葡萄糖氧化酶對蛋雞產(chǎn)蛋后期產(chǎn)蛋性能、腸道組織形態(tài)和盲腸微生物的影響

柴曉瑩 王 艷 賈小水 馬文峰 曹忠洋 王占彬*

(1.河南科技大學動物科技學院，洛陽 471000；2.河南新仰韶生物科技有限公司，三門峽 472400)

產(chǎn)蛋后期蛋雞的生理機能逐漸退化，同時由于集約化養(yǎng)殖環(huán)境中各種應激因素的影響，雞群常處于氧化應激狀態(tài)，產(chǎn)蛋性能降低，腸道組織形態(tài)變差，腸道微生物群落失調(diào)，利用年限縮短。因此，研究高效綠色飼料添加劑對產(chǎn)蛋后期蛋雞產(chǎn)蛋性能、腸道組織形態(tài)以及腸道微生物的影響對于提高蛋雞養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益有重要意義。隨著全面禁抗時代的到來，尋找抗生素的有效替代品成為研究的熱點，其中酶制劑是很好的抗生素替代品之一。葡萄糖氧化酶(GOD)是一種氧化還原酶，在有氧條件下能將β-D-葡萄糖分解為葡萄糖酸和過氧化氫，反應消耗氧氣和產(chǎn)生葡萄糖酸為腸道有益菌提供有利生存環(huán)境，無毒無害，其提高蛋雞生產(chǎn)性能、改善蛋雞腸道健康的作用已經(jīng)在前人的研究中得到證實。王恒毅等[1]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加0.2%的GOD可提高蛋雞的產(chǎn)蛋率，降低采食量、料蛋比及死淘率，節(jié)約生產(chǎn)成本。Wu等[2]研究發(fā)現(xiàn)，對于21日齡的肉仔雞，添加GOD組與添加抗生素生長促進劑組相比，肉仔雞盲腸中細菌多樣性顯著增加，但與對照組相比沒有顯著差異；此外，Alpha多樣性指數(shù)如AEC、Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)也沒有發(fā)現(xiàn)顯著性變化。但是目前關于GOD對盲腸微生物的研究只關注幾種常見菌種，本試驗旨在系統(tǒng)探究GOD對蛋雞盲腸微生物的影響，為蛋雞腸道微生物的研究提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及飼養(yǎng)管理

選取270只產(chǎn)蛋率相近的70周齡海蘭褐蛋雞，隨機分為3組，每組6個重復，每個重復15只雞。經(jīng)統(tǒng)計學分析，各組產(chǎn)蛋率無顯著差異(P>0.05)。對照組飼喂基礎飼糧，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組分別在基礎飼糧中添加150 、300 mg/kg活性為1 000 U/g的GOD。預試期7 d，正試期50 d。飼養(yǎng)試驗在河南省洛陽市新安縣紅雨養(yǎng)殖場進行。試驗蛋雞采用3層階梯式籠養(yǎng)，每籠3只蛋雞。試驗蛋雞的飼養(yǎng)管理與本雞場的飼養(yǎng)管理相同，雞舍采用自然光照加人工補光(16 h/d，光照程序控制器控制)，雞舍溫度為(20±2) ℃，相對濕度為50%～60%，自然通風結合縱向負壓通風。試驗蛋雞自由采食，每天07:00、14:00及18:00各喂料1次，每天勻料3次，保證料槽中料量均勻；乳頭式飲水器自由飲水。每天15:30清1次糞，16:00收蛋?；A飼糧參照NRC(1994)營養(yǎng)需要配制成粉狀配合飼糧，其組成及營養(yǎng)水平參見文獻[3]。

1.2 產(chǎn)蛋性能測定

每天17:00收集蛋，以每組各重復為單位記錄每天的產(chǎn)蛋數(shù)、蛋重、破蛋數(shù)及蛋雞死淘數(shù)；每周統(tǒng)計采食量，計算全期的產(chǎn)蛋率、平均日產(chǎn)蛋重、平均日采食量、料蛋比及破蛋率。

