青島地區(qū)雞源大腸埃希氏菌的分離鑒定及耐藥性分析

任海燕，劉旭東，趙 莉，郝智慧，劉志海*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100089；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島 266109)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)是一種常見(jiàn)的革蘭氏陰性細(xì)菌，它具有分布面廣、分離率高、傳播途徑多樣等特點(diǎn)。在畜禽養(yǎng)殖和人類生活中，大腸埃希氏菌常通過(guò)糞便排泄等傳播途徑造成人類或動(dòng)物細(xì)菌性疾病。最易引起大腸桿菌病，病原為禽致病性大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)[1]，包括引起皮膚、生殖系統(tǒng)和普通呼吸道(氣囊炎)感染以及嚴(yán)重的心包炎、肝周炎、輸卵管炎、臍炎、敗血癥等。這些疾病的發(fā)生，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展造成了巨大的阻礙[2]。大腸埃希氏菌作為耐藥基因及質(zhì)粒傳播的載體，已經(jīng)成為耐藥基因傳播擴(kuò)散的儲(chǔ)存庫(kù)，導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥譜范圍不斷擴(kuò)大，多重耐藥形勢(shì)愈加嚴(yán)峻，這給該菌引起的感染性疾病防治帶來(lái)了困難與挑戰(zhàn)[3]；更嚴(yán)重的是，現(xiàn)有研究表明畜禽源耐藥大腸埃希氏菌正在通過(guò)從養(yǎng)殖場(chǎng)到餐桌的食物鏈條傳遞給人類，給人類健康安全帶來(lái)了威脅。山東作為禽肉產(chǎn)業(yè)大省，畜禽養(yǎng)殖數(shù)量大，患病風(fēng)險(xiǎn)高，同時(shí)由于抗菌藥物的不規(guī)范使用，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題愈發(fā)嚴(yán)重。因此，了解山東青島地區(qū)禽源大腸埃希氏菌的細(xì)菌耐藥現(xiàn)狀和流行特點(diǎn)，對(duì)疾病防治具有重要意義。本研究以2019年11月在青島養(yǎng)殖場(chǎng)中采集的185份雞泄殖腔拭子作為研究對(duì)象，通過(guò)細(xì)菌分離鑒定、藥敏試驗(yàn)、耐藥基因檢測(cè)等試驗(yàn)，對(duì)分離的173株菌株進(jìn)行耐藥流行特點(diǎn)分析，研究結(jié)果對(duì)獸醫(yī)臨床指導(dǎo)用藥、預(yù)防和控制雞源大腸桿菌病具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 采集山東省青島地區(qū)某規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)雞泄殖腔拭子共185份，藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株(標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922)，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 麥康凱、Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；2×TaqMaster Mix(Dye Plus)、DNA Marker(DL 2 000)，南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品；Gold view核酸染料，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；亞胺培南(imipenem,IMP)、美羅培南(meropenem,MEM)、阿莫西林(amoxicillin,AMX)、頭孢氨芐(cefalexin,CN)、頭孢他啶(ceftazidime,CAZ)、頭孢噻肟(cefotaxime,CTX)、頭孢吡肟(cefepime,FEP)、多黏菌素E(colistin,CT)、四環(huán)素(tetracycline,TCY)、替加環(huán)素(tigecycline,TGC)、慶大霉素(gentamicin,GEN)，武漢威得利化學(xué)科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 PCR儀、凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；WGZ-2XJ細(xì)菌濁度儀，上海昕瑞儀器儀表有限公司產(chǎn)品；G180DS立式高壓蒸汽滅菌器，致微(廈門)儀器有限公司產(chǎn)品；Blue pard生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離及種屬鑒定 2019年9月至12月期間，隨機(jī)采集雞泄殖腔拭子樣本185份。將樣品置于LB肉湯中，37 ℃孵育18 h，再劃線于麥康凱培養(yǎng)基上，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)16 h～24 h后，挑選單克隆(粉紅色可疑菌落)富集培養(yǎng)，純化后菌株采用煮沸法提取細(xì)菌DNA模板，通過(guò)16S rRNA，PCR擴(kuò)增后，將陽(yáng)性產(chǎn)物送去測(cè)序，結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)鑒定。16S rRNA引物為27F:5′-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3′，目的片段長(zhǎng)度約1 500 bp。PCR 反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 5min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)；(72 ℃5 min。運(yùn)行反應(yīng)體系為30 μL：DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq聚合酶15 μL，ddH2O補(bǔ)齊至30 μL。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的判定標(biāo)準(zhǔn)[4]，使用瓊脂稀釋法測(cè)定11種抗菌藥物對(duì)大腸埃希氏菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，以大腸埃希氏菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌株。

