蒲公英根多糖提取工藝優(yōu)化研究

劉天嬌，王偉男，黃伊慧，靳澤玉，樸 璨，王安琪

（長(zhǎng)春人文學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130117）

蒲公英（Taraxacum mongolicumHand.-Mazz.），菊科，蒲公英屬，多年生草本植物。其性味為苦、甘、寒，歸肝經(jīng)、胃經(jīng)，有利尿、緩瀉、利膽和退黃疸等功效[1]。蒲公英中的重要組分是多糖類(lèi)，其含量達(dá)到30%～50%，在降血糖、提升免疫力、消炎、延緩衰老、抗病毒和抗癌等方面發(fā)揮著重要活性作用[2]。多糖提取是制備飲品的前提，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)得知多糖提取的方法有很多，如水醇法、酶消化法、超聲波萃取法、超濾法、離子交換技術(shù)、酸提法和凝膠柱層析法等[3]。國(guó)內(nèi)對(duì)多糖提取有豐富的經(jīng)驗(yàn)，宋曉勇等[4]采用超聲波輔助提取法提取蒲公英中的多糖成分。張靜等[5]通過(guò)水提醇沉法提取蒲公英根的多糖成分。通過(guò)對(duì)比相關(guān)文獻(xiàn)，從多糖的提取率、所用時(shí)間、溫度、提取次數(shù)及操作者的能力等多方面考慮，本研究選擇熱水浸提法。但多糖在提取過(guò)程中通常含有非必需物質(zhì)，重要的非必需物質(zhì)包括蛋白質(zhì)和色素，不僅影響多糖的活性作用，也是后期多糖分離純化和結(jié)構(gòu)檢測(cè)的一大難題。因此，研究一種脫色和脫蛋白效果較優(yōu)的工藝至關(guān)重要。本研究以蒲公英根為目標(biāo)，以脫色率、脫蛋白率和多糖損失率為參考數(shù)據(jù)，以過(guò)氧化氫和殼聚糖兩種脫色方法以及Sevag法和鹽析法兩種脫蛋白方法的作用結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，探索最有利的蒲公英根多糖初步純化工藝試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒲公英根、石油精、乙醇、無(wú)水酒精、硫酸、丙酮、氯仿-正丁醇、氯化鈣和過(guò)氧化氫。

1.2 蒲公英根多糖的提取方法

1.2.1 蒲公英根多糖的初步提取

清洗蒲公英根，晾干，用破碎機(jī)磨成細(xì)末，過(guò)5號(hào)篩備用。用濾紙包好蒲公英粉末，放入索式提取器，將石油醚倒入索氏提取器中且沒(méi)過(guò)濾紙包靜置浸泡1.5 h，再用80 ℃的石油精回流脫脂1.5 h。風(fēng)干脫脂后的濾紙包，用80 ℃的調(diào)溫電加熱套使90%乙醇回流1.5 h，以除去樣品中的單糖、寡糖以及其他物質(zhì)。各取1 g吹干回流后的濾紙包粉末，進(jìn)行單因素及正交試驗(yàn)。熱水浸提后的溶液用分光光度計(jì)測(cè)量。波長(zhǎng)設(shè)置為492 nm，分光光度計(jì)測(cè)量時(shí)用蒸餾水作對(duì)照，使用方法為苯酚-濃硫酸法。打開(kāi)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀按鈕，調(diào)整轉(zhuǎn)速，待蒸餾瓶?jī)?nèi)有提取液液滴均勻落下時(shí)，旋蒸開(kāi)始，對(duì)提取液進(jìn)行濃縮。

1.2.2 脫色及脫蛋白

（1）過(guò)氧化氫的脫色。將稱取后的蒲公英根多糖放進(jìn)蒸餾水中溶解，按正交試驗(yàn)方案進(jìn)行脫色。

（2）殼聚糖的脫色。將稱取后的蒲公英根多糖放入蒸餾水中溶解，按照正交試驗(yàn)方案加入不同體積的殼聚糖，攪拌、靜置、離心。

（3）鹽析法。取適量脫色后的蒲公英根多糖溶液，調(diào)節(jié)pH值，加入氯化鈣粉末至溶液等電點(diǎn)，攪拌、冷卻、離心，去沉淀，取上清液。

（4）Sevag法。取6份適量脫色蒲公英根粗多糖溶液，脫蛋白6～8次。加入每份多糖溶液1/4體積的Sevag試劑，振蕩、離心，取上層溶液。①醇析：脫蛋白，脫色后，將95%乙醇加入提取液中，4 000 r·min-1離心5 min，沉淀即為粗多糖。②純化：粗多糖在水中重新溶解，透析40 h，95%乙醇沉淀，放入離心機(jī)中，設(shè)定4 000 r·min-1離心10 min，無(wú)水乙醇沉淀、丙酮洗滌3次，干燥，得到精制多糖。

1.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用可見(jiàn)分光光度計(jì)在492 nm處測(cè)量不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]。

1.4 蒲公英根多糖的單因素及正交試驗(yàn)

1.4.1 單因素試驗(yàn)

分別以溫度60 ℃、70 ℃、80 ℃，料液比1∶15、1∶ 20、1∶ 25（g∶mL），時(shí)間 1.5 h、2.0 h、2.5 h做3因素3水平單因素試驗(yàn)。

1.4.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)改進(jìn)的結(jié)果，選取溫度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）3個(gè)因素按L9(33)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)。因素設(shè)計(jì)水平見(jiàn)表1。