1.3 腸道組織形態(tài)測定

飼養(yǎng)試驗結束后，每個重復隨機選取1只雞屠宰，分別采集每只雞的十二指腸、空腸和回腸中段2 cm[4]，將取下的組織放在新鮮的4%多聚甲醛中固定24 h以上，以備制作腸道組織石蠟切片，觀察腸道組織形態(tài)。在制備的腸道組織切片上選取6個典型視野，用CaseViewer圖像分析軟件測量絨毛高度(villous height，VH)、隱窩深度(crypt depth，CD)、腸壁厚度(intestinal wall thickness)，并計算絨隱比(VH/CD)[5]。

1.4 盲腸微生物多樣性檢測

盲腸樣品的采集：在屠宰試驗雞的同時，分別從對照組、300 mg/kg GOD組宰殺的雞中隨機在相同部位截取4段相同長度的盲腸樣品，將截取下來的8個盲腸樣品放入EP管中，并快速放進液氮中保存，最后放入-80 ℃冰箱中保存，以備檢測其微生物多樣性及結構。盲腸樣品進行16S rDNA V3～V4區(qū)擴增與高通量測序分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

產(chǎn)蛋性能、腸道組織形態(tài)的數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著時，用Duncan氏法進行多重比較檢驗[4]。盲腸微生物多樣性采用Alpha多樣性分析，相關指數(shù)用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0進行獨立樣本t檢驗，群落結構采用層級聚類分析和物種豐度circos分析，對照組和300 mg/kg GOD組的8個樣本中不同種類微生物相對豐度的數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進行獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 GOD對蛋雞產(chǎn)蛋性能的影響

由表1可知，150 mg/kg GOD組、300 mg/kg GOD組產(chǎn)蛋率顯著高于對照組(P<0.05)；300 mg/kg GOD組平均日產(chǎn)蛋重顯著高于對照組與150 mg/kg GOD組(P<0.05)，150 mg/kg GOD組與對照組無顯著差異(P>0.05)；300 mg/kg GOD組料蛋比顯著低于對照組(P<0.05)，150 mg/kg GOD組與對照組無顯著差異(P>0.05)；各試驗組平均日采食量與破蛋率與對照組均無顯著差異(P>0.05)。

2.2 GOD對蛋雞腸道組織形態(tài)的影響

由表2可知，與對照組相比，150 mg/kg GOD組和300 mg/kg GOD組蛋雞十二指腸、空腸和回腸絨毛高度顯著提高(P<0.05)；300 mg/kg GOD組蛋雞十二指腸絨隱比顯著提高(P<0.05)。

表1 GOD對蛋雞產(chǎn)蛋性能的影響

表2 GOD對蛋雞腸道組織形態(tài)的影響

2.3 GOD對蛋雞盲腸微生物多樣性的影響

2.3.1 Alpha多樣性分析

由表3可知，在產(chǎn)蛋后期蛋雞飼糧中添加300 mg/kg GOD對盲腸微生物操作分類單元(OTU)數(shù)目以及反映物種多樣性的Shannon、Chao1、PD指數(shù)均無顯著影響(P>0.05)。

