16周HIIT干預(yù)對增齡大鼠骨骼肌線粒體自噬、ATP濃度及有氧運動能力的影響

蔣中業(yè)，曹國歡，張一民，倪 震，溫天皓，邵 佳，蘇 浩

骨骼肌增齡性退變所引起的活動能力受限是導(dǎo)致中老年人群生活質(zhì)量下降、運動過程中出現(xiàn)異常的重要原因之一。線粒體作為ATP合成的場所，線粒體自噬對維持健康線粒體數(shù)目和能量代謝穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要（李淵芳等，2019）。有研究表明，隨著大鼠年齡增長，其機(jī)體內(nèi)線粒體數(shù)目較年輕時顯著減少（陳彩珍等，1999；何宏文等，1998；Davies et al.，1981）。增齡過程中，線粒體的損傷以及抗氧化能力下降會引起氧自由基的累積從而誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生（Dadakhujaev et al.，2009）和線粒體功能受損，導(dǎo)致骨骼肌局部能量不足，致使受影響的肌纖維局部萎縮，引起衰老時出現(xiàn)的肌纖維丟失（Lang et al.，2010，1993），進(jìn)而推進(jìn)骨骼肌增齡性退變的進(jìn)程（Fulle et al.，2004，2005）。

BNIP3是存在于哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的部分線粒體標(biāo)記蛋白，在線粒體自噬調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用（Ney，2015）。PI3-k具有絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性。BNIP3和PI3-k為反映線粒體自噬的指標(biāo)（楊春蘭等，2017；Ney，2015），通過其表達(dá)量的變化可以有效判斷機(jī)體線粒體自噬發(fā)生的程度。

有研究表明，運動鍛煉對大鼠機(jī)體內(nèi)線粒體數(shù)目的減少具有良性作用（Schmalbruch，1970）。高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練（high-intensity interval training，HIIT）作 為 一 種 短時（Bartlett et al.，2011）、高效（嚴(yán)翊 等，2012）的訓(xùn)練方式，可以有效提升最大攝氧量（maximal oxygen consumption，O2max）（梁春瑜等，2017）和運動能力（崔新雯等，2018；范朋琦等，2018）。雖然當(dāng)前已有采用HIIT干預(yù)骨骼肌增齡性退變的相關(guān)研究，且在前期研究中已證實HIIT運動能對大鼠增齡過程中能量代謝相關(guān)AMPK和PGC-1α蛋白產(chǎn)生良性影響（蔣中業(yè)等，2019），但目前HIIT干預(yù)對大鼠增齡過程中線粒體自噬、ATP合成能力和機(jī)體有氧運動能力的影響以及上述各指標(biāo)間的變化關(guān)系尚不明確。

本研究通過建立增齡大鼠模型，并對其進(jìn)行HIIT干預(yù)，觀察大鼠增齡過程中機(jī)體有氧能力、線粒體中ATP濃度和丙酮酸脫氫酶活性、骨骼肌中線粒體數(shù)目和自噬體數(shù)目、骨骼肌線粒體BNIP3和PI3-k相對表達(dá)量的變化規(guī)律。探究增齡過程中大鼠線粒體自噬和有氧運動能力的關(guān)系及HIIT干預(yù)對線粒體自噬和有氧運動能力的作用效果。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象及分組

本研究選取8月齡SPF級雄性Wistar大鼠40只（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），按照隨機(jī)數(shù)字表將大鼠隨機(jī)分為安靜對照組（C，n=20，平均體質(zhì)量為602.78 g）和HIIT干預(yù)組（H，n=20，平均體質(zhì)量為585.86 g）。

1.2 實驗方案

1.2.2 運動訓(xùn)練方案

所有大鼠進(jìn)入動物房后進(jìn)行為期1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，各組運動干預(yù)方案為：C組不進(jìn)行運動；H組根據(jù)O2max測試結(jié)果重新調(diào)整運動強(qiáng)度。根據(jù)大鼠達(dá)到O2max時的跑臺運動速度確定HIIT運動方案進(jìn)行為期16周的訓(xùn)練，每天訓(xùn)練50 min，每周訓(xùn)練5天。每天的訓(xùn)練內(nèi)容參照王林佳等（2016）的HIIT訓(xùn)練方案進(jìn)行改良（表1）。

