HPLC-ELSD法檢測食品中的β-環(huán)狀糊精

鐘紫彤

（佛山市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測中心，廣東佛山 528225）

環(huán)狀糊精（β-cyclodextrin）是淀粉經(jīng)酸解環(huán)化生成的產(chǎn)物。β-環(huán)狀糊精具有包裹各種化合物分子的能力，可以改變被包裹物質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)，提高被包裹物對(duì)光、熱和氧的穩(wěn)定性。作為一種多功能食品添加劑，β-環(huán)狀糊精具有選擇性高、無毒、可食用、不吸濕、化學(xué)穩(wěn)定性好及易分離等優(yōu)點(diǎn)[1]。β-環(huán)狀糊精在《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2011）中屬于各類食品中按生產(chǎn)需要適量使用的食品添加劑[2]。而在現(xiàn)今實(shí)行的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）中，規(guī)定了β-環(huán)狀糊精在膠基糖果、方便米面制品、預(yù)制肉制品、熟肉制品、碳酸飲料以及風(fēng)味飲料等食品中的最大使用量[3]。關(guān)于食品用香料新品種2-乙酰氧基-3-丁酮、食品添加劑β-環(huán)狀糊精等4種擴(kuò)大使用范圍的公告2017年第10號(hào)[4]和《關(guān)于彎曲乳桿菌等24種“三新食品”的公告》（2019年第2號(hào)）[5]使其適用范圍繼續(xù)擴(kuò)大。從國際上看，國際食品法典委員會(huì)、歐盟委員會(huì)、日本厚生勞動(dòng)省等均允許β-環(huán)狀糊精作為食品添加劑用于食品。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員對(duì)β-環(huán)狀糊精的評(píng)估結(jié)果，該物質(zhì)的每日允許最大攝入量為5mg·（kg bw）-1。說明國家在規(guī)定β-環(huán)狀糊精的使用范圍和最大使用量的過程中是謹(jǐn)慎且與國際接軌的，但是與此相對(duì)的是食品中的β-環(huán)狀糊精并沒有對(duì)應(yīng)的官方檢測方法。因此，建立能準(zhǔn)確檢測食品中β-環(huán)狀糊精的方法，對(duì)食品添加劑風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測、產(chǎn)品質(zhì)量分類以及食品生產(chǎn)方質(zhì)量控制都具有重要的意義。

β-環(huán)狀糊精含有大量羥基基團(tuán)，溶于水，但由于無紫外吸收，也無熒光吸收，在常規(guī)的高效液相色譜紫外檢測器或者熒光檢測器中均無明顯響應(yīng)，故無法使用這兩種檢測器進(jìn)行檢測。高效液相色譜串聯(lián)示差折光檢測器法（Refractive Index Detection，RID）為目前較為常見的檢測方法[6]。因?yàn)镽ID是通過測量液相色譜柱流出液折射率的變化而對(duì)樣品濃度進(jìn)行檢測的，液體的折射率和基線平衡受溫度變化影響較大[7]。而根據(jù)光散射原理進(jìn)行檢測的高效液相色譜法串聯(lián)蒸發(fā)光散射檢測器法（Evaporative Light Scattering Detection，ELSD），因?yàn)槠洳灰蕾囉诖郎y物如紫外吸收、熒光吸收等化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及相對(duì)高的靈敏度，被廣泛地應(yīng)用于食品檢測。一般而言，ELSD比RID靈敏度更高，檢出限更低，線性范圍更廣。因此，本研究擬以簡便易用為宗旨，開發(fā)出新的、靈敏的β-環(huán)狀糊精檢測方法，通過在方便米飯、調(diào)味牛肉片及可樂型飲料基質(zhì)影響下，驗(yàn)證方法的線性范圍、檢出限、精密度和回收率，為今后檢測方法的發(fā)展和更新提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用樣品為市售方便米飯、調(diào)味牛肉片及可樂型飲料。

1.2 試劑與儀器

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：β-環(huán)狀糊精（純度96.7%），曼哈格生物科技（北京）有限公司；甲醇（色譜純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；0.45 μm有機(jī)濾膜，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；氮?dú)猓兌?9.999 5%），液化空氣（廣東）工業(yè)氣體有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水，重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司。

1260高效液相色譜儀配1260InfinityELSD蒸發(fā)光散射檢測器，美國安捷倫公司；Secura224-1CN電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制

