物(化學(xué)式C10H12O, 圖1)，無毒且具有香甜的特殊氣味，可從大茴香(AN含量為75.2%～96.1%)、小茴香(AN含量為58.1%～92.5%)、八角(AN含量為71.2%～91.8%)等植物精油中提取[1]。

圖1 AN的化學(xué)結(jié)構(gòu)

AN具有多種生物學(xué)活性，被廣泛用于食品和制藥行業(yè)。據(jù)研究報道，AN對炎癥相關(guān)的癌癥、糖尿病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等慢性疾病都有療效，而這些療效與其抗氧化活性、抑制脂質(zhì)過氧化和清除自由基的功能有關(guān)[2-4]。AN的抗氧化活性在體內(nèi)外試驗中已被證實(shí)。硫代巴比妥酸反應(yīng)物比色法證明以AN為主要成分的小茴香精油顯示出了良好的抗氧化活性，可減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的氫過氧化物和次級氧化產(chǎn)物，具有一定的抗氧化能力[5]。Luís等[6]采用1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)自由基清除試驗評估八角精油的抗氧化活性，試驗結(jié)果證實(shí)八角精油具有很強(qiáng)的抗氧化活性[半抑制濃度(IC50)=3.46%]，并推測八角精油的抗氧化活性與包括AN在內(nèi)的高苯丙素含量(92.2%)有關(guān)。余煒等[7]在對八角茴香油抗氧化能力的研究中發(fā)現(xiàn)，八角茴香油發(fā)揮抗氧化作用可能與其中的主要活性成分AN和茴香醛有關(guān)，AN和茴香醛可通過清除油脂氧化過程中產(chǎn)生的自由基緩減機(jī)體的氧化損傷。AN及其衍生物茴香硫醚已被證明能增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化代謝產(chǎn)物谷胱甘肽和谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶的活性，通過提高機(jī)體清除羥自由基的能力抑制脂質(zhì)過氧化、提高機(jī)體抗氧化能力[8-11]。然而，茴香精油的成分復(fù)雜，除苯丙素類的AN外，萜類、黃酮和酚類等成分都具有抗氧化活性，目前有關(guān)AN純品的抗氧化能力的研究鮮有報道。因此，本試驗旨在通過AN純品在肉雞體內(nèi)外抗氧化能力的比較，以期為AN作為抗氧化劑在飼糧中的科學(xué)應(yīng)用提供依據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

AN(純度>98%)購于南京某醫(yī)藥科技有限公司；DPPH、2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、三吡啶基三嗪(TPTZ)和二丁基羥基甲苯(BHT)(純度>99%)購于上海某生物科技有限公司；無水乙醇等其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購于上海某化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 AN的體外抗氧化能力

1.2.1 DPPH自由基清除率

參考文獻(xiàn)[12]的方法，測定DPPH自由基的清除率。用無水乙醇作為溶劑配制0.04 mg/mL DPPH溶液，在96孔板中加入不同濃度(5、10、15、20、25、30 mg/mL)以無水乙醇為溶劑配制的樣品溶液100 μL，DPPH溶液100 μL，室溫避光反應(yīng)60 min，于517 nm波長處測量各孔吸光度值(A1)。無水乙醇替代DPPH作為樣本空白(A2)，無水乙醇替代樣品作為試劑空白(A3)，其他條件不變。每個濃度組平行測量3次。以BHT為陽性對照。按照以下公式計算DPPH自由基清除率：

1.2.2 ABTS自由基清除率

參考文獻(xiàn)[13]的方法，測定ABTS自由基清除率。配制7.4 mmol/L ABTS水溶液、2.45 mmol/L K2S2O8水溶液，以上2種溶液1∶1混合后室溫避光12～16 h配制成ABTS原液，在使用前用無水乙醇對ABTS原液進(jìn)行稀釋，使其吸光度值為0.70±0.05。在96孔板中加入不同濃度(0.91、1.81、2.72、3.63、4.54、5.45 mg/mL)以無水乙醇為溶劑配制的樣品溶液20 μL，ABTS稀釋液200 μL，室溫避光反應(yīng)30 min，于734 nm波長處測量各孔吸光度值(A1)。無水乙醇替代ABTS作為樣本空白(A2)，無水乙醇替代樣品作為試劑空白(A3)，其他條件不變。每個濃度組平行測量3次。以BHT為陽性對照。按照以下公式計算ABTS自由基的清除率：