2.3.2 盲腸群落結構分析

如圖1所示，根據(jù)層級聚類分析的結果在門水平上可將8個樣本分為4個類群，即Group Ⅱ 4為一個類群，Control 1、Control 2、Control 4為一個類群，Group Ⅱ 1、Group Ⅱ 3為一個類群，Control 3和Group Ⅱ 2為一個類群，并不能表現(xiàn)出對照組和300 mg/kg GOD組間物種組成差異；在屬的水平上8個樣本也是分為4個類群，即Group Ⅱ 4為一個類群，Group Ⅱ 1、Group Ⅱ 3為一個類群，Group Ⅱ 2為一個類群，Control 1、Control 2、Control 3、Control 4為一個類群，這表明在屬的水平上300 mg/kg GOD組與對照組物種組成存在差異。在門水平和屬水平上的物種豐度見圖2。如表4所示，在門水平上，飼糧中添加300 mg/kg GOD可以極顯著增加螺旋菌門(Spirochaetes)、迷蹤菌門(Elusimicrobia)的相對豐度(P<0.01)，顯著降低藍藻菌門(Cyanobacteria)的相對豐度(P<0.05)，極顯著降低疣微菌門(Verrucomicrobia)的相對豐度(P<0.01)；同時，還可以增加擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度，降低厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度，但差異均未達顯著水平(P>0.05)。如表5所示，在屬水平上，飼糧中添加300 mg/kg GOD可以顯著增加擬桿菌屬(Bacteroides)、未分類的瘤胃球菌科(Ruminococcaceae_unclassified)的相對豐度(P<0.05)，極顯著增加瘤胃球菌科NK4A214群(Ruminococcaceae_NK4A214_group)的相對豐度(P<0.01)，顯著降低普雷沃氏菌科UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)的相對豐度(P<0.05)；同時，還可以增加未分類的擬桿菌目(Bacteroidales_unclassified)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、瘤胃球菌科UCG-010(Ruminococcaceae_UCG-010)的相對豐度，降低糞便桿菌屬(Faecalibacterium)、未分類的毛螺菌科(Lachnospiraceae_unclassified)、瘤胃球菌科UCG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)、克里斯滕森菌科R7群(Christensenellaceae_R-7_group)、瘤胃球菌科UCG-005(Ruminococcaceae_UCG-005)、副桿菌屬(Parabacteroides)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)的相對豐度，但差異均未達到顯著水平(P>0.05)。

表3 Alpha多樣性指數(shù)

Control 1、Control 2、Control 3和Control 4為對照組的4個樣本，Group Ⅱ 1、Group Ⅱ 2、Group Ⅱ 3、Group Ⅱ 4為300 mg/kg GOD組的4個樣本。Control 1, Control 2, Control 3 and Control were 4 samples from the control group, and Group Ⅱ 1, Group Ⅱ 2, Group Ⅱ 3 and Group Ⅱ 4 were 4 samples from the 300 mg/kg GOD group.

Bacteroidetes：擬桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Spirochaetes：螺旋菌門；Proteobacteria：變形菌門；Deferribacteres：脫鐵桿菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Synergistetes：互養(yǎng)菌門；Actinobacteria：放線菌門；Elusimicrobia：迷蹤菌門；Fusobacteria：梭桿菌門；Cyanobacteria：藍藻菌門；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科RC9腸道群；Bacteroides：擬桿菌屬；Ruminococcaceae_unclassified：未分類的瘤胃球菌科；Bacteroidales_unclassified：未分類的擬桿菌目；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Faecalibacterium：糞便桿菌屬；[Ruminococcus]_torques_group：瘤胃球菌屬扭鏈群；Christensenellaceae_R-7_group：克里斯滕森菌科R-7群；Lachnospiraceae_unclassified：未分類的毛螺菌科；Rikenellaceae_unclassified：未分類的理研菌科；Spirochaetaceae_unclassified：未分類的螺旋體科；Ruminococcaceae_UCG-005：瘤胃球菌科UCG-005；Butyricicoccus：丁球菌屬；[Eubacterium]_coprostanoligenes_group：產(chǎn)糞甾醇真桿菌；Ruminococcaceae_UCG-014：瘤胃球菌科UCG-014；Ruminococcaceae_NK4A214_group:瘤胃球菌科NK4A214群；Desulfovibrio：脫硫弧菌屬；Prevotellaceae_Ga6A1_group：普雷沃氏菌科Ga6A1群；Rumen bacterium_unclassified 134：未分類的瘤胃細菌134；Ruminiclostridium_5：瘤胃梭菌屬5；Alistipes：另枝菌屬；Clostridiales_vadinBB60_group_unclassified：未分類的梭菌目vadinBB60群；Parabacteroides：副桿菌屬；Ruminococcaceae_UCG-010：瘤胃球菌科UCG-010； Oribacterium：顫桿菌克屬；Prevotellaceae_UCG-001：普雷沃氏菌科UCG-001；Oscillibacter：顫桿菌屬；Lactobacillus：乳桿菌屬；Mucispirillum：脫鐵桿菌屬；Others:其他。