表1 HIIT組訓(xùn)練方案Table 1 The Training Program of HIIT

1.3 取材

稱量大鼠體質(zhì)量后采用2%戊巴比妥鈉（劑量為0.25～0.50 g/kg）腹腔注射麻醉大鼠，隨后固定其四肢及頭部，取部分新鮮比目魚肌進(jìn)行線粒體提取后用于ATP濃度和丙酮酸脫氫酶活性測試。取部分比目魚肌樣品置于包埋劑中保存，用于電鏡拍攝。剩余比目魚肌用錫箔紙包好后投入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存，用于BNIP3和PI3-k的Western blot測試。

1.4 指標(biāo)測試方法

1.4.1 骨骼肌線粒體透射電鏡拍攝

取新鮮大鼠比目魚肌10 mg，2.5%戊二醛于4℃環(huán)境下固定2 h。使用磷酸緩沖液沖洗（pH 7.2）3次，每次10 min。隨后采用1%的鋨酸在4℃環(huán)境下進(jìn)行2 h的固定后使用雙蒸水沖洗3次（每次10 min），再使用梯度酒精脫水，50%、70%、90%的酒精濃度各進(jìn)行10 min，100%濃度進(jìn)行2次，每次15 min。隨后分別使用環(huán)氧丙烷進(jìn)行2次、每次各15 min的操作（環(huán)氧丙烷：樹脂以1∶1和1∶4的比例于室溫環(huán)境下分別置換1 h）。再使用純樹脂于室溫條件下浸透2 h后使用純樹脂進(jìn)行包埋（EPON 812），于45℃、60℃、80℃環(huán)境下進(jìn)行持續(xù)5 h的樣品聚合。聚合成功后對其進(jìn)行半薄切片（使用天青-美蘭染色后光鏡下定位觀察）和超薄切片（使用醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛進(jìn)行染色）。使用JEM-1400電鏡，在2 000倍下觀察不同組大鼠比目魚肌筋膜下的線粒體數(shù)目。使用透射電鏡特殊成像系統(tǒng)（美國）進(jìn)行拍攝。每只大鼠所取樣本制作5張電鏡切片，每張切片隨機(jī)拍攝6張圖片。計數(shù)時只統(tǒng)計視野范圍內(nèi)可見的完整線粒體與自噬體，若出現(xiàn)線粒體或自噬體位于圖像邊緣，未整體進(jìn)入圖片內(nèi)則不予計入，圖片內(nèi)未見自噬體則記為0個。

1.4.2 線粒體提取方法

取質(zhì)量約為50～100 mg的新鮮比目魚肌。在1.5 mL離心管內(nèi)對剪取的組織進(jìn)行稱重。用PBS洗滌1次。把組織放在一個置于冰上的培養(yǎng)皿中，用剪刀把組織剪切成非常細(xì)小的碎片后，加入10倍體積預(yù)冷的PBS，冰浴3 min后置于600 rpm轉(zhuǎn)速離心10～20 s，沉淀樣品，棄上清。再加入8倍體積預(yù)冷的胰酶消化液，冰浴20 min后置于600 rpm轉(zhuǎn)速離心10～20 s，沉淀樣品，棄上清。隨后加入2倍體積相應(yīng)線粒體分離試劑，重懸組織，用于洗去殘余的胰酶。置于600 rpm轉(zhuǎn)速離心10～20 s，沉淀樣品，棄上清。加入8倍體積預(yù)冷的相應(yīng)線粒體分離試劑或臨用前添加了PMSF的線粒體分離試劑，冰浴環(huán)境勻漿20～30次，完成后置于600 rpm轉(zhuǎn)速，4℃離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，11 000 rpm轉(zhuǎn)速，4℃離心10 min。去除上清，沉淀即為分離得到的線粒體。

