高通量測序分析阿納其根醇提取物對咳嗽變異性哮喘大鼠腸道菌群的影響

楊 浩，鄭 軍，陳 瑤，金小越

(新疆醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院1藥學部，2重癥醫(yī)學科，烏魯木齊 830002)

咳嗽變異性哮喘(Cough variant asthma，CVA)是一種以氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑為特征的慢性炎癥性疾病[1]，其主要由肥大細胞、嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞和與氣道炎癥相關的炎癥細胞所觸發(fā)。CVA與哮喘的治療方式相似，采用支氣管擴張劑或糖皮質(zhì)激素等藥物，但長期使用會引發(fā)多種不良反應。中醫(yī)藥在治療疾病方面具有多靶點和整體治療優(yōu)勢。阿納其為菊科羅馬除蟲菊[Anacycluspyrethrum(L).DC]的干燥根，主要化學成分有黃酮、生物堿等，具有鎮(zhèn)咳和祛痰的作用。本課題組前期研究[2]發(fā)現(xiàn)阿納其根醇提取物(Ethanol extract of the root ofAnacycluspyrethrum，EEAP)可以明顯降低CVA大鼠咳嗽次數(shù)、肺部炎性反應以及支氣管壁充血、水腫等癥狀，提示EEAP可通過抑制炎癥反應，發(fā)揮改善CVA的作用。此外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)高劑量(640 mg/kg體重)EEAP在改善CVA大鼠咳嗽次數(shù)及炎性因子水平等方面效果最佳，且存在劑量依賴性[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，哮喘及咳嗽變異性哮喘與腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡相關[4]。腸道菌群是哺乳動物機體微生態(tài)系統(tǒng)中最重要的組成部分，對免疫系統(tǒng)的發(fā)育、功能和調(diào)節(jié)起著非常重要的作用[5-7]。柳萍飛[8]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，CVA組患兒腸道中雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量明顯降低，而腸桿菌、酵母菌數(shù)量明顯升高，提示腸道菌群結(jié)構(gòu)與CVA疾病發(fā)展可能存在聯(lián)系。微生物在免疫和炎癥反應中發(fā)揮著重要作用，其中腸道菌群生態(tài)平衡的破壞是誘發(fā)慢性炎性的重要因素之一，可使哮喘病情加劇[9]。根據(jù)上述文獻報道，提示腸道菌群可參與免疫調(diào)節(jié)，抑制炎癥反應，發(fā)揮改善CVA的作用。本研究采用高通量測序技術分析EEAP對CVA大鼠腸道菌群的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物6～8周齡的SPF級雄性SD大鼠,體重(200±20)g，購買于新疆醫(yī)科大學動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(新)2018-0003。動物飼養(yǎng)、處理和手術過程由新疆醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院動物保護與使用委員會審核批準，動物倫理審查批號：LFYLLSC2017020。

1.2 試藥阿納其根(新疆本草堂藥業(yè)公司，批號：704025)，醋酸潑尼松片(天津天藥藥業(yè)股份有限公司，批號：CP170620a2)，卵清蛋白、10%完全費氏佐劑(美國Sigma公司批號分別為：1002638271、10025515070)，20%氫氧化鋁膠生理鹽水溶液(齊魯動物保健品有限公司，批號：1708002)，QIAamp DNA Stool Mini Kit(德國Qiagen公司，批號：148044486)。根據(jù)課題組前期研究[2]進行制備阿納其根醇提取物，按照阿納其根與65%乙醇比例為1∶6(g/mL)在50℃下回流提取2 h后，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成浸膏，冷凍干燥成粉末，備用。

1.3 儀器BSA224S電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，微量加樣器(芬蘭Thermo公司)，YLS-8B小動物霧化給藥儀(中國濟南益延科技發(fā)展有限公司)，DanoDrop1000核酸蛋白檢測儀(美國BIO RAD公司)。

1.4 方法

1.4.1 CVA模型建立及分組 取24只6～8周齡的雄性SD大鼠根據(jù)文獻[2]建立CVA模型：給予大鼠皮下注射1 mg/mL卵清蛋白溶液致敏，1周后重復致敏1次，每日采用1%卵清蛋白溶液進行1次霧化吸入，以激發(fā)哮喘，連續(xù)15 d。將建模成功的大鼠隨機分為3組:CVA模型組(等體積的生理鹽水)、EEAP組(EEAP，640 mg/kg體重)、陽性藥組(醋酸潑尼松，250 mg/kg體重)，每組8只，另取8只未造模的6～8周齡雄性SD大鼠作為對照組(等體積的生理鹽水)，連續(xù)灌胃30 d。