1.2.3 耐藥基因檢測(cè) 對(duì)分離得到的173株大腸埃希氏菌用PCR檢測(cè)5類共23種常見(jiàn)耐藥基因，分別為碳青霉烯類(blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaKPC)；β-內(nèi)酰胺類(blaCTX-M)；AmpC-β內(nèi)酰胺酶類(blaDHA、blaACC)；黏菌素類(mcr-1～5)和四環(huán)素類(tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetK、tetM、tetO、tetQ、tetX)，引物信息根據(jù)表1參考文獻(xiàn)中對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)條件，確定瓊脂糖凝膠電泳條件(瓊脂糖濃度、電壓及運(yùn)行時(shí)間等)，PCR產(chǎn)物在凝膠成像系統(tǒng)上觀察記錄條帶位置并拍照。

表1 耐藥基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希氏菌分離鑒定結(jié)果

185份泄殖腔拭子樣本在麥康凱培養(yǎng)基上分離純化，將疑似樣本經(jīng)16S rRNA測(cè)序比對(duì)后，共分離出173株大腸埃希氏菌,分離率為93.50%。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

173株大腸埃希氏菌對(duì)11種抗菌藥物的藥物敏感性結(jié)果顯示，所有分離株對(duì)阿莫西林、頭孢氨芐和四環(huán)素均耐藥，耐藥率100.00%；對(duì)頭孢吡肟、頭孢噻肟、慶大霉素、多黏菌素E和頭孢他啶耐藥率較高，依次為84.40%(n=146)、83.20%(n=144)、79.80%(n=138)、75.70%(n=131)、61.30%(n=106)；對(duì)亞胺培南、美羅培南和替加環(huán)素的耐藥率相對(duì)較低，分別為9.80%(n=17)、7.50%(n=13)、0.58%(n=1)(圖1)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，所有分離菌株均表現(xiàn)多重耐藥，以耐7種和8種抗菌藥物的菌株為主，占比率分別為22.54%和32.94%，最多耐10種抗菌藥物(7.51%)(表2)。

表2 173株大腸埃希氏菌多重耐藥情況

圖1 173株大腸埃希氏菌耐藥結(jié)果

2.3 耐藥基因檢測(cè)

173株大腸埃希氏菌對(duì)5類23種抗菌藥物耐藥基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。碳青霉烯類耐藥基因blaNDM檢出率為7.50%(13/173)；β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaCTX-M檢出率為96.00%(166/173)；AmpC-β內(nèi)酰胺酶類耐藥基因blaACC檢出率較低，為4.60%(8/173)；四環(huán)素類耐藥基因tetA檢出率高達(dá)90.80%(157/173)，其次為tetM和tetB，檢出率依次為15.30%(26/173)和3.50%(6/173)；黏菌素類耐藥基因mcr-1檢出率為37.90%(66/173)，其他耐藥基因均未檢測(cè)出，分離菌株部分基因電泳條帶見(jiàn)圖3。

圖2 雞源耐藥大腸埃希氏菌耐藥基因檢出結(jié)果

A.blaACC;B.blaCTX-M;C.blaNDM;D.tetA;E.mcr-1;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;+.陽(yáng)性對(duì)照;-.陰性對(duì)照;1～7.分離菌株

2.4 耐藥基因共存情況分析

檢出的7種耐藥基因在雞泄殖腔中的共存情況見(jiàn)表3，在173株大腸埃希氏菌中，有4個(gè)菌株含有最多5個(gè)耐藥基因，組合形式為tetA-tetM-mcr-1-blaCTX-M-blaACC和tetA-tetM-mcr-1-blaCTX-M-blaNDM，占檢測(cè)樣本的2.31%；有76個(gè)菌株含有2個(gè)耐藥基因，占檢測(cè)樣本43.93%，有72個(gè)菌株含有3個(gè)耐藥基因，占檢測(cè)樣本41.62%，其中tetA-mcr-1-blaCTX-M為最常見(jiàn)耐藥基因組合形式；只含有1種耐藥基因的樣本有11份，為blaCTX-M和tetB，占檢測(cè)樣本的6.36%。