1.2.3 羥自由基清除率

參考文獻(xiàn)[14]的方法，測定羥自由基清除率。配制9 mmol/L乙醇水楊酸溶液，9 mmol/L FeSO4溶液，8.8 mmol/L過氧化氫溶液。在96孔板中加入不同濃度(5.5、11.0、16.5、22.0、27.5、33.0 mg/mL)以無水乙醇為溶劑配制的樣品溶液110 μL，F(xiàn)eSO4溶液30 μL，乙醇水楊酸溶液30 μL，最后加入30 μL過氧化氫溶液啟動反應(yīng)，37 ℃避光反應(yīng)30 min，于510 nm波長處測量各孔吸光度值(A1)。無水乙醇替代過氧化氫作為樣本空白(A2)，無水乙醇替代樣品作為試劑空白(A3)，其他條件不變。每個濃度組平行測量3次。以BHT為陽性對照。按照以下公式計算羥自由基的清除率：

1.2.4 鐵離子還原能力(FRAP)

參考文獻(xiàn)[15]的方法，測定鐵離子還原能力。配制40 mmol/L鹽酸水溶液，20 mmol/L FeCl3水溶液，0.3 mol/L醋酸鹽溶液。以40 mmol/L鹽酸水溶液為溶劑配制10 mmol/L TPTZ水溶液。在使用開始前將0.3 mol/L醋酸鹽溶液、10 mmol/L TPTZ水溶液和20 mmol/L FeCl3水溶液按照體積比10∶1∶1均勻混合配制成FRAP應(yīng)用液，并于37 ℃水浴30 min。在96孔板中加入不同濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL)以無水乙醇為溶劑配制的樣品溶液10 μL，預(yù)熱的FRAP應(yīng)用液180 μL，37 ℃避光反應(yīng)5 min，于593 nm波長處測量各孔吸光度值。以不同濃度的FeSO4制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以樣品抗氧化活性達(dá)到同樣的吸光度值為1個FRAP的值。以BHT為陽性對照，每個濃度組平行測量3次。

1.3 AN的體內(nèi)抗氧化能力

1.3.1 試驗動物與分組

試驗選取同批孵化、初始體重相近的健康1日齡愛拔益加(AA)肉雞256只(購于山東峰祥畜牧種業(yè)科技有限公司)，采用單因素完全隨機(jī)試驗設(shè)計，將雞群分為4個組，每組8個重復(fù)，每個重復(fù)8只雞。試驗期間，在4組肉雞基礎(chǔ)飼糧中分別添加水平為0、200、400和600 mg/kg的AN(分別為AN 0、AN 200、AN 400和AN 600組)。試驗期分為2個生長階段，分別為生長前期(1～21日齡)和生長后期(22～42日齡)，共計42 d，全期自由采食、飲水，按常規(guī)免疫程序免疫?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平參照《肉雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項目 Items含量 Content1～21日齡 1 to 21 days of age22～42日齡 22 to 42 days of age賴氨酸 Lys1.451.40蛋氨酸 Met0.540.50蘇氨酸 Thr0.910.80

1.3.2 樣品采集

于肉雞21和42日齡，每組隨機(jī)選取8只肉雞，每個重復(fù)1只。通過頸靜脈采血，室溫放置2 h后，在高速冷凍離心機(jī)4 ℃、3 000 r/min條件下離心15 min，然后收集上層血清保存于-20 ℃待測。肉雞放血致死后，解剖分離出肝臟和胸肌組織，用提前準(zhǔn)備好的生理鹽水沖洗干凈，在肝臟相同位置切取部分樣品放于2 mL的凍存管中保存于-80 ℃，在左側(cè)胸肌相同位置取適量樣品保存于-80 ℃，用于抗氧化酶活性和基因相對表達(dá)量的分析。

1.3.3 生長性能的測定

于肉雞20和41日齡當(dāng)天21:00分別停飼12 h后，于次日09:00以重復(fù)為單位稱量各組試驗雞活重、剩余料重，并以重復(fù)為單位計算各組試驗雞的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.3.4 血清抗氧化能力的測定

血清中各項指標(biāo)分別采用比色法測定谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，鉬酸銨法測定過氧化氫酶(CAT)活性，ABTS法測定總抗氧化能力(T-AOC)，羥胺法測定超氧化物歧化酶(T-SOD)活性，硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量。所有試劑盒購于南京建成生物工程研究所，嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行試驗操作。