1.4.3 線粒體ATP濃度測試

使用ATP Assay Kit通過比色法進(jìn)行比目魚肌線粒體ATP濃度測試（Ab-83355）：采用試劑盒所提供標(biāo)準(zhǔn)液制備工作標(biāo)準(zhǔn)液。用100 μL ATP Assay Buffer使樣本懸浮混勻。在4℃低溫離心機(jī)中使用最高轉(zhuǎn)速離心2 min以除去所用不溶性物質(zhì)。取上清液，在每個標(biāo)準(zhǔn)和樣本孔中都加入50 μL Reaction Mix。在每個樣本背景控制孔中加入50 μL背景反應(yīng)混合溶液。在室溫下避光混合和孵化30 min后用酶標(biāo)儀在OD 570 nm下進(jìn)行測量。

1.4.4 丙酮酸脫氫酶活性測試

使用丙酮酸脫氫酶活性測試試劑盒（Ab-109902）進(jìn)行比目魚肌線粒體丙酮酸脫氫酶濃度測試：在樣品溶解前測量樣品的蛋白含量，制備相應(yīng)濃度的PDH。冰上孵育10 min后置于5 000 rpm轉(zhuǎn)速4℃離心10 min，提取上清液，用孵育液將所有樣本稀釋后向每個孔中加入樣本200 μL，室溫孵育3 h后將測試孔中內(nèi)容物甩出，迅速加入300 μL穩(wěn)定液和200 μL 1X Detector Antibody。室溫孵育1 h后，將測試孔中內(nèi)容物甩出，迅速加入300 μL穩(wěn)定液和200 μL 1X HRP La‐bel，室溫孵育1 h后再向每孔迅速加入200 μL HRP Develop‐ment solution后置于酶標(biāo)儀中進(jìn)行測試。以100 mg/min蛋白變化0.01 OD為1個酶活力單位/（a.u.）。

1.4.5 骨骼肌WB測試方法

WB測試所用一抗為：Anti-PI3-k，Ab40776；Anti-BNIP-3 Ab109362。WB測試方法與前期研究一致（蔣中業(yè)等，2019）。大鼠O2max和力竭時長在每2周1次的O2max測試中獲得。

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

采用Image Lab 5.2對WB測試所得蛋白相對含量數(shù)據(jù)進(jìn)行采集；條帶分析中，以基線值作為參考對照，運用Image Lab 5.2對條帶進(jìn)行灰度分析，得到各樣本蛋白含量的相對值；所有結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式。

由于每組大鼠來源于同一總體，基因條件以及生活環(huán)境一致，因此每組大鼠的隨機(jī)抽樣取材均可作為對該組的重復(fù)測量，所得各組大鼠的O2max、力竭時間、BNIP3和PI3-k相對表達(dá)量及線粒體丙酮酸脫氫酶活性及ATP濃度數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，組內(nèi)兩兩對比采用單因素方差分析進(jìn)行處理，組間比較采用配對樣本t檢驗，P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

2 研究結(jié)果

2.1 HIIT對大鼠遞增負(fù)荷運動至力竭時長的影響

16周的增齡過程中，C組大鼠遞增負(fù)荷運動至力竭的時長在第8周和16周時顯著低于基線值（P＜0.05，P＜0.05）；H組在第8周和16周時大鼠遞增負(fù)荷運動至力竭的時長顯著高于基線值（P＜0.01，P＜0.05；表2）。

表2 大鼠力竭時間結(jié)果Table 2 Results of Exhaustion Time of Rats s

2.2 HIIT對大鼠O2max的影響

16周自然增齡使大鼠的V?O2max顯著降低（P＜0.05）。持續(xù)8周和16周的HIIT干預(yù)可以使增齡大鼠的O2max相比于基線值顯著提高（P＜0.01，P＜0.01），且16周時相比于第8周顯著升高（P＜0.05）。H組在8周和16周時均顯著高于C組（P＜0.01，P＜0.01；表3）。