表3 173株大腸埃希氏菌耐藥基因共存情況及耐藥基因譜型

3 討論

本次研究從禽養(yǎng)殖場(chǎng)采集185份拭子，最終分離出大腸埃希氏菌173株(分離率為93.50%)，與先前報(bào)道的山東菏澤地區(qū)雞場(chǎng)分離率96.67%、泰安地區(qū)90.00%結(jié)果基本一致[1]，進(jìn)一步說(shuō)明了山東地區(qū)雞源耐藥大腸埃希氏菌的流行率較高。

藥敏試驗(yàn)顯示，本研究在養(yǎng)雞場(chǎng)分離得到的173株大腸埃希氏菌呈現(xiàn)多重耐藥性，11種抗菌藥物的耐藥率為0.58%～100.00%，耐藥情況較為嚴(yán)重。盲目使用抗菌藥物是造成細(xì)菌耐藥的罪魁禍?zhǔn)祝咕幬飳?duì)病原菌產(chǎn)生選擇性壓力，病原菌耐藥率比例上升。本研究中的所有大腸埃希氏菌呈現(xiàn)多重耐藥，并且菌株主要為7種～8種藥物的多重耐藥，這與秦春芝等[9]表述的多藥耐藥現(xiàn)象一致，耐藥性較為嚴(yán)重的有阿莫西林、頭孢氨芐和四環(huán)素，頭孢吡肟、頭孢噻肟、慶大霉素、多黏菌素E和頭孢他啶的耐藥也比較高，這也與已報(bào)道的河北省肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)和山西病雞禽源大腸埃希氏菌耐藥性研究的結(jié)果較為一致[10-11]，說(shuō)明不同地區(qū)的禽源大腸埃希氏菌的多藥耐藥情況已呈現(xiàn)普遍趨勢(shì)。

此外，禽源大腸埃希氏菌中貯存的耐藥基因，使抗菌藥物的治療效果一再降低[12]。本研究中四環(huán)素類耐藥基因以tetA檢出為主(90.75%)，黏菌素類以mcr-1為主(37.90%)，這與一項(xiàng)青島地區(qū)報(bào)道的結(jié)果相同[13]，表明tetA和mcr-1是造成四環(huán)素類和黏菌素類耐藥的主要原因。mcr-1和碳青霉烯類耐藥基因的共同傳播引起了廣泛關(guān)注，本研究檢測(cè)到了多株mcr-1與blaNDM共存的菌株，先前國(guó)內(nèi)也有報(bào)道檢出了mcr-1+blaNDM的革蘭氏陰性菌，這與我們的結(jié)果也相一致[14-15]。研究中還發(fā)現(xiàn)了1株tetA-tetM-mcr-1-blaCTX-M-blaNDM耐藥基因共存的菌株，3株tetA-tetM-mcr-1-blaCTX-M-blaACC共存菌株，說(shuō)明在同一株菌株中，可存在同時(shí)介導(dǎo)β內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類、黏菌素類、四環(huán)素類的多種耐藥基因，反映了青島地區(qū)雞養(yǎng)殖場(chǎng)中耐藥基因傳播的復(fù)雜性和組合多樣性。另外，tetA-mcr-1-blaCTX-M是本次研究中占比較高的耐藥基因譜，也是其他多種基因組合的基礎(chǔ)基因譜型，這提醒我們?cè)陴B(yǎng)殖場(chǎng)中應(yīng)密切關(guān)注重視這3種基因的流行情況及耐藥情況，從而合理規(guī)范用藥。此次研究對(duì)青島地區(qū)耐藥基因情況進(jìn)行了初步檢測(cè)，為下一步深入探究blaCTX-M和blaNDM具體分型和耐藥傳播機(jī)制提供方向。

針對(duì)本研究結(jié)果，建議不同的養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)大腸埃希氏菌的藥物敏感性應(yīng)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，健全抗菌藥物耐藥監(jiān)測(cè)體系，闡明耐藥基因的儲(chǔ)存和傳播方式，因地制宜的進(jìn)行治療與防范，才能最大程度減少耐藥菌。除此之外，多種藥物聯(lián)合治療，使用中藥制劑與抗菌藥物的交替使用，對(duì)目前防治抗菌藥物單用而產(chǎn)生耐藥性已產(chǎn)生了較好的效果[16-17]。建立大腸埃希氏菌耐藥基因的快速檢測(cè)，及時(shí)跟進(jìn)和豐富不同地區(qū)的耐藥流行數(shù)據(jù)庫(kù)，也是減少禽類疾病發(fā)生的重點(diǎn)手段之一。