表4 門水平盲腸微生物相對豐度

3 討 論

3.1 GOD對產(chǎn)蛋后期蛋雞產(chǎn)蛋性能的影響

GOD能改善飼糧的適口性，在養(yǎng)殖動物出現(xiàn)厭食的情況時，添加GOD可以讓養(yǎng)殖動物恢復正常采食[5]。李嘉輝等[6]研究了GOD對產(chǎn)蛋后期蛋種雞產(chǎn)蛋性能、孵化性能及抗氧化能力的影響，結果顯示，GOD可以緩解產(chǎn)蛋后期蛋種雞的氧化應激狀態(tài)，延緩蛋雞機體衰老和卵巢功能退化，從而提高蛋雞產(chǎn)蛋后期的產(chǎn)蛋性能。趙必遷等[7]在產(chǎn)蛋后期羅曼粉殼蛋雞飼糧中添加300 mg/kg的GOD，發(fā)現(xiàn)顯著提高了產(chǎn)蛋率和顯著降低了料蛋比，極顯著降低了死亡率和破殼率。曲浩杰等[8]在產(chǎn)蛋后期海蘭褐蛋雞飼糧中添加博落回提取物和GOD，發(fā)現(xiàn)顯著提高了產(chǎn)蛋率，顯著降低了料蛋比。本研究結果表明飼糧中添加150、300 mg/kg GOD可使處于產(chǎn)蛋后期蛋雞的產(chǎn)蛋率顯著提高，添加300 mg/kg GOD可使料蛋比顯著降低。生產(chǎn)實踐發(fā)現(xiàn)，在蛋雞飼糧中添加GOD確實能使產(chǎn)蛋率提高2%左右，但是產(chǎn)蛋率并不是隨著GOD添加量的增加而直線上升，而是以3%的添加量產(chǎn)蛋率最高，超過這個添加量產(chǎn)蛋率不但提高不明顯，由于生產(chǎn)成本的提高，反而使經(jīng)濟效益受到了影響[9]。因此，大型養(yǎng)殖場從經(jīng)濟角度出發(fā)，在考慮添加時期的同時也應結合所用GOD市場價格，考慮添加量，不能盲目在蛋雞飼糧中添加GOD。