1.4.2 糞便收集及細菌DNA提取 采用代謝籠收集各組小鼠干預30 d后的糞便，置于無菌免酶凍存管中，液氮冷凍后于-80℃冰箱保存，備用。嚴格按照QIAamp DNA Stool Mini Kit說明書，提取各組大鼠糞便細菌總DNA，并使用核酸蛋白檢測儀分析提取糞便細菌總DNA的濃度和純度。大鼠糞便細菌總DNA在OD260/OD280的比值為1.8～2.0之間，說明樣品DNA的純度好，沒有蛋白質(zhì)污染，可用于高通量測序，若其比值不在該范圍提示存在蛋白質(zhì)或RNA污染。將合格的各組大鼠糞便細菌總DNA送往上海百趣生物有限公司完成高通量測序分析。

1.4.3 Alpha和Beta多樣性分析各組大鼠腸道菌群變化 將去噪后的大鼠腸道細菌DNA序列進行聚類后，得到擴增子序列變異(Amplicon sequence variation，ASV)，并對四組大鼠糞便細菌進行不同微生物相對豐度分類?；贏SV分析物種注釋，進行Alpha和Beta多樣性分析。通過Alpha多樣性分析各組大鼠腸道菌群的豐富度與均勻度的綜合指標，包括chao1、dominance、goods_coverage、observed_otus和pielou_e指數(shù)及shannon和simpson指數(shù)。β多樣性包含主坐標分析(Principal Coordinates Analysis, PCoA)和非度量多維標度(Nonmetric multidimensional scaling,NMDS)等分析，用來表示不同環(huán)境狀態(tài)下菌群的物種差異性。

2 結(jié)果

2.1 細菌總DNA純度及ASV水平通過提取各組大鼠腸道糞便細菌總DNA后，采用核酸蛋白檢測儀檢測細菌總DNA純度發(fā)現(xiàn)，OD260/OD280的比值均在1.8～2.0之間，提示可以用于高通量測序分析。高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，在32個樣本中，共獲取1 996 591條有效序列，有效序列的堿基數(shù)目為828 164 854 nt，有效序列的平均堿基數(shù)目為415 nt。測序結(jié)果按照100%的相似度聚類為ASV，共獲得4 771個ASV。

2.2 腸道菌群Alpha多樣性分析對各組大鼠的腸道菌群進行Alpha多樣性分析，發(fā)現(xiàn)代表豐富度的chao1、dominance、observed_otus、pielou_e指標及代表多樣性的shannon、simpson指標無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)比較

2.3 腸道菌群Beta多樣性分析

2.3.1 PCoA及NMDS分析 將各組大鼠腸道細菌聚類得到的ASV進行PCoA，得到主坐標值1(PC1)、主坐標值2(PC2)分別為43.39%和23.95%，其中對照組與模型組大鼠腸道菌群完全分開，提示對照組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與CVA大鼠存在較大差異。通過NMDS分析(Stress值為0.13)發(fā)現(xiàn)EEAP和陽性藥組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)相近而與CVA大鼠分離，提示EEAP和陽性藥可能影響CVA大鼠腸道菌群發(fā)揮改善疾病的作用，見圖1、2。

圖1 PCoA法分析各組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異圖2 非度量多維標度分析各組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異

2.3.2 腸道菌群結(jié)構(gòu)中的屬水平相對豐度差異 通過非參數(shù)Kruskal-Wallis H檢驗對各組大鼠腸道中差異菌屬相對豐度進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，與對照組相比，CVA組大鼠腸道中Anaerostipes、Tuzzerella、Incertae_Sedis、Pygmaiobacter、Defluviitaleaceae_UCG_011、Sellimonas、Prevotellaceae_Ga6A1_group和Family_XIII_UCG_001豐度明顯升高，而Prevotella、Prevotellaceae_NK3B31_group、Cupriavidus、Anaerovibrio、Eubacterium_ruminantium_group、Butyricicoccus、Gastranaerophilales和Prevotellaceae_UCG_001豐度明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與CVA組相比，EEAP組大鼠腸道中Prevotellaceae_UCG-001、Prevotella、Prevotellaceae_NK3B31_group、Sellimonas、Pygmaiobacter和Eubacterium_ruminantium_group豐度明顯升高，而Anaerostipes、Incertae_Sedis、Anaerovibrio、Prevotellaceae_Ga6A1_group和Cupriavidus豐度明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與CVA組相比，陽性藥組大鼠腸道中Eubacterium_ruminantium_group、Gastranaerophilales、Prevotella和Prevotellaceae_NK3B31_group豐度明顯升高，而Anaerovibrio、Anaerostipes、Family_XIII_UCG-001、Tuzzerella、Cupriavidus和Prevotellaceae_Ga6A1_group豐度明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2和圖3。