1.3.5 肝臟和胸肌抗氧化能力的測定

稱取0.4 g肝臟或胸肌組織于5 mL無酶離心管，按照1∶9(重量/體積)的比例加入預(yù)冷的0.9%生理鹽水，加入鎬珠后置振動研磨儀上勻漿，將勻漿液在4 ℃、4 000 r/min條件下離心10 min，吸取上清液用于測定各項指標(biāo)。測定指標(biāo)與試劑盒同1.3.4。

1.3.6 肝臟和胸肌抗氧化相關(guān)基因表達(dá)量的測定

按照Trizol(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)說明書提取21、42日齡肝臟、42日齡胸肌中總RNA，紫外微量分光光度計檢測濃度后將總RNA稀釋至統(tǒng)一濃度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參，對肝臟、胸肌的過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、血紅素加氧酶-1(HO-1)、核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)和谷胱甘肽過氧化物酶1(GPx1)的基因相對表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR測定，引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列見表2。使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)在QuantStudioTM7 Flex實(shí)時熒光定量PCR 儀(賽默飛世爾科技公司,美國)上進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)總體系為 20 μL，包含：10 μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物、0.4 μL的ROX Reference Dye、2 μL互補(bǔ)DNA模板、6.8 μL無菌無酶水。反應(yīng)程序如下：95 ℃持續(xù)30 s，95 ℃持續(xù)10 s，60 ℃持續(xù)30 s，共40個循環(huán)，95 ℃持續(xù)15 s，60 ℃持續(xù)60 s，95 ℃持續(xù)15 s。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。

表2 實(shí)時熒光定量PCR所用引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，通過Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較，采用正交多項式法對不同濃度AN的添加效果進(jìn)行線性(linear)和二次曲線(quadratic)回歸分析。結(jié)果以平均值、均值標(biāo)準(zhǔn)誤和P值表示。采用Graphpad Prism 8.0計算體外IC50值，并繪圖。P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示有差異趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 AN的體外抗氧化能力

2.1.1 DPPH自由基的清除率

由圖2可知，隨著AN濃度的增加，對DPPH自由基的清除效果隨之增強(qiáng)，當(dāng)AN濃度為30 mg/kg時，清除率達(dá)到59.57%，而陽性對照BHT在不同的濃度水平下清除率均大于95%，AN對DPPH的清除效果弱于陽性對照BHT。通過計算得到AN對DPPH自由基清除的IC50值為16.26 mg/mL。

2.1.2 ABTS自由基的清除率

由圖3可知，AN對ABTS的清除效果與添加濃度呈正相關(guān)，即隨著AN濃度的增加，ABTS的清除率也相應(yīng)提高。當(dāng)濃度達(dá)到5.45 mg/mL時，清除率為43.67%；但是在不同的濃度水平下，陽性對照BHT對ABTS自由基的清除率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于AN且不同濃度陽性對照組的ABTS清除率均無限接近100%。通過計算得到AN對ABTS自由基的IC50值為6.98 mg/mL。

圖2 AN對DPPH自由基的清除率

圖3 AN對ABTS自由基的清除率

2.1.3 羥自由基的清除率

由圖4可知，在測定濃度范圍內(nèi)，AN對羥自由基的清除效果與添加濃度呈正相關(guān)，但增加幅度較小。且在不同濃度下AN對羥自由基的清除率均優(yōu)于陽性對照BHT。當(dāng)AN濃度為33.0 mg/mL時，對羥自由基的清除率為61.87%。通過計算得到AN對羥自由基的IC50值為7.82 mg/mL。

圖4 AN對羥自由基的清除率

2.1.4 FRAP

以吸光度值為縱坐標(biāo)，不同濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得到線性回歸方程為y=0.743x+0.101 4，R2=0.999 4，如圖5所示。根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算不同濃度樣品的FRAP值，結(jié)果如圖6所示，AN的FRAP值增加幅度平緩，當(dāng)AN濃度達(dá)到3 mg/mL時FRAP值為0.38 mmol/L FeSO4/mL。而陽性對照BHT在不同濃度下的FRAP值均遠(yuǎn)大于AN。