表3 大鼠O2max結(jié)果Table 3 Results of O2maxof Rats ml·kg-1·h-1

表3 大鼠O2max結(jié)果Table 3 Results of O2maxof Rats ml·kg-1·h-1

注：**表示與C組相比有極顯著性差異（P＜0.01）；&表示與第8周時相比有顯著性差異（P＜0.05）；下同。

H組2 768.67±628.74 2 705.44±477.36 2 784.67±519.18 3 250.63±489.58 3 469.11±386.43**##3 508.22±279.82 3 460.94±418.68 3 716.61±717.14 3 907.22±575.58**##&時間基線值第2周第4周第6周第8周第10周第12周第14周第16周C組2 751.74±572.99 2 607.89±522.18 2 410.89±315.88 2 236.06±375.61 1 988.95±521.57 1 905.98±311.12 1 772.06±422.68 1 684.56±478.61 1 446.52±319.15#

2.3 HIIT對大鼠比目魚肌線粒體丙酮酸脫氫酶活性與ATP濃度的影響

16周增齡過程中各組大鼠丙酮酸脫氫酶活性無明顯變化，且8周和16周時的組間對比中無顯著差異（表4）。

表4 丙酮酸脫氫酶活性比較Table 4 Results of Pyruvate Dehydrogenase Activity a.u.

16周增齡過程中，C組比目魚肌線粒體ATP濃度呈先升后降的趨勢，H組呈上升趨勢（表5）。16周時，H組大鼠比目魚肌線粒體ATP濃度顯著高于C組和基線值（P＜0.05，P＜0.05）。

表5 線粒體內(nèi)ATP濃度結(jié)果Table 5 Results of ATP Concentration in Mitochondria nmol·ul-1

2.4 HIIT對大鼠骨骼肌線粒體自噬體數(shù)目的影響

16周過程中各組比目魚肌自噬體數(shù)目呈現(xiàn)上升趨勢（圖1，表6）。16周過程中C組線粒體數(shù)目呈下降趨勢，H組呈上升趨勢（表7）。干預(yù)至第8周時，H組線粒體數(shù)目顯著高于C組（P＜0.05）和基線值（P＜0.05）。干預(yù)至第16周時，H組線粒體數(shù)目顯著高于C組（P＜0.05）和基線值（P＜0.05）。在第8周和第16周時，雖然C組自噬體數(shù)目均多于H組，但各組大鼠在組間和組內(nèi)對比中均未見顯著性差異。

圖1 透射電鏡下比目魚肌自噬體Figure 1.Autophagosome of Soleus Muscle under Transmission Electron Microscope

表6 線粒體自噬體數(shù)目Table 6 Number of Mitochondrial Autophagosomes 個

表7 線粒體數(shù)目Table 7 Numbers of Mitochondrial 個

2.5 HIIT對大鼠骨骼肌BNIP3和PI3-k表達(dá)量的影響

16周過程中C組BNIP3表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢，H組呈現(xiàn)先升后降的趨勢（圖2，表8）。干預(yù)至第8周時，C組BNIP3表達(dá)量顯著高于基線值（P＜0.05）；H組BNIP3表達(dá)量顯著高于基線值（P＜0.01）。干預(yù)至第16周時，C組BNIP3表達(dá)量顯著高于基線值（P＜0.01）；H組BNIP3表達(dá)量顯著高于基線值（P＜0.01）。

圖2 大鼠比目魚肌BNIP3和PI3-k蛋白WB結(jié)果Figure 2.BNIP3 and PI3-k Protein in Soleus Muscle of Rats

表8 BNIP3蛋白表達(dá)量變化Table 8 Changes of BNIP3 Protein Expression

16周增齡過程中，C組大鼠比目魚肌PI3-k蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢，H組呈現(xiàn)先升后降的趨勢（圖2，表9）。第16周時，C組大鼠比目魚肌內(nèi)PI3-k蛋白含量顯著高于基線值（P＜0.05），H組與基線值未見顯著性差異。

