桑葉提取物對愛拔益加肉雞腹脂沉積及其相關(guān)脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響

黃泰來 金 睿 溫建崇 譚 華 雷華英 曹滿湖*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2.湖南今漢藥業(yè)有限公司，長沙 410300；3.麻陽藍(lán)鳳凰農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，懷化 419400)

肉雞腹部脂肪過量沉積是影響肉品質(zhì)和商品性狀的重要因素，開發(fā)具有降脂作用的飼料添加劑對家禽具有重要意義和生產(chǎn)價值。桑樹是我國南方種植廣泛的一種植物[1]，其提取物含有酚類、黃酮類、生物堿、氨基酸、多糖和甾類化合物等多種生物活性化合物，具有降血糖、降血壓、降血脂，抗氧化、抗炎等作用[2-3]。其中，桑葉中黃酮類和其特有生物堿成分1-脫氧野尻霉素(DNJ)被證明在調(diào)控糖脂代謝中作用顯著。研究表明，DNJ可改善Ⅱ型糖尿病小鼠肝細(xì)胞細(xì)胞核病變，并將小鼠尿液中16種代謝產(chǎn)物逐漸恢復(fù)接近正常水平，有效抑制了葡萄糖苷酶活性、脂肪代謝和氨基酸代謝[4]。Hu等[5]通過大鼠試驗(yàn)以及細(xì)胞試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)桑葉黃酮可通過減少體內(nèi)外過高的膽固醇積累治療肝臟類疾病。肉雞脂肪代謝與脂肪的合成、分解和轉(zhuǎn)運(yùn)等多個過程有關(guān)，其調(diào)控機(jī)制相對復(fù)雜且涉及多條信號通路，其中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路被證明與機(jī)體脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，但在肉雞腹脂沉積的研究中較少。此外，關(guān)于桑葉提取物對肉雞腹脂沉積的影響及作用途徑的研究也鮮有報(bào)道。因此，本研究擬通過在飼糧中添加桑葉提取物，考察其對肉雞腹脂沉積的影響，并通過其對生長性能、血清和肝臟中脂肪代謝相關(guān)指標(biāo)和基因表達(dá)的影響，初步探討其作用機(jī)制，為桑葉提取物在肉雞生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

桑葉提取物由湖南某有限公司提供(批號：MD0.5-200519)，提取方式為水提取，簡要步驟如下：桑葉加7.5倍水，提取3次，提取液濃縮，合并濃縮液，醇沉，濃縮揮醇，噴霧干燥，過篩，混合即得。其主要成分及含量如下：多糖5%、總黃酮20%、總酚25%、DNJ 0.5%、總蛋白質(zhì)30%、粗脂肪2.5%、總灰分15%、水分1.2%、粗纖維0.5%,其他成分0.3%。

愛撥益加(AA)肉仔雞：由湖南順成實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用1日齡AA肉雞192只，隨機(jī)分為4組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)8羽。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加400、800和1 200 mg/kg桑葉提取物的飼糧。試驗(yàn)期為56 d，分為1～21日齡(前期)和22～56日齡(后期)2個階段?；A(chǔ)飼糧參照《肉雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)和NRC(1994)肉雞營養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目Items1～21日齡 1 to 21 days of age22～56日齡 22 to 56 days of age魚粉 Fish meal1.502.28大豆油 Soybean oil2.173.22DL-蛋氨酸 DL-Met0.180.10磷酸氫鈣 CaHPO41.381.09石粉 Limestone1.151.21食鹽 NaCl0.300.30預(yù)混料 Premix1)1.001.00合計(jì) Total100.00100.00營養(yǎng)水平Nutrient levels2)代謝能 ME/(MJ/kg)12.5412.96粗蛋白質(zhì) CP21.5019.50賴氨酸 Lys1.171.02蛋氨酸 Met0.530.43鈣 Ca1.000.95有效磷 AP0.450.40

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)期間自由采食和飲水，日常管理參照《商品肉雞生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》(GB/T 19664—2005)。

1.4 樣品采集

血液樣品采集：在21和56日齡，每個重復(fù)隨機(jī)選取1只健康的肉雞，頸靜脈采集血樣，用離心機(jī)離心分離血清待測。

肝臟樣品采集：在21和56日齡，每個重復(fù)隨機(jī)選取1只健康的肉雞，肝臟樣本保存在液氮中，測定時稱取肝臟樣品0.1 g，用無水乙醇勻漿，3 000 r/min離心15 min，使肝臟與無水乙醇比例為1∶9，取上清用于肝臟生化指標(biāo)檢測；其余肝臟樣品于-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)基因表達(dá)的檢測。