表5 屬水平盲腸微生物相對豐度

3.2 GOD對產(chǎn)蛋后期蛋雞腸道組織形態(tài)的影響

小腸是營養(yǎng)物質吸收的重要場所，腸絨毛高度越大，腸黏膜與食糜接觸面積越大，小腸消化和吸收能力越強[10]。隱窩深度能反映細胞的增殖率，隱窩深度變淺說明腸上皮細胞成熟率上升，對營養(yǎng)物質的吸收能力增強。因此，絨隱比可綜合反映小腸功能，絨隱比越高，小腸消化吸收功能越強，絨隱比減小說明腸黏膜受損，影響小腸對營養(yǎng)物質的消化吸收。腸壁厚度能反映腸道組織結構的完整性，特別是腸壁內(nèi)肌層厚度的增加，能使小腸蠕動增強，可以提高其消化吸收能力，從而提高生產(chǎn)性能[11-14]。隨著養(yǎng)殖蛋雞養(yǎng)殖周期的延長，蛋雞的死淘率快速上升，這與蛋雞腸道健康有著密不可分的關系。宋海彬等[15]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加GOD可提高肉雞十二指腸和空腸絨毛高度，降低隱窩深度，增加絨毛膜高度/隱窩深度。崔細鵬等[16]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加GOD對肉雞十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度、隱窩深度、絨毛膜高度/隱窩深度均無顯著影響。本試驗結果發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加150或300 mg/kg GOD均可顯著提高產(chǎn)蛋后期蛋雞十二指腸、空腸和回腸絨毛高度；飼糧中添加300 mg/kg GOD可顯著提高十二指腸的絨隱比。Gu等[17]研究表明，若動物應激較大，其腸道微生物區(qū)系就會發(fā)生改變，進而影響腸道的形態(tài)結構。據(jù)研究表明，由葡萄糖酸發(fā)酵生成的乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性短鏈脂肪酸(SCFA)主要是腸道微生物產(chǎn)生的，且極易在腸道內(nèi)被上皮細胞吸收[18]。而經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪酸可以明顯提高腸絨毛高度、黏膜厚度及絨毛面積，降低隱窩深度[15,19]。此外，隨著蛋雞飼養(yǎng)周期的延長，體內(nèi)會產(chǎn)生大量自由基，破壞腸道上皮細胞。而GOD具有氧化還原作用，可以有效清除自由基，保護腸道組織結構的完整性[20]。以上這些對GOD作用機理的研究增加了本試驗的可信度。至于與崔細鵬等[16]的試驗結果存在的偏差，猜測是GOD添加量不同引起的。