圖5 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 AN的還原力

2.2 AN的體內(nèi)抗氧化能力

2.2.1 AN對AA肉雞生長性能的影響

由表3可知，與AN 0組相比，飼糧中添加AN對1～21日齡和22～42日齡AA肉雞ADG和F/G沒有顯著影響(P>0.05)，但AN 400組22～42日齡ADFI顯著提高(P<0.05)，且隨著AN添加水平的提高，AFDI呈顯著二次曲線變化(P<0.05)；AN 200組生長全期的ADFI顯著提高(P<0.05)。

2.2.2 AN對AA肉雞血清抗氧化酶活性的影響

由表4可知，21日齡時，與AN 0組相比，飼糧中添加AN對血清中GSH-Px活性和T-AOC無顯著影響(P>0.05)，但AN 200、AN 400和AN 600組血清T-SOD活性均顯著高于AN 0組(P<0.05)，AN 400和AN 600組血清MDA含量顯著低于AN 0組(P<0.05)，且隨著AN添加水平的提高，血清T-SOD活性呈顯著線性或二次曲線變化(P<0.05)，MDA含量呈顯著線性下降(P<0.05)。方差分析結(jié)果表明，飼糧中添加AN對血清CAT活性無顯著影響(P>0.05)，但趨勢分析顯示，隨著AN添加水平的提高，血清CAT活性呈先升高后降低的二次曲線變化趨勢(P=0.089)。42日齡時，與AN 0組相比，飼糧中添加AN對血清GSH-Px、CAT、T-SOD活性和MDA含量無顯著影響(P>0.05)，但AN 400和AN 600組血清T-AOC顯著高于AN 0組(P<0.05)，且隨著AN添加水平的提高，血清T-AOC呈顯著線性升高(P<0.05)。

2.2.3 AN對AA肉雞肝臟抗氧化酶活性的影響

由表5可知，21日齡時，AN 600組肝臟CAT活性顯著高于AN 0組(P<0.05)，AN 200和AN 400組肝臟T-SOD活性顯著高于AN 0組(P<0.05)，且隨著AN添加水平的提高，肝臟CAT活性呈顯著線性或二次曲線升高(P<0.05)，肝臟T-SOD的活性呈先升高后降低的顯著二次曲線變化(P<0.05)。方差分析結(jié)果表明，飼糧中添加AN雖然對肝臟GSH-Px活性、T-AOC和MDA含量均無顯著影響(P>0.05)，但趨勢分析顯示，隨著AN添加水平的提高，肝臟GSH-Px活性呈先升高后降低的二次曲線變化趨勢(P=0.053)，肝臟T-AOC呈顯著線性升高(P=0.049)，肝臟MDA含量呈線性下降趨勢(P=0.092)，且呈現(xiàn)出顯著二次曲線變化趨勢(P=0.027)。42日齡時，與AN 0組相比，飼糧中添加AN對肝臟T-AOC、MDA含量、GSH-Px和T-SOD活性無顯著影響(P>0.05)，但AN 200和AN 400組肝臟CAT活性顯著高于AN 0組(P<0.05)，且隨著AN添加水平的提高，肝臟CAT活性呈先升高后降低的顯著二次曲線變化(P<0.05)。

表3 AN對AA肉雞生長性能的影響

表4 AN對AA肉雞血清抗氧化能力的影響

2.2.4 AN對42日齡AA肉雞胸肌抗氧化酶活性的影響

由表6可知，與AN 0組相比，飼糧中添加AN對胸肌MDA含量與CAT和T-SOD活性無顯著影響(P>0.05)，但AN 200組胸肌GSH-Px活性、T-AOC顯著高于AN 0組(P<0.05)，且隨著AN添加水平的提高，胸肌GSH-Px活性呈先升高后降低的顯著二次曲線變化(P<0.05)。

表6 AN對42日齡AA肉雞胸肌抗氧化能力的影響

續(xù)表6項目 Items組別 GroupsAN 0AN 200AN 400AN 600SEMP值 P-value方差分析ANOVA線性Linear二次Quadratic總抗氧化能力 T-AOC/(U/mg prot)0.10bc0.13a0.09c0.12ab0.010.0040.7810.642總超氧化物歧化酶 T-SOD/(U/mg prot)23.5323.2623.0022.680.540.9560.5800.979丙二醛 MDA/(nmol/mg prot)0.310.280.270.250.350.9940.5680.865