1.5 測定指標(biāo)

1.5.1 生長性能

在1日齡時，稱取初始體重。在21和56日齡時，空腹12 h后(停料不停水)，稱量統(tǒng)計(jì)各重復(fù)雞體重，計(jì)算各重復(fù)各階段的耗料量、平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.5.2 腹脂沉積

腹脂沉積以腹脂沉積量來表示，計(jì)算公式如下：

腹脂沉積量(g/kg)=腹脂重(g)/肉雞活重(kg)。

1.5.3 血清和肝臟生化指標(biāo)

使用全自動生化儀(邁瑞B(yǎng)S系列)測定血清和肝臟中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量。試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.5.4 肝臟中脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)

提取肉雞肝臟組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄，采用實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)測定基因mRNA相對表達(dá)量。RNA提取試劑盒(AG21017)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AG11706)、RT-qPCR試劑盒(AG11701)均購自艾科瑞生物工程有限公司。試驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行，反應(yīng)體系為10 μL，于(Roche)LightCycler 2.0熒光定量儀上測定。試驗(yàn)測定肝臟中乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、固醇類調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1α(CPT-1α)、脂酰輔酶A氧化酶(ACO)、脂蛋白分解酶(LPL)、肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)、腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的mRNA相對表達(dá)量，相關(guān)引物序列見表2，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法定量上述目的基因的mRNA相對表達(dá)量。

表2 實(shí)時熒光定量PCR的引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用one-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉提取物對肉雞生長性能的影響

由表3可見，與對照組相比，飼糧中添加桑葉提取物對肉雞前期、后期和全期的ADFI、ADG和F/G均無顯著影響(P>0.05)。

2.2 桑葉提取物對肉雞腹脂沉積量的影響

由表4可見，與對照組相比，飼糧中添加400、800和1 200 mg/kg桑葉提取物在21、56日齡時均顯著降低了肉雞的腹脂沉積量(P<0.05)，其中56日齡腹脂沉積量的下降比率分別為30.38%、36.32%、44.90%，但3個添加水平間差異不顯著(P>0.05)。

2.3 桑葉提取物對肉雞血清和肝臟生化指標(biāo)的影響

2.3.1 桑葉提取物對肉雞血清生化指標(biāo)的影響

由表5可見，在21和56日齡時，與對照組相比，飼糧中添加不同水平的桑葉提取物對肉雞血清TG、GLU、HDL-C和LDL-C含量均無顯著影響(P>0.05)，添加800 mg/kg桑葉提取物可顯著降低21日齡肉雞血清中TC含量(P<0.05)，添加1 200 mg/kg桑葉提取物可顯著降低21和56日齡肉雞血清中TC含量(P<0.05)。

表3 桑葉提取物對肉雞生長性能的影響

表4 桑葉提取物對肉雞腹脂沉積量的影響

2.3.2 桑葉提取物對肉雞肝臟生化指標(biāo)的影響

由表6可知，在21和56日齡時，與對照組相比，飼糧中添加不同水平的桑葉提取物對肉雞肝臟中TG含量無顯著影響(P>0.05)，但添加800、1 200 mg/kg桑葉提取物可顯著降低肉雞肝臟中TC的含量(P<0.05)。

表5 桑葉提取物對肉雞血清生化指標(biāo)的影響

表6 桑葉提取物對肉雞肝臟生化指標(biāo)的影響

2.4 桑葉提取物對肉雞肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的影響

由表7可知，與對照組相比，飼糧中添加桑葉提取物均顯著增加了肉雞肝臟中AMPKα的mRNA相對表達(dá)量(P<0.05)；添加800、1 200 mg/kg的桑葉提取物顯著降低了肝臟中脂肪酸合成中SREBP-1c、ACC和FAS的mRNA相對表達(dá)量(P<0.05)；但3個添加組間肝臟中PPARα、CPT1α、ACO、LPL、L-FABP的mRNA相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。