3.3 GOD對產(chǎn)蛋后期蛋雞盲腸微生物的影響

產(chǎn)蛋后期蛋雞產(chǎn)蛋性能慢慢降低，蛋殼變薄易碎，破損率大幅度增加；免疫力和抵抗力減弱，易發(fā)生應激反應。而這些均與蛋雞在產(chǎn)蛋后期體內(nèi)代謝變化和腸道內(nèi)微生態(tài)變化等密切相關[10]。高通量測序技術目前已經(jīng)成為很多研究不可缺少的工具。通過這個技術，可以深入地了解腸道菌群的組成情況與動態(tài)，幫助研究者查清楚宿主與細菌間的相互影響關系[21]。另外，細菌16S rDNA基因包含9個高變區(qū)，這些高變區(qū)可以用來檢測并分類細菌[22-23]。由于16S rDNA V3～V4區(qū)擁有高分類一致性，所以本試驗選擇對蛋雞盲腸V3～V4區(qū)進行細菌16S rDNA分析。有研究表明GOD可以影響盲腸微生物多樣性，王前光等[24]在GOD對1～6周齡臨武鴨生長性能、血清生化和抗氧化指標、腸道形態(tài)結構和微生物多樣性影響的研究中發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加30 g/t GOD時，臨武鴨盲腸微生物豐富度指數(shù)顯著高于對照組，與本試驗結果不一致，這可能與試驗動物不同有關。而Wu等[2]在肉仔雞上的研究結果與本試驗是一致的。研究表明，脫硫弧菌屬具有很高的纖維降解能力[25]，擬桿菌門能夠降解非纖維性碳水化合物、蛋白質，促進胃腸道免疫系統(tǒng)發(fā)育[26-27]；厚壁菌門與纖維分解、碳水化合物代謝有關[28]；此外，家禽盲腸中厚壁菌門的相對豐度與體增重[29]和產(chǎn)蛋性能[30]存在正相關。本試驗結果發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加300 mg/kg GOD可以降低厚壁菌門的相對豐度，提高擬桿菌門的相對豐度，降低脫硫弧菌屬的相對豐度，提高擬桿菌屬的相對豐度。擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度的改變在目前研究中存在爭議，黃婧溪[30]研究表明,GOD降低擬桿菌門相對豐度，高晶萍等[31]研究表明,GOD極顯著提高擬桿菌門的含量，Wu等[2]研究提到GOD組厚壁菌門豐度顯著增加。綜上所述,本試驗驗證了高晶萍等[31]的試驗結果。變形菌門包括大量的革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌，它們通過細胞壁上的脂多糖(LPS)誘導炎癥反應[32]，副桿菌屬可以通過誘導抗炎因子的產(chǎn)生以及抑制炎癥因子的分泌減少腸道炎癥反應，維持腸道正常功能[33]。普雷沃氏菌屬具有多種作用，包括減輕炎癥，消化纖維素，產(chǎn)生乙酸、丁酸以及少量異丁酸[34]；作為一種常見的腸道有益菌，乳桿菌屬可以通過下調(diào)一些炎癥因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達來緩解結腸炎模型大鼠的腸道炎癥反應[35]；此外，乳桿菌屬可以與彎曲桿菌等病原菌爭奪黏膜結合位點來防止腸道病原體感染，保護腸道健康[36]。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加300 mg/kg GOD可以降低變形菌門和副桿菌屬的相對豐度，提高普雷沃氏菌UCG-001和乳桿菌屬的相對豐度，說明GOD可能通過提高普雷沃氏菌_UCG-001屬的相對豐度來降低蛋雞炎癥的發(fā)生。瘤胃球菌科NK4A214群、糞便桿菌屬、未分類的毛螺菌科可以在腸道中產(chǎn)生短鏈脂肪酸。在龐凱悅等[37]的研究中發(fā)現(xiàn)，瘤胃球菌科UCG-014、瘤胃球菌科UCG-005、瘤胃球菌科UCG-010、克里斯滕森菌科R7群與一些牛瘤胃的一些短鏈脂肪酸有顯著的正相關或者負相關關系。短鏈脂肪酸是調(diào)節(jié)腸道功能和腸道免疫的關鍵性因子，對宿主有多種有益作用，包括維持腸道屏障功能和抗炎作用。本試驗中，飼糧中添加300 mg/kg GOD使瘤胃球菌科NK4A214群的相對豐度極顯著上升，未分類的毛螺菌科、瘤胃球菌科UCG-014、瘤胃球菌科UCG-005、瘤胃球菌科UCG-010、克里斯滕森菌科R7群、糞便桿菌屬的相對豐度沒有顯著變化，這表明GOD有可能通過增加瘤胃球菌科NK4A214群的相對豐度來增加腸道中短鏈脂肪酸的含量，進而增強腸道免疫功能。疣微菌門中的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)由于在黏蛋白降解過程中的特殊性能而成為腸腔與宿主細胞間黏膜界面的關鍵生物，和炎癥性腸病、肥胖、酒精肝、孤獨癥、結腸炎、2型糖尿病、1型糖尿病及其他代謝紊亂等密切相關[38]。飼糧中添加300 mg/kg GOD后疣微菌門的相對豐度極顯著降低，由于不能夠確定本試驗測序的是疣微菌門中哪一種，故不能夠確定此菌門增加的相關效應。藍藻菌門在動物腸道中研究還很少，不能確定藍藻菌門相對豐度的增加對蛋雞腸道調(diào)節(jié)有無影響。有研究表明梭桿菌門對動物具有毒害作用，300 mg/kg GOD組梭桿菌門的相對豐度較對照組略有下降，故不會對蛋雞造成危害。

4 結 論

① 飼糧中添加150或300 mg/kg GOD均能顯著提高產(chǎn)蛋后期蛋雞的產(chǎn)蛋率；添加300 mg/kg GOD還能顯著提高平均日產(chǎn)蛋重、顯著降低料蛋比，在一定程度上改善了產(chǎn)蛋后期蛋雞的產(chǎn)蛋性能。

② 飼糧中添加150或300mg/kg GOD均顯著提高了蛋雞十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度；添加300 mg/kg GOD還顯著提高了蛋雞十二指腸絨隱比，利于蛋雞的腸道健康和機體免疫。

③ 飼糧中添加300 mg/kg GOD有利于優(yōu)化蛋雞盲腸微生物群落結構組成。