2.2.5 AN對AA肉雞肝臟抗氧化相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由圖7和圖8可知，21日齡時，AN 200、AN 400和AN 600組肝臟CAT的基因相對表達(dá)量顯著高于AN 0組(P<0.05)，AN 400和AN 600組肝臟SOD1的基因相對表達(dá)量顯著高于AN 0組(P<0.05)，AN 600組肝臟HO-1的基因相對表達(dá)量顯著高于AN 0組(P<0.05)，且隨著AN添加水平的提高，肝臟CAT、SOD1和HO-1的基因相對表達(dá)量呈顯著線性升高(P<0.05)。方差分析結(jié)果表明，飼糧中添加AN對肝臟Nrf2和GPx1的基因相對表達(dá)量均無顯著影響(P>0.05)，但趨勢分析顯示，隨著AN添加水平的提高，肝臟Nrf2的基因相對表達(dá)量呈先升高后降低的顯著二次曲線變化(P=0.038)，肝臟GPx1的基因相對表達(dá)量呈顯著線性升高(P<0.001)。42日齡時，方差分析結(jié)果表明，飼糧中添加AN對肝臟CAT、SOD1、HO-1、Nrf2和GPx1的基因相對表達(dá)量均無顯著影響(P>0.05)。

CAT：過氧化氫酶 catalase；SOD1：超氧化物歧化酶1 superoxide dismutase 1；HO-1：血紅素加氧酶-1 heme oxygenase-1；Nrf2：核因子E2相關(guān)因子2 nuclear factor erythroid derived 2 like 2；GPx1：谷胱甘肽過氧化物酶1 glutathione peroxidase 1。數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05)。下圖同 the same as below。

2.2.6 AN對42日齡AA肉雞胸肌抗氧化相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由圖9可知，AN 200組胸肌GPx1的基因相對表達(dá)量顯著高于AN 0組(P<0.05)，且隨著AN添加水平的提高，胸肌GPx1的基因相對表達(dá)量呈先升高后降低的顯著二次曲線變化(P<0.05)。方差分析表明，飼糧中添加AN對胸肌CAT、SOD1、HO-1和Nfr2的基因相對表達(dá)量均無顯著影響(P>0.05)，但趨勢分析顯示，隨著AN添加水平的提高，胸肌SOD1的基因相對表達(dá)量呈先升高后降低的顯著二次曲線變化(P=0.079)。

圖8 AN對42日齡AA肉雞肝臟抗氧化相關(guān)基因表達(dá)量的影響

圖9 AN對42日齡AA肉雞胸肌抗氧化相關(guān)基因表達(dá)量的影響

3 討 論

3.1 AN的體外抗氧化能力

生物體內(nèi)過量的自由基會氧化脂質(zhì)以及蛋白質(zhì)等分子，導(dǎo)致氧化損傷[16]。在飼糧中添加抗氧化劑可以保持機(jī)體自身氧化還原狀態(tài)的穩(wěn)定與平衡，Singh等[17]在AN含量為90.10%的洋茴香精油清除自由基試驗中發(fā)現(xiàn)，該茴香精油對DPPH、ABTS的清除效果顯著。與該結(jié)果相似，在Anwar等[18]的研究中，小茴香精油(AN含量為69.87%)對DPPH自由基具有良好的清除效果，IC50值為32.32 μg/mL，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。然而，與以上試驗結(jié)果相反，Kfoury等[19]通過DPPH法測定了7種苯丙素類化合物的抗氧化能力，結(jié)果顯示AN與DPPH的化學(xué)動力學(xué)行為明顯低于其他苯丙素類化合物，AN與DPPH幾乎沒有反應(yīng)。本試驗取得了類似的結(jié)果，30 mg/mL AN對DPPH清除率為59.97%，5.45 mg/mL AN對ABTS清除率為43.67%，計算得到2種自由基的IC50值較高，分別為16.26、6.98 mg/mL。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AN純品對自由基清除作用顯示出了劑量依賴性，清除效果隨著濃度的增加而增強(qiáng)，且高濃度下表現(xiàn)出了一定的自由基的清除能力，但仍低于陽性對照BHT。眾所周知，不同品種的茴香其遺傳潛力、生長土壤和氣候條件、提純工藝、存儲條件都可能會影響植物提取物的抗氧化活性[20-21]。另外，由于試驗設(shè)計方案不同，不同反應(yīng)體系的溶液組成差異也會影響到化合物的溶解度，進(jìn)而影響提取物的抗氧化活性。更重要的是，茴香精油成分復(fù)雜，除了含量最多的AN，還有愛腦草、雌二醇和檸檬烯等其他成分，許多天然抗氧化化合物間具有協(xié)同作用，產(chǎn)生廣譜的抗氧化活性[22]，這可能是以上報道與采用AN純品的本試驗結(jié)果存在差異的主要原因。