表7 桑葉提取物對肉雞肝臟中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

桑葉及其提取物對生長性能的影響與其添加的形式有關(guān)，桑葉在動物生產(chǎn)上的應(yīng)用目前主要有桑葉粉、發(fā)酵桑葉和提取物幾種。黃靜等[6]研究表明，隨著添加水平的提高，桑葉粉組和發(fā)酵桑葉粉組使胡須雞的ADG、ADFI逐漸降低。張金龍等[7]的研究表明，飼喂肉雞2%的發(fā)酵桑葉粉可以顯著提高肉雞(羅斯308)ADFI和ADG，但對F/G無顯著影響。宋瓊莉等[8]在矮腳黃雞飼糧中添加0.2%、0.5%、0.8%的桑葉提取物，各桑葉提取物組的ADG均顯著提高，但均有降低F/G的趨勢。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加桑葉提取物對肉雞前期、后期和全期的ADFI、ADG和F/G均無顯著影響。造成上述研究結(jié)果差異的原因可能是桑葉提取物相較桑葉粉，其功能性成分(黃酮、酚類生物堿等)含量更多，而抗?fàn)I養(yǎng)因子含量較少有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，桑葉提取物可顯著降低AA肉雞的腹脂沉積量，這與目前桑葉及其提取物在家禽上的其他研究結(jié)果類似。李瑞雪等[9]研究發(fā)現(xiàn)，添加桑葉粉極顯著降低了皖西白鵝的腹脂率。蘭翠英等[10]的研究表明，飼糧中添加5%、8%、10%的桑葉粉可降低肉雞腹脂率，其中5%桑葉粉添加量可降低腹脂率達(dá)39.81%。本研究結(jié)果證明，400、800和1 200 mg/kg桑葉提取物可降低AA肉雞的腹脂沉積量分別達(dá)30.38%、36.32%、44.90%，這證明桑葉提取物對AA肉雞腹脂沉積有降低作用。

血清和骯臟中與脂肪代謝相關(guān)生化指標(biāo)的試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加800、1 200 mg/kg桑葉提取均顯著降低了肉雞前期和后期血清和肝臟中TC含量，但其他指標(biāo)，如TG、LDL-C和GLU的含量均無顯著影響，表明桑葉提取物可能通過減少膽固醇在肝臟和血清中的含量，實(shí)現(xiàn)降低AA肉雞腹脂沉積的作用。脂肪主要分為TG、TC、脂肪酸和類脂質(zhì)。TG是機(jī)體儲存能量的主要形式，血清TG含量代表了動物脂肪沉積的能力；膽固醇主要合成和儲存于肝臟，血清TC含量是血液中脂蛋白所含膽固醇的總和，可作為脂肪代謝的主要指標(biāo)；血清LDL-C合成于肝臟，是血液轉(zhuǎn)運(yùn)肝臟合成的內(nèi)源性膽固醇運(yùn)至肝外組織的重要脂蛋白，是保證機(jī)體對膽固醇的需要的重要載體。另外，肝臟TC、TG也是反映肝臟中脂肪代謝的重要指標(biāo)。肝臟中脂肪代謝的穩(wěn)態(tài)對于機(jī)體健康至關(guān)重要，當(dāng)體內(nèi)脂肪和膽固醇過多時，則不能被完全代謝，并大量沉積在肝臟和腹部[11]，導(dǎo)致脂肪肝和腹部脂肪沉積[12-13]。本研究結(jié)果與桑葉及其加工產(chǎn)物在其他動物生產(chǎn)上的應(yīng)用基本一致。樊路杰[14]研究發(fā)現(xiàn)，添加桑葉或發(fā)酵桑葉可極顯著降低育肥豬血清TC、TG、LDL-C的含量，極顯著提高血清中HDL-C的含量，表明桑葉和發(fā)酵桑葉可以提高育肥豬脂肪代謝能力，Lee等[15]在小鼠中也有類似發(fā)現(xiàn)。黃靜等[6]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加20%的桑葉粉可顯著降低胡須雞血清中TC、TG含量。侯啟瑞等[16]的研究結(jié)果顯示，桑葉粉和桑葉DNJ提取物顯著降低了鵝血液中的TG含量，但對血液中TC、LDL-C和HDL-C含量無顯著影響，提示DNJ是桑葉中影響動物脂肪代謝的重要功效物質(zhì)，而本試驗(yàn)中所使用的桑葉提取物中也含有DNJ，這可能是其有效降低AA肉雞腹脂沉積的功能性物質(zhì)之一。

進(jìn)一步對肝臟中與脂肪代謝合成與分解途徑相關(guān)基因的研究發(fā)現(xiàn)，桑葉提取物對AA肉雞腹脂沉積、血清和肝臟中TC含量的降低，與肝臟中脂肪酸合成過程中的AMPK信號路徑有關(guān)，而與分解途徑相關(guān)性不大。