表9 PI3-k蛋白表達(dá)量變化Table 9 Changes of PI3-k Protein Expression

3 分析討論

3.1 HIIT對大鼠運動能力和O2max的影響

有研究表明，運動訓(xùn)練可以有效提高骨骼肌線粒體內(nèi)氧化酶活性和ATP合成能力（Short et al.，2003），ATP合成能力的變化對大鼠O2max有一定影響（蔣中業(yè)等，2019）。HIIT延緩大鼠增齡過程中的O2max下降可能是通過影響骨骼肌線粒體來實現(xiàn)的。

3.2 HIIT對大鼠比目魚肌線粒體中丙酮酸脫氫酶活性與ATP濃度的影響

本研究表明，16周增齡過程中，無論是否進(jìn)行HIIT干預(yù)大鼠比目魚肌線粒體內(nèi)丙酮酸脫氫酶濃度均未見明顯變化，說明增齡和HIIT均無法對大鼠比目魚肌線粒體供能能力產(chǎn)生影響。16周增齡過程中大鼠比目魚肌線粒體ATP濃度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，與Short等（2005）的研究結(jié)果一致，且Hepple（2014）研究表明這一現(xiàn)象的發(fā)生早于骨骼肌質(zhì)量的下降。這說明增齡導(dǎo)致大鼠比目魚肌線粒體ATP濃度降低。16周HIIT干預(yù)使大鼠比目魚肌線粒體中的ATP濃度升高，并且在16周時顯著高于自然增齡大鼠。這說明16周的HIIT運動對大鼠增齡過程中比目魚肌ATP濃度具有顯著的促進(jìn)作用，結(jié)合大鼠線粒體數(shù)目的變化，本研究認(rèn)為，大鼠比目魚肌ATP濃度變化可能與線粒體數(shù)目變化有關(guān)。第8周時兩組大鼠線粒體ATP濃度未見顯著性差異，可能是由于骨骼肌線粒體中ATP濃度與線粒體氧化酶活性（陳雅維，2020；Safdar et al.，2010；Short et al.，2003）有關(guān)，線粒體氧化酶活性變化與線粒體數(shù)目變化在16周增齡及HIIT干預(yù)過程中不同步所致，也可能是因為隨著大鼠年齡的增長，短期的運動鍛煉難以使其線粒體功能得到有效改善，此現(xiàn)象出現(xiàn)的原因仍需進(jìn)一步探索。

在16周增齡過程中，大鼠ATP濃度和線粒體數(shù)目出現(xiàn)顯著性差異，而線粒體ATP合成能力無明顯變化。因此，推測比目魚肌線粒體ATP濃度的變化與線粒體自噬以及線粒體數(shù)目變化密切相關(guān)（Chiao et al.，2016）。

3.3 HIIT對大鼠比目魚肌線粒體BNIP3和PI3-k的影響

BNIP3是存在于哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的一些線粒體標(biāo)記蛋白，可通過直接與LC3結(jié)合（Ney，2015），競爭Beclin-1與Bcl-2/Bcl-xl的結(jié)合（Maiuri et al.，2009；Zeng et al.，2013），減少線粒體磷酸化和ATP含量（徐冉等，2013）等途徑引起線粒體自噬。BNIP3的表達(dá)與自噬的激活呈正相關(guān)關(guān)系。崔迪（2013）研究表明，6周跑臺運動使小鼠腓腸肌BNIP3表達(dá)量出現(xiàn)上升趨勢。4周中等強(qiáng)度運動可以使大鼠骨骼肌BNIP3表達(dá)量升高同時誘導(dǎo)線粒體自噬增強(qiáng)（于亮等，2020）。杜濤等（2014）在脂多糖調(diào)控巨噬細(xì)胞自噬的研究中分別阻斷PI3-k和mTOR，發(fā)現(xiàn)BNIP3表達(dá)量的升高均伴隨著自噬增強(qiáng)。本研究證實，16周的自然增齡和HIIT干預(yù)均會使大鼠比目魚肌BNIP3表達(dá)量升高，且相較于自然增齡，HIIT干預(yù)使得大鼠增齡過程中比目魚肌BNIP3表達(dá)量升高出現(xiàn)得更早、更明顯。這說明在16周增齡過程中，HIIT運動可能通過調(diào)控BNIP3的表達(dá)促進(jìn)了大鼠增齡過程中線粒體自噬的發(fā)生。