Pavela等[23]FRAP試驗結(jié)果表明，黃皮屬茴香精油(AN含量為64.60%)對氯化鐵的氧化還原能力表現(xiàn)出了較弱的作用，這一結(jié)果在本試驗中也有體現(xiàn)：3 mg/mL AN純品的FRAP值為0.38 mmol/L FeSO4/mL，但相同濃度下陽性對照BHT的FRAP值為4.81 mmol/L FeSO4/mL，說明AN純品對三價鐵的還原能力一般。在羥自由基清除率試驗中，AN純品的IC50值為7.82 mg/mL，比陽性對照BHT具有更好的清除效果。苯丙烯類化合物的抗氧化活性與其羥基化程度有關(guān)[19]，然而鑒于分子結(jié)構(gòu)的差異，AN沒有游離的羥自由基[24]，供氫供電子能力較差，這可能是AN的體外抗氧化活性低于BHT原因之一，然而AN結(jié)構(gòu)中包含1個烷氧基和1個甲基，雖比羥基的供電子能力弱，但也屬于供電子基團(tuán)，據(jù)此推測高濃度的AN純品對羥自由基、DPPH和ABTS自由基仍具有清除作用可能是得益于烷氧基和甲基。

3.2 AN對AA肉雞生長性能的影響

3.3 AN對AA肉雞抗氧化酶活性的影響

在現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖模式中，高密度飼養(yǎng)會導(dǎo)致肉雞生理壓力升高，如果營養(yǎng)或環(huán)境衛(wèi)生等方面管理不當(dāng)，將加劇肉雞體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生，從而引發(fā)氧化應(yīng)激，嚴(yán)重影響肉雞的健康生長及其肉品質(zhì)。因此，無論是在正常生理狀況下，還是在應(yīng)激條件下，通過抗氧化防御系統(tǒng)維持氧化還原平衡都至關(guān)重要[32]。AN的主要生理功能之一是其抗氧化活性，大量研究結(jié)果表明，AN可維持動物體內(nèi)多種組織的氧化還原平衡。在經(jīng)大腸桿菌處理的無特定病原的白來航肉雞肝臟的氧化損傷增加，而補(bǔ)充八角油(AN含量為93.16%)可通過激活核因子E2相關(guān)因子2-抗氧化反應(yīng)元件(Nrf2-ARE)信號通路，提高試驗雞群應(yīng)對氧化應(yīng)激的能力，有效緩解試驗雞群因大腸桿菌感染造成的氧化應(yīng)激及肝臟功能受損[33]。本試驗結(jié)果表明，在肉雞飼糧中添加AN，42日齡肉雞血清和胸肌的T-AOC顯著升高，Yu等[34]試驗也有類似結(jié)果，與未添加八角油相比，飼糧中施加400、600 mg/kg八角油(AN含量為91.66%)顯著提高了56日齡蛋雞的血清和肝臟的T-AOC，有效地增強(qiáng)了蛋雞血清和肝臟中T-SOD和GSH-Px活性并減少了MDA的產(chǎn)生。SOD能催化超氧化物歧化為氧氣(O2)和過氧化氫(H2O2)發(fā)揮清除超氧化物作用[35]，GSH-Px含有硒作為輔因子可催化H2O2轉(zhuǎn)化為水[36]，CAT可通過減少H2O2和羥自由基的產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞成分免受活性氧自由基(ROS)攻擊[37]。本試驗在飼糧中，添加AN后AA肉雞21日齡血清和肝臟T-SOD活性、21和42日齡肝臟CAT活性、42日齡胸肌GSH-Px活性均有顯著提高，這些抗氧化酶可通過降低反應(yīng)中間體的毒性，為細(xì)胞提供保護(hù)機(jī)制，維持細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)穩(wěn)態(tài)[38]，從而增強(qiáng)機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激的能力。脂質(zhì)過氧化會使自由基過度產(chǎn)生、加速細(xì)胞膜氧化，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷而凋亡，MDA的含量可監(jiān)測脂質(zhì)過氧化程度[39]。本試驗中，添加AN后顯著降低了肉雞21日齡血清和42日齡肝臟的MDA含量，證實(shí)了AN是一種脂質(zhì)過氧化抑制劑，提示AN在一定程度上緩解了肉雞的脂質(zhì)過氧化，可作為一種營養(yǎng)調(diào)控劑改善肉雞抗氧化防御機(jī)制，有望在禽肉商品化生產(chǎn)中延長禽肉產(chǎn)品的保質(zhì)期。

