液質(zhì)聯(lián)用法快速檢測(cè)保健食品中生物素的含量

周宏霞，張 羽，管淑霞，都 穎

（威海市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東威海 264210）

生物素即B7，屬于B族維生素，又稱(chēng)為維生素H、輔酶R，是一種水溶性維生素，具有重要的功能。生物素是合成維生素C的必要物質(zhì)，是脂肪和蛋白質(zhì)正常代謝不可或缺的物質(zhì)，同時(shí)是人體內(nèi)多種酶的輔酶，參與人體內(nèi)脂肪和碳水化合物的代謝，對(duì)于維持機(jī)體正常生理功能有重要的作用[1-2]。其長(zhǎng)期攝入不足會(huì)導(dǎo)致免疫、代謝、基因表達(dá)方面的疾病[3-4]。

目前，國(guó)標(biāo)方法中尚無(wú)保健食品中生物素的測(cè)定方法。用于生物素測(cè)定的方法有微生物法[5-6]、熒光免疫層析法[7]、HPLC法[8-9]和液質(zhì)聯(lián)用法[2]等。其中微生物測(cè)定法靈敏度高但準(zhǔn)確度不高；熒光免疫層析法操作比較復(fù)雜，普及性差；生物素在液相色譜紫外檢測(cè)器上的響應(yīng)值低，檢測(cè)靈敏度不夠。因此，本研究采用高靈敏性的液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)保健食品中的生物素進(jìn)行檢測(cè)，以建立一種快速檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)保健食品的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-30AD高效液相色譜儀，日本島津公司；AB6500 Qtrap三重四極桿質(zhì)譜儀，美國(guó)AB公司；離心機(jī)，Eppendorf公司；渦旋混合器，德國(guó)IKA公司；電子天平（0.1 mg），賽多利斯；Milli-Q 超純水器，美國(guó)Milipore公司。

乙腈，色譜純，Thermo；甲酸，色譜純，Thermo；生物素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，固體粉末，純度≥99.5%，中國(guó)食品藥品檢定研究所。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

生物素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（100 μg·mL-1）：精確稱(chēng)取生物素10 mg，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液溶解后，用超純水定容至100 mL，密封、避光保存。臨用前根據(jù)需要用水稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 儀器工作條件

（1）色譜條件。色譜柱：Kinetex○RRC18（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水；流動(dòng)相B：乙腈；柱溫：30 ℃；流速：0.30 mL·min-1；進(jìn)樣量：5.0 μL；液相梯度洗脫：0～2.0 min，5% B；2.0～6.0 min，5%～80%B；6.0～7.0 min，80%～90%B；7.0～8.0 min，90%B；8.1～10.0 min，5%B。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI）正離子模式；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；離子源溫度：500 ℃；電噴霧電壓：5 500 V；氣簾氣壓：35 psi；霧化氣壓：55.0 psi；輔助氣壓：55.0 psi。

1.4 樣品前處理

稱(chēng)取粉碎均勻的樣品0.1 g至100 mL容量瓶中，加入10 mL的50%的甲醇水，超聲20 min后，用超純水定容至100 mL，混勻。量取10 mL于離心管中，8 000 r·min-1離心 10 min，取上清液過(guò) 0.22 μm 的濾膜上機(jī)檢測(cè)。對(duì)于生物素含量高的樣品，可以繼續(xù)進(jìn)行稀釋?zhuān)蛊浯郎y(cè)濃度在線(xiàn)性范圍內(nèi)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

吸取濃度為100 μg·mL-1的生物素儲(chǔ)備液0.1 mL至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成1 μg·mL-1的中間液。用此中間液配制成濃度為1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和 100 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將生物素配制成50 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，直接注入質(zhì)譜儀，采用正離子掃描模式，得到準(zhǔn)確的母離子。利用質(zhì)譜儀自動(dòng)優(yōu)化功能，篩選二級(jí)碎片離子信息，獲得碎片離子及碰撞能量，并將母離子和2個(gè)信號(hào)較強(qiáng)的子離子組成監(jiān)測(cè)離子對(duì)，以MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后各個(gè)質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 MRM條件下生物素的質(zhì)譜參數(shù)

2.1.2 液相色譜條件的優(yōu)化

本文采用甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)甲醇-水、乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)響應(yīng)值相對(duì)低，甲醇-0.1%甲酸水中生物素峰形比較寬，而乙腈-0.1%甲酸水中生物素響應(yīng)值高，峰形好，且無(wú)雜質(zhì)干擾。因此，本文采用乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相，總離子流圖如圖1所示。

圖1 生物素總離子流圖

2.2 校準(zhǔn)曲線(xiàn)及線(xiàn)性范圍

用1.5配制的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液上機(jī)檢測(cè)。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，生物素的峰面積為縱坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線(xiàn)。由圖2可知，校準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=1.47652×105X+6 919.417 94，R=0.999 93，生物素在1～100 ng·mL-1具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

圖2 生物素校準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

樣品提取后，每隔2 h測(cè)定1次樣品中生物素的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在2 h、4 h、6 h、8 h和10 h時(shí)生物素峰面積值穩(wěn)定，RSD值為5.49%。在提取10 h內(nèi)生物素含量不會(huì)發(fā)生顯著變化，能夠保持穩(wěn)定，表明樣品提取10 h內(nèi)可以進(jìn)行生物素準(zhǔn)確的定量。

2.4 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

用已知濃度的樣品進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平做6個(gè)平行，計(jì)算回收率和RSD。如表2所示，回收率在90.1%～98.1%，RSD在1.71%～3.40%。表明該方法具有良好的回收率與精密度。

表2 生物素加標(biāo)回收率及精密度

3 結(jié)論

本文采用液質(zhì)聯(lián)用儀快速檢測(cè)保健品中的生物素含量，樣品加水提取后上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果表明，生物素在1～100 ng·mL-1具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，校準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y=1.476 52×105X+6 919.417 94，相關(guān)系數(shù)R為0.999 93；在2～10 h生物素峰面積值穩(wěn)定，RSD值為5.49%；加標(biāo)回收率在90.1%～98.1%，RSD在1.71%～3.40%。該方法線(xiàn)性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度及精密度等均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，適用于維生素片類(lèi)保健品中生物素的測(cè)定。