AMPK作為機(jī)體調(diào)控能量和脂類代謝的重要信號路徑，可通過直接磷酸化SREBP-1c的相應(yīng)靶點(diǎn)，從而下調(diào)SREBP-1c基因的表達(dá)，起到抑制脂肪的合成作用[17-18]。而SREBP-1c作為細(xì)胞中脂肪代謝主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可直接調(diào)控ACC和FAS等脂肪合成相關(guān)酶的基因表達(dá)水平，調(diào)節(jié)脂肪酸和TG合成，具有生脂作用。如對小鼠的研究表明，SREBP-1c基因的過表達(dá)可促進(jìn)肝臟中TG和膽固醇的沉積[19]。FAS是長鏈脂肪酸聚合過程中的關(guān)鍵酶，與肝臟脂肪酸合成密切相關(guān)[20]；ACC在調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪酸合成和代謝方面起著重要作用，抑制ACC的活性可起到減少機(jī)體中脂肪合成、增強(qiáng)脂肪酸氧化的效果[21]。本研究結(jié)果顯示，桑葉提取物顯著上調(diào)了肉雞肝臟中AMPKα的mRNA相對表達(dá)量，下調(diào)了SREBP-1c、ACC、FAS的mRNA相對表達(dá)量，有效減少了肝臟中膽固醇的沉積。該結(jié)果提示，桑葉提取物發(fā)揮降低AA肉雞腹脂沉積的功效可能是通過AMPKα的激活，經(jīng)過AMPK/SREBP-1c/ACC信號通路，降低ACC和FAS等相關(guān)酶的表達(dá)，通過減少肝臟中的脂肪酸合成，從而降低肉雞血脂和腹脂沉積，如圖1所示。

AMPKα:腺苷酸活化蛋白激酶α AMP-activated protein kinase α;SREBP-1c:固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c sterol regulatory element binding protein-1c;ER:內(nèi)質(zhì)網(wǎng) endoplasmic reticulum;SRE:啟動子區(qū)域SRE元件 promoter region SRE element; FAS:脂肪酸合成酶 fatty acid synthetase; ACC:乙酰輔酶A羧化酶 acetyl-CoA carboxylase;TC:總膽固醇 total cholesterol。

在脂肪酸氧化分解方面，本試驗(yàn)檢測了轉(zhuǎn)錄因子PPARα及其調(diào)控的相關(guān)基因ACO、CPT1α、LPL和L-FABP的mRNA相對表達(dá)量。PPARα屬于核激素受體家族，能夠通過促進(jìn)脂肪酸β氧化和調(diào)節(jié)脂蛋白代謝來發(fā)揮調(diào)控機(jī)體脂肪代謝的作用。PPARα可通過調(diào)控CPT1α和ACO等的基因表達(dá)和酶活性，從而調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)β氧化[22]。在嚙齒動物中，PPARα可通過多種機(jī)制改善胰島素抵抗，增強(qiáng)胰島素敏感性，進(jìn)一步增強(qiáng)肝臟脂肪酸氧化酶表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)降脂作用[23]。代泓鈺等[24]的研究表明，桑葉水提物可能通過激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蘇氨酸激酶/過氧化物酶體增殖物激活受體α/肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1(PI3K/Akt/PPARα/CPT-1)信號通路有效改善大鼠肝臟糖、脂代謝和胰島素抵抗。Tang等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，桑葉水提物可通過激活A(yù)MPK和PPARα信號通路減少小鼠肝臟脂質(zhì)合成和累積，對酒精誘導(dǎo)的肝臟損傷具有保護(hù)作用。

但本研究結(jié)果顯示，飼糧中添加桑葉提取物對肉雞肝臟中PPARα、CPT1α、ACO、LPL和L-FABP等mRNA相對表達(dá)量無顯著影響。這表明與嚙齒動物不同，桑葉提取物在家禽中實(shí)現(xiàn)降脂功效主要是通過抑制脂肪酸的合成[21,26]，而非通過脂肪的氧化分解來實(shí)現(xiàn)的。

4 結(jié) 論

綜上所述，桑葉提取物有效減少AA肉雞腹脂的沉積，其作用原理與AMPK/SREBP-1c/ACC信號通路有關(guān)，通過上調(diào)肝臟中AMPKα的基因表達(dá)和下調(diào)SREBP-1c及其下游與脂肪酸合成相關(guān)酶FAS、ACC的基因表達(dá)，通過減少肝臟和血清中膽固醇含量，從而實(shí)現(xiàn)降低肉雞腹脂沉積的作用。本試驗(yàn)中，桑葉提取物對AA肉雞發(fā)揮降脂作用的適宜添加量為800～1 200 mg/kg。