3.4 AN對AA肉雞抗氧化相關(guān)基因表達(dá)量的影響

植物苯丙烷類化合物已被證實(shí)可激活不同細(xì)胞中Nrf2/ARE信號通路，被認(rèn)為是預(yù)防氧化應(yīng)激和抗癌的化學(xué)候選物之一[40-42]。Sun等[43]研究發(fā)現(xiàn)，小茴香的添加可以減少ROS的產(chǎn)生，提高胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的含量，緩解因中波紫外線照射導(dǎo)致的成纖維細(xì)胞(NHDFs)的氧化損傷，在本試驗中，100 μg/mL的小茴香顯著提高了NHDFs核內(nèi)Nrf2的蛋白表達(dá)，Nrf2入核后可與抗氧化反應(yīng)原件ARE結(jié)合，進(jìn)而激活抗氧化防御系統(tǒng)；Sun等[43]認(rèn)為小茴香對氧化損傷保護(hù)機(jī)制可能是通過激活Nrf2/ARE信號通路，從而促進(jìn)與之相關(guān)的一系列抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄。Sallam等[44]發(fā)現(xiàn)茴香籽油可上調(diào)Nrf2及其靶蛋白HO-1和谷氨酰半胱氨酸連接酶(GCL)的表達(dá)，對撲熱息痛誘導(dǎo)的小鼠肝毒性表現(xiàn)出護(hù)肝作用。本試驗中，隨著AN添加水平的提高，21日齡肉雞肝臟Nrf2的基因相對表達(dá)量呈先升高后降低的顯著二次曲線變化，GPx1的基因相對表達(dá)量呈顯著線性升高，CAT、SOD、HO-1的基因相對表達(dá)量顯著升高，42日齡胸肌GPx1 基因相對表達(dá)量顯著提高，SOD1的基因相對表達(dá)量呈先升高后降低的顯著二次曲線變化，這些基因的變化與抗氧化酶活性的變化趨勢相一致，提示這些抗氧化酶可以在轉(zhuǎn)錄水平上被調(diào)控，進(jìn)一步說明了AN的抗氧化活性可能是由于其激活了Nrf2/ARE信號通路。

AN的體內(nèi)外抗氧化活性的試驗結(jié)果缺乏一致性并不奇怪。在氧化還原生物學(xué)領(lǐng)域，通過生物標(biāo)志物檢測結(jié)果可以快速、準(zhǔn)確、清楚有效地反映生物的狀況，表征植物源化合物的抗氧化能力[45-46]。體外生物標(biāo)志物自由基和還原能力的檢測屬于化學(xué)反應(yīng)，DPPH與ABTS自由基僅在人工試驗條件下存在，它們與生物系統(tǒng)沒有相似之處，屬于較弱的生物標(biāo)志物。此外，植物提取物發(fā)揮抗氧化的保護(hù)作用可能是多重種不同機(jī)制的總和[47]。因此，是否可以將體外化學(xué)試驗結(jié)果順推到動物體內(nèi)還有待進(jìn)一步論證。在本試驗研究中，AN純品的體外化學(xué)抗氧化能力一般，而提高肉雞抗氧化能力效果顯著，究其原因可能是AN可直接影響特定的分子靶標(biāo)或作為影響代謝途徑的穩(wěn)定結(jié)合物間接激活內(nèi)源性的抗氧化防御系統(tǒng)，從而提高動物體的抗氧化能力，發(fā)揮其積極的抗氧化作用。

4 結(jié) 論

體外試驗結(jié)果表明，AN清除羥自由基能力良好，但清除DPPH自由基、清除ABTS自由基能力與FRAP較弱，總體抗氧化作用弱于BHT。AA肉雞體內(nèi)試驗結(jié)果表明，飼糧中添加200～600 mg/kg AN可不同程度地提高AA肉雞血清、肝臟和胸肌抗氧化能力，減少血清和肝臟MDA的生成。本試驗條件下，AN作為抗氧化劑在AA肉雞飼糧中的適宜添加水平為400 mg/kg。