表1 蒲公英根多糖提取因素與設(shè)計(jì)表

1.5 蒲公英根多糖脫色與脫蛋白方法比較

1.5.1 蒲公英根多糖脫色對(duì)比

蒲公英根多糖脫色工藝流程：粗多糖→稱重→復(fù)溶→加入脫色劑→脫色→測(cè)定吸光度和多糖含量。在此工藝流程的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)氧化氫法與殼聚糖法比較。

1.5.2 蒲公英根多糖脫蛋白對(duì)比結(jié)果

蒲公英根多糖的脫蛋白方法步驟。①Sevag法。向提取液中加入氯仿-正丁醇，離心，取上清液。②鹽析法。加入氯化鈣粉末，攪拌，冷卻，離心，取上清液。按照步驟將Sevag脫蛋白方法與鹽析脫蛋白法進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL，分別置于10 mL試管中，編號(hào)1、2、3、4、5和6，各加入蒸餾水至1.0 mL，加入苯酚溶液1 mL，搖勻，再快速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后放置5 min，在95 ℃水浴鍋中加熱約15 min，取出后冷卻至室溫。以1號(hào)試管為對(duì)照組，用分光光度計(jì)測(cè)量492 nm處的吸光度，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 蒲公英根多糖提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 溫度對(duì)蒲公英根多糖得率的影響

在固液比1∶20和提取時(shí)間為1 h的條件下，在不同溫度（60 ℃、70 ℃、80 ℃）下提取1 g樣品。按標(biāo)準(zhǔn)曲線法吸取0.5 mL樣品稀釋液進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 溫度對(duì)蒲公英根多糖提取的影響

由圖2可知，蒲公英多糖含量在60～70℃時(shí)逐漸上升，超過(guò)70 ℃時(shí)逐漸下降，根據(jù)實(shí)際情況，蒲公英多糖提取溫度以70 ℃為宜。

2.2.2 料液比對(duì)蒲公英根多糖得率的影響

在溫度70 ℃、提取時(shí)間1 h條件下，稱取1 g樣品，分別以1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL）的浸提液進(jìn)行提取，吸取樣品溶液0.5 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行操作，結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對(duì)蒲公英根多糖提取的影響

由圖3可知，蒲公英多糖料液比在1∶15～1∶20時(shí)多糖含量上升，但后半段曲線上升速度降低，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，料液比以1∶25為宜。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)蒲公英根多糖得率的影響

取1 g樣品在提取溫度70 ℃、液料比1∶20的條件下，選擇提取時(shí)間分別為1.5 h、2.0 h、2.5 h進(jìn)行提取吸取濾液，吸取樣品稀釋液0.5 mL按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時(shí)間對(duì)蒲公英根多糖提取的影響

由圖4可知，提取時(shí)間越長(zhǎng)，蒲公英根中多糖含量越高，蒲公英多糖提取時(shí)間以2.5 h為宜。

2.3 蒲公英根多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。以蒲公英根多糖的得率為指標(biāo)。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2中的極差R可知，溫度對(duì)蒲公英根多糖得率影響較大，其次是提取時(shí)間，而料液比對(duì)蒲公英根多糖得率影響最小?？紤]到生產(chǎn)成本，確定其最佳組合，即提取溫度70 ℃，料液比1∶25，提取時(shí)間180 min，得到的蒲公英根多糖得率較高。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4 蒲公英根多糖脫色與脫蛋白方法比較

2.4.1 蒲公英根多糖脫色對(duì)比結(jié)果

由表3可知，采用過(guò)氧化氫法與殼聚糖法時(shí)，隨著測(cè)試次數(shù)的增加，脫色率逐漸增加，多糖損失率也逐漸增加。經(jīng)過(guò)對(duì)比，選取殼聚糖法脫色時(shí)選擇脫色次數(shù)為8次最佳，此時(shí)脫色率為85.37%，多糖損失率為17.60%。因此本實(shí)驗(yàn)采用殼聚糖對(duì)蒲公英根多糖進(jìn)行脫色。殼聚糖脫色不僅能有效去除多糖中的色素，還能很好地保護(hù)多糖的生物學(xué)特性，可作為一種新型的多糖脫色劑。

表3 過(guò)氧化氫法與殼聚糖法脫色方法對(duì)比結(jié)果表

2.4.2 蒲公英根多糖脫蛋白對(duì)比結(jié)果

由表4可知，采用Sevag法與鹽析法脫蛋白時(shí)，蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率隨實(shí)驗(yàn)次數(shù)的增加而增加。經(jīng)過(guò)對(duì)比，選取鹽析法脫蛋白時(shí)選擇脫蛋白次數(shù)為8次最佳，此時(shí)蛋白脫除率為86.43%，多糖損失率為18.52%。全面考慮脫蛋白率、多糖損失率等因素，采用鹽析法對(duì)蒲公英根粗多糖溶液進(jìn)行脫蛋白，初步純化蒲公英根粗多糖。

表4 Sevag法與鹽析法脫蛋白方法對(duì)比結(jié)果

3 結(jié)論

通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)，得出以下結(jié)論：溫度是熱水浸提蒲公英根多糖最主要的因素，其次是提取時(shí)間，最后是料液比，最佳提取工藝為提取溫度70 ℃， 料 液 比 1∶25， 提 取 時(shí) 間180 min；采用殼聚糖對(duì)蒲公英根多糖進(jìn)行脫色可達(dá)到很好的效果；全面考慮脫蛋白率、多糖損失率等因素，本文采用鹽析法對(duì)蒲公英根粗多糖溶液進(jìn)行脫蛋白，在此條件下，蒲公英根多糖得率較高。