響應面法優(yōu)化‘雙紅’山葡萄花青素提取工藝

杜月嬌，秦宇婷

（1.長春工程學院，吉林長春 130000；2.吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，吉林長春 130000）

花青素（Anthocyanins）屬多羥基酚類化合物，是植物根、莖、葉及果實的主要呈色物質(zhì)[1]。山葡萄（Vitis amurensisRupr.）屬葡萄科葡萄屬，是我國東北地區(qū)釀造葡萄酒的主要原料[2]。山葡萄富含花青素、有機酸、維生素等營養(yǎng)成分[3]。趙權(quán)[4]在‘雙紅’山葡萄中檢測到13種花色苷。山葡萄花青素安全無毒、資源豐富，能降低癌癥、冠心病、糖尿病等疾病的發(fā)病率，市場應用前景廣闊[5]。但目前關(guān)于‘雙紅’山葡萄花青素提取工藝的優(yōu)化研究鮮有報道，且現(xiàn)有報道中的優(yōu)化方法較為單一[6-7]。本試驗以‘雙紅’山葡萄為原料，通過響應面試驗優(yōu)化花青素提取工藝參數(shù)，為‘雙紅’山葡萄色素的進一步純化及開發(fā)利用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘雙紅’山葡萄由吉林省通化市葡萄酒研究所提供，凍果，備用。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（美國Chromadex公司）；氫氧化鈉（天津市光復科技發(fā)展有限公司）；無水乙醇、濃鹽酸，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B-D振蕩培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；LXJ-IIB低速大容量多管離心機（上海安亭科學儀器廠）；T6新世紀紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；RE 5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；FD-B-50冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；HD-21-2紫外檢測儀（上海青浦瀘西儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 浸提法提取‘雙紅’花青素

文獻[8]報道酸化乙醇可提高花青素的溶出率，故本試驗選擇經(jīng)1%鹽酸酸化的乙醇溶液為提取劑。將‘雙紅’山葡萄解凍，去梗，除雜，用打漿機打成漿狀，稱取一定量雙紅漿液，以一定的液料比加入酸化乙醇提取劑，于一定溫度下，100 r·min-1提取30 min，以 4 000 r·min-1離心 10 min，取上清液在535 nm波長處測定吸光度。

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

分別設(shè)定液料比為3∶1、4∶1、5∶1、6∶1和7∶1（mL∶g），浸提溫度為45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃和65 ℃，提取劑為1%鹽酸-50%乙醇、1%鹽酸-55%乙醇、1%鹽酸-60%乙醇、1%鹽酸-65%乙醇和1%鹽酸-70%乙醇，以花青素提取液吸光度為評價指標，研究不同液料比、浸提溫度、酸化乙醇體積分數(shù)對‘雙紅’花青素提取效果的影響。

1.3.3 響應面優(yōu)化試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行響應面試驗設(shè)計，因素水平見表1，利用Design-Expert 7.1.3.1軟件對數(shù)據(jù)進行分析，得出浸提‘雙紅’花青素的最佳工藝條件。

表1 響應面試驗因素及水平表

1.3.4 花青素含量測定

參考文獻[9]，精確稱取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準品5 mg，用1%鹽酸-80%乙醇（15∶85，V/V）混合液溶解并定容至5 mL，配制成1 mg·mL-1的標準溶液，測定該標準溶液在535 nm波長處的吸光度A標。

式中：X為‘雙紅’花青素含量，g/100 g；A樣為樣品溶液吸光值；V樣為樣品溶液總體積，mL；C標為標準溶液濃度，mg·mL-1；A標為標準溶液吸光值；M樣為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 液料比對‘雙紅’花青素提取效果的影響

由圖1可知，液料比在3∶1～5∶1（mL∶g）時，花青素提取液吸光度呈上升趨勢；液料比為5∶1（mL∶g）時，吸光度達到最大值0.714±0.009，此時物料與溶劑充分接觸，花青素溶解量達到最大。因此，選擇液料比為4∶1、5∶1、6∶1（mL∶g）進行響應面試驗。