表2 各組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)中屬水平的相對豐度比較

圖3 各組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)中屬水平的相對豐度變化

3 討論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群與CVA疾病的發(fā)生發(fā)展關系密切。He等[1]基于“肺與大腸相表里”理論研究枇杷葉水提物治療CVA的作用中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，CVA組小鼠腸道Lactobacillus豐度明顯降低，而Methanobrevibacter，PrevotellaceaeUCG-003，RikenellaceaeRC9gutgroup，Escherichia-Shigella，PrevotellaceaeGa6A1group，Clostridiumsensustricto1，OscillibacterandAlloprevotella豐度明顯增加，其中PrevotellaceaeGa6A1group豐度與肺中限制細胞外基質(zhì)沉積代謝主要限速酶基質(zhì)金屬肽酶9表達呈現(xiàn)正相關，上述研究說明CVA小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡，并與CVA發(fā)生發(fā)展呈現(xiàn)相關性。王梅芬等[10]發(fā)現(xiàn)，Prevotella豐度在哮喘小鼠腸道中明顯降低。Prevotella在哮喘患者肺部微生物群中的豐度明顯降低，該菌屬可介導黏膜炎癥反應，并通過激活TOLL樣受體2和上皮細胞產(chǎn)生細胞因子，從而增強T輔助17型(Th17)免疫反應[11]。腸道中的Prevotellaceae-UCG-001h和Prevotellaceae_NK3B31_group豐度升高可促進短鏈脂肪酸的生產(chǎn)，發(fā)揮保護腸道黏膜屏障，改善腸道功能，緩解炎癥反應[12-13]。上述研究提示Prevotella、PrevotellaceaeGa6A1group、Prevotellaceae-UCG-001h和Prevotellaceae_NK3B31_group可能參與炎癥反應影響呼吸系統(tǒng)疾病的進展。此外，Butyricicoccus是腸道中可產(chǎn)生短鏈脂肪酸，尤其是丁酸，具有抑制炎癥因子產(chǎn)生的作用，該菌的豐度可被黃連素和二甲雙胍促進，并發(fā)揮改善高脂誘導糖脂代謝紊亂[14]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，EEAP具有抗炎、抗氧化的作用，可降低CVA患者淋巴細胞IL-13、IL-5及TNF-α水平，同時降低CVA大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞、白細胞計數(shù)和血清TNF-α水平[15]。本研究選取前期研究中改善CVA癥狀及抑制血清炎癥因子水平最佳的EEAP高劑量組進行腸道菌群結(jié)構(gòu)分析，從腸道微環(huán)境挖掘EEAP可能的作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，CVA組在腸道菌群結(jié)構(gòu)中Prevotellaceae_Ga6A1_group豐度明顯升高，而Prevotella、Prevotellaceae_NK3B31_group、Prevotellaceae-UCG-001h和Butyricicoccus豐度明顯降低；EEAP和醋酸潑尼松可明顯升高CVA大鼠腸道中Prevotella、Prevotellaceae_NK3B31_group豐度，降低Prevotellaceae_Ga6A1_group豐度；EEAP還可明顯升高CVA大鼠腸道中Prevotellaceae-UCG-001h。PCoA法分析中發(fā)現(xiàn)對照組與CVA組樣本完全分開，NMDS法分析中發(fā)現(xiàn)EEAP和陽性藥組與CVA組樣本分開，且EEAP和陽性藥組樣本較為接近。本研究結(jié)果提示，腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡與CVA存在相關性，EEAP可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制炎癥反應，從而發(fā)揮改善CVA的作用。此外，EEAP在調(diào)節(jié)腸道細菌譜方面與醋酸潑尼松存在相似，但差異菌屬在發(fā)揮改善CVA的作用機制還需進一步研究。