將β-環(huán)狀糊精標(biāo)準(zhǔn)品在101～105 ℃充分干燥2 h后，準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品2.068 3 g，在100 mL容量瓶中用水定容至刻度，配制成20 mg·mL-1的β-環(huán)狀糊精標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。分別吸取適量的β-環(huán)狀糊精標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為 0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1和 2.0 mg·mL-1的工作液。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱：InfinityLab ZORBAX Eclipse Plus C18柱（21.2 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：10%甲醇+90%水（體積比）；等度洗脫；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；蒸發(fā)光散射檢測器的漂移管溫度：90 ℃；霧化器溫度：80 ℃；載氣流量：1.60 SLM。

1.3.3 樣品前處理

方便米飯、調(diào)味牛肉片用研磨機(jī)充分粉碎并攪拌均勻；可樂型飲料取多個(gè)預(yù)包裝樣品直接混合，稱取20～40 g（精確至0.001 g），放入100 mL燒杯中置于超聲波清洗器中超聲30 min，驅(qū)除二氧化碳。

準(zhǔn)確稱取約2 （g精確至0.001 g）樣品于25mL具塞離心管中，加約10 mL水，渦旋混勻，于50 ℃水浴超聲20 min后取出冷卻至室溫，加入蛋白沉淀劑亞鐵氰化鉀溶液（92 g·L-1）和乙酸鋅（183 g·L-1）溶液各 1 mL，充分搖勻后于6 000 r·min-1離心10 min，將上層水相轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加水10 mL到剩余殘?jiān)?，渦旋混勻后超聲5 min，于6 000 r·min-1離心10 min，水相合并到同一25 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻。取適量上清液過0.22 μm濾膜，待液相色譜測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

β-環(huán)狀糊精在1.3.2色譜條件下有較強(qiáng)響應(yīng)，定性重復(fù)性（RSD為0.27%，n=5）良好，標(biāo)準(zhǔn)色譜圖如圖1所示。

圖1 β-環(huán)狀糊精在不同濃度下的色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

用β-環(huán)狀糊精標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液制備一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2色譜條件，進(jìn)樣體積為10 μL，繪制以含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖2所示，在0.1～2.0 mg·mL-1具有良好的線性關(guān)系（y=1 388.518 57×x1.76244，r=0.999 69）。

圖2 β-環(huán)狀糊精標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 檢出限

于方便米飯、調(diào)味牛肉片及可樂型飲料3種空白基質(zhì)中均添加1.0 g·kg-1β-環(huán)狀糊精，按照1.3.3方法進(jìn)行處理，樣液用液相色譜測定6次，記錄信噪比。3種基質(zhì)影響下測定的信噪比（S/N）均大于3，其中方便米飯信噪比均值為8.67；調(diào)味牛肉片信噪比均值為3.23；可樂型飲料信噪比均值為7.50。

2.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取方便米飯、調(diào)味牛肉片及可樂型飲料3種樣品，按1.3.3方法處理，按1.3.2色譜條件供液相色譜測定，在重復(fù)性條件下各獲得5次獨(dú)立測定結(jié)果，以檢驗(yàn)測試樣品重現(xiàn)性。由表1可知，3種樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.22%～1.01%，該方法重現(xiàn)性良好。

表1 β-環(huán)狀糊精方法重現(xiàn)性結(jié)果

2.5 加標(biāo)回收率

分別在方便米飯、調(diào)味牛肉片及可樂型飲料3種樣品中各加入 400 μL、1.0 mL、2.0 mL β- 環(huán)狀糊精（5.0 mg·mL-1）標(biāo)準(zhǔn)溶液（理論加標(biāo)量為 2.0 mg、5.0 mg、10.0 mg），按照1.3.3方法制備加標(biāo)回收樣品溶液，同時(shí)做樣品空白，在1.3.2色譜條件下進(jìn)行測定，計(jì)算平均測得值及回收率。由表2可知，3種樣品在3種濃度水平的平均加標(biāo)回收率為87.0%～99.4%，該方法的回收率較為理想。

表2 β-環(huán)狀糊精加標(biāo)回收率測定結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了HPLC-ELSD法測定食品中β-環(huán)狀糊精含量的方法。樣品用水提取后經(jīng)蛋白沉淀劑沉淀蛋白，使用C18柱分離，以甲醇∶水（10∶90）為流動(dòng)相等度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，ELSD檢測器檢測，外標(biāo)法定量。方法的檢出限為1.0 g·kg-1，精密度為0.22%～1.01%，和回收率為87.0%～99.4%，線性關(guān)系良好，r=0.999 69。該方法準(zhǔn)確、可靠，適用于食品中β-環(huán)狀糊精含量的測定。