圖1 液料比對花青素提取效果的影響圖

2.1.2 浸提溫度對‘雙紅’花青素提取效果的影響

由圖2可知，當溫度升至55 ℃時，花青素提取液吸光度達到最大，溫度繼續(xù)升高，吸光度反而呈下降趨勢，可能是溫度過高會引起花青素的降解，導致提取效果下降[10]。因此，選擇浸提溫度為50 ℃、55 ℃、60 ℃進行響應面試驗。

圖2 浸提溫度對花青素提取效果的影響圖

2.1.3 酸化乙醇體積分數(shù)對‘雙紅’花青素提取效果的影響

由圖3可知，當酸化乙醇體積分數(shù)為60%時提取液吸光度達到最大，繼續(xù)增加酸化乙醇體積分數(shù)吸光度呈現(xiàn)下降趨勢，可能是乙醇體積分數(shù)升至一定水平后會導致其他醇溶性雜質(zhì)溶出，阻礙花青素的浸出，導致提取效果下降[11]。因此，選擇1%鹽酸-55%乙醇、1%鹽酸-60%乙醇、1%鹽酸-65%乙醇為提取劑進行響應面試驗。

圖3 酸化乙醇體積分數(shù)對花青素提取效果的影響圖

2.2 響應面優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應面試驗結(jié)果及方差分析

對液料比（A）、浸提溫度（B）及酸化乙醇體積分數(shù)（C）采用3水平的Box-Behnken試驗設(shè)計及分析方法進行提取條件的優(yōu)化，試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。利用Design-Expert 7.1.3軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行線性擬合，獲得花青素提取液吸光度（Y）對液料比（A）、浸提溫度（B）、酸化乙醇體積分數(shù)（C）的二次回歸模型方程為Y=0.71+0.040A+0.024B+0.004C+0.0015AB+0.0025AC-0.011BC-0.054A2-0.063B2+0.0045C2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果表

回歸方程的方差分析結(jié)果見表3?；貧w模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（0.208 6＞0.05），表明回歸方程擬合程度良好，未知因素對試驗模型影響較?。粵Q定系數(shù)R2=0.991 3，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.980 0，均說明該模型可信度較高；R2Pred=0.905 4，說明該模型預測性良好。從F值可知，以上3因素對花青素提取效果影響的順序為A液料比＞B浸提溫度＞C酸化乙醇體積分數(shù)。

表3 回歸模型方差分析表

2.2.2 響應曲面分析結(jié)果

利用Design-Expert 7.1.3.1軟件得到不同因素交互作用響應曲面及等高線圖，響應曲面圖的陡峭程度可反映交互作用強弱[12]。由圖4（c）可知，浸提溫度與酸化乙醇體積分數(shù)的響應曲面較陡峭，呈馬鞍狀，表明以上兩因素的交互作用對花青素提取效果影響顯著。由圖4（a）、圖4（b）可知，液料比與浸提溫度、液料比與酸化乙醇體積分數(shù)響應曲面圖坡度較平緩，表明兩因素交互作用對花青素提取效果影響不顯著。

圖4 各交互因素對花青素提取效果影響的響應面及等高線圖

2.2.3 最佳工藝條件及驗證

經(jīng)Design-Expert 7.1.3.1分析得到的花青素的最佳提取工藝條件為液料比5.5∶1.0（mL∶g）、浸提溫度55 ℃、用1%鹽酸-65%乙醇溶液浸提30 min，預測花青素提取液吸光度為0.724，預測花青素含量為0.243 g/100 g。進行3次平行試驗，花青素提取液吸光值為0.72±0.003，含量為（0.240±0.005） g/100 g，與預測值接近，說明此模型有效且優(yōu)化結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

本研究表明，浸提‘雙紅’花青素最佳工藝條件為1%鹽酸-65%乙醇為提取劑，料液比5.5∶1.0（mL∶g）、浸提溫度55 ℃、浸提時間30 min。該條件下‘雙紅’花青素預測含量為0.243 g/100 g，實際含量為（0.240±0.005） g/100 g，二者無明顯差異。