PI3-k作為反映線粒體自噬和凋亡的重要下游指標(biāo)，其經(jīng)過PI3-k/AKT/mTOR途徑激活A(yù)KT和mTOR（舒婷等，2016；Rodon et al.，2013；Zhang et al.，2016；Zhao et al.，2015），抑制自噬。有研究表明，抗阻和有氧等多種運動形式均可通過調(diào)控PI3-k途徑有效影響機(jī)體自噬的發(fā)生：抗阻運動（房國梁等，2016）和耐力運動（李鋒等，2018）可以上調(diào)腦組織中PI3-k的表達(dá)，有效提升老年大鼠心肌PI3-k的表達(dá)（謝金鳳，2020），并對下游底物產(chǎn)生積極影響進(jìn)而調(diào)控自噬的激活；有氧運動可以上調(diào)大鼠和小鼠骨骼肌中PI3-k的表達(dá)（劉霞等，2012），使骨骼肌自噬減弱（樊申元等，2016）；間歇運動可以通過上調(diào)心肌PI3-k/Akt途徑抑制心肌細(xì)胞自噬與凋亡（譚支內(nèi)等，2016）。然而本研究顯示，16周的自然增齡和HIIT干預(yù)中PI3-k的升高趨勢雖然與上述研究結(jié)果相同，但是各組之間并未出現(xiàn)與其一致的顯著性差異。推測出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是上述研究中大部分使用的研究對象為6～8周齡的青年大鼠或21月齡的衰老大鼠模型，且均使用某一固定方案進(jìn)行運動干預(yù)，而本研究中大鼠HIIT干預(yù)的運動強(qiáng)度根據(jù)每2周1次的O2max測試結(jié)果進(jìn)行調(diào)整，隨著大鼠年齡增長，HIIT干預(yù)中的高強(qiáng)度階段較大強(qiáng)度的運動刺激了線粒體自噬的發(fā)生（馬曉雯等，2016），此現(xiàn)象出現(xiàn)的原因仍需進(jìn)一步研究探索。

雖然本研究中各組大鼠的BNIP3和PI3-k變化結(jié)果均表明大鼠比目魚肌線粒體自噬產(chǎn)生了變化，電鏡下觀察的自噬體數(shù)目也出現(xiàn)了增多的趨勢，但各組大鼠比目魚肌自噬體數(shù)目未出現(xiàn)顯著性差異，推測可能是由于取材前的O2max測試強(qiáng)度較大，引起各組大鼠骨骼肌線粒體發(fā)生一過性自噬增強(qiáng)所致（高揚等，2020）。因此，在未來的研究中應(yīng)避免大鼠在取材前72 h內(nèi)進(jìn)行劇烈運動。

綜上所述，16周HIIT干預(yù)使大鼠比目魚肌線粒體數(shù)目增多，ATP濃度升高，機(jī)體有氧運動能力增強(qiáng)。同時，相比自然增齡大鼠，16周HIIT干預(yù)對大鼠比目魚肌線粒體自噬激活程度影響更大。線粒體丙酮酸脫氫酶活性無明顯變化，可以一定程度上說明線粒體ATP濃度的增加與線粒體數(shù)目變化有關(guān)。因此，本研究結(jié)合李淵芳等（2019）提出的自噬是調(diào)控線粒體數(shù)目的重要方式的觀點，推測HIIT干預(yù)使大鼠健康線粒體數(shù)目增多以及ATP合成能力增強(qiáng)是通過調(diào)控大鼠增齡過程中的自噬以及線粒體合成實現(xiàn)的。

4 結(jié)論