LC/MS-MS法測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物（AOZ、AHD、SEM）方法研究

吳 剛

（寧夏回族自治區(qū)食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)二站，寧夏銀川 750001）

硝基呋喃類藥物是一類人工合成的抗生素類藥物，對細(xì)菌和病原菌等具有滅殺作用。其主要包含呋喃唑酮（FZD）、呋喃妥因（NFT）、呋喃西林（NFZ）等[1]。隨著世界貿(mào)易的發(fā)展和人口數(shù)量的增多，人們對水產(chǎn)品的需求逐漸增加，硝基呋喃類藥物作為一種抗菌藥物被廣泛用于水產(chǎn)品養(yǎng)殖中。水產(chǎn)養(yǎng)殖戶在利益的驅(qū)使下，非法使用違禁藥品，造成水產(chǎn)品存在安全隱患，危害人體健康。目前國內(nèi)外均禁止使用，要求在動物性食品中不得檢出。但因?yàn)槠湓谥委熕a(chǎn)養(yǎng)殖動物細(xì)菌性尤其是胃腸道等細(xì)菌性疾病方面快速有效，仍有漁民使用。本研究以水產(chǎn)品為檢測對象，優(yōu)化水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留的提取凈化方法，建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物（AOZ、AHD、SEM）分析方法，為水產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控提供參考[2]。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)所用主要儀器設(shè)備見表1。

表1 儀器設(shè)備表

1.2 試劑材料

本實(shí)驗(yàn)所用主要試劑見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)試劑表

1.3 溶液的配制

儲備液的配制見表3。

表3 儲備液的配制表

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件選擇

色譜條件為C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），柱溫35 ℃，流動相流速0.35 mL·min-1，流動相（A：乙酸銨溶液，B：甲醇），梯度洗脫條件見表4。

表4 梯度洗脫條件表

1.4.2 質(zhì)譜條件選擇

本實(shí)驗(yàn)的質(zhì)譜條件見表5。

表5 質(zhì)譜條件表

1.5 樣品前處理

1.5.1 提取

取水產(chǎn)品可食部分，切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊，充分勻漿備用，加入0.05 mL混合內(nèi)標(biāo)工作溶液，稱取樣品2.0 g（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，渦旋混合30 s，加入5 mL鹽酸溶液（0.1 mol·L-1）和 15 mL 2- 硝基苯甲醛溶液（2- 硝基苯甲醛，用二甲亞砜溶解并稀釋至10 mL，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配），混勻渦旋振蕩30 s，置于恒溫水浴鍋中37 ℃避光恒溫12 h。

1.5.2 凈化

取出離心管冷卻至室溫，用磷酸氫二鉀溶液調(diào)pH值至7.0～7.5，加乙酸乙酯8 mL，渦旋振蕩30 s，6 000 r·min-1離心5 min，取上清液至10 mL玻璃離心管，40 ℃氮?dú)獯蹈伞＜?%甲醇溶液1.0 mL溶解殘留物，再將溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，以4 ℃ 10 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心 10 min，取清液過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.6 含量計(jì)算公式

水產(chǎn)品中的呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因的含量按式（1）計(jì)算。

式中：W1為樣品含量，mg·kg-1；C1為標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的樣品濃度，ng·mL-1；m為樣品質(zhì)量，g；V為待測液的體積，mL，D為樣品稀釋倍數(shù)。

1.7 定性、定量測定

用保留時(shí)間及碎片離子二級質(zhì)譜進(jìn)行定性[3]，用產(chǎn)生的模擬數(shù)據(jù)信號響應(yīng)體現(xiàn)數(shù)值，用外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行化合物目標(biāo)值進(jìn)行定量[4]；得出定性確證時(shí)相對離子豐度的最大允許偏差范圍，詳見表6。

表6 定性確證時(shí)相對離子豐度的最大允許偏差表

1.8 方法學(xué)驗(yàn)證

稱取水產(chǎn)樣品5.00 g（精確至0.001 g），加入呋喃唑酮、呋喃西林和呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，分別進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、加標(biāo)回收率和檢出限與定量限試驗(yàn)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法相關(guān)性條件的確定

2.1.1 色譜圖和保留時(shí)間

通過質(zhì)譜相應(yīng)參數(shù)，對AOZ、SEM、AHD濃度為200 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行進(jìn)針，色譜圖見圖 1～ 3。

圖1 AOZ色譜圖

圖2 AHD色譜圖

圖3 SEM色譜圖

2.1.2 質(zhì)譜參數(shù)的確定

通過儀器調(diào)諧參數(shù)明細(xì)及查閱相關(guān)質(zhì)譜技術(shù)文獻(xiàn)，確定質(zhì)譜調(diào)諧最佳優(yōu)化參數(shù)。流動相：乙酸銨溶液（0.01 mol·L-1）-甲醇（體積比1∶1），流速為0.20 mL·min-1，調(diào)諧液濃度為 200 ～ 500 ng·mL-1，色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C1（81.7 μm，2.1 mm×100 mm），系統(tǒng)采集方法為ESI正離子源，MS質(zhì)譜模式（多反應(yīng)離子監(jiān)測），通過儀器Maslyne Calculation軟件計(jì)算得出其（AOZ、AHD、SEM）各自相關(guān)的母離子分別為236、249、209，其他優(yōu)化條件見表7。

由表7可得出AOZ、AHD、SEM最優(yōu)質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓為3.0 kV，離子源溫度為150 ℃，錐孔氣流速為1 000 L·hr-1，脫溶劑氣溫度為500 ℃，柱溫為35 ℃，其響應(yīng)值為6.0e5。

表7 AOZ、AHD、SEM離子優(yōu)化條件表

將AOZ、SEM、AHD的 混 合 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液200 ng·mL-1進(jìn)針一次，由圖1～3得到其保留時(shí)間為5.75 min、5.84 min、5.75 min，最終得出AOZ、SEM、AHD色譜、質(zhì)譜條件如表8所示。

表8 AOZ、AHD、SEM色譜、質(zhì)譜條件表

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別準(zhǔn)確移取AOZ、AHD、SEM標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1 000 μg·mL-1）0.50 mL、0.20 mL、0.10 mL、0.05 mL和 0.01 mL 于10 mL容量瓶中，配制成 50 μg·mL-1、20 μg·mL-1、10 μg·mL-1、5 μg·mL-1和 1 μg·mL-1的混標(biāo)工作液，按上述確定的色譜條件進(jìn)行測定。以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性方程的相關(guān)系數(shù)和范圍（見表9）。

由表9可知，AOZ、AHD、SEM的相關(guān)系數(shù)均大于0.995，在其線性范圍內(nèi)其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，滿足試驗(yàn)分析要求。

表9 AOZ等標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍表

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 精密度試驗(yàn)

稱取水產(chǎn)品樣品5.00 g（精確至0.001 g）共3份，分別加入1 mL的50 ng·mL-1呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定結(jié)果見表10。

由表10可知，在同一質(zhì)譜儀測定值的RSD均小于5%，說明試驗(yàn)精密度良好。

表10 精密度試驗(yàn)結(jié)果表（單位：%）

2.2.2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

分別稱取水產(chǎn)品樣品5.00 g（精確至0.001 g）兩組，編號記為A、B，對兩組樣品分別進(jìn)行低水平（LOQ）和高水平（4LOQ）添加，選用1.5方法進(jìn)行樣品前處理，再進(jìn)行加標(biāo)回收率測定結(jié)果，如表11所示。

表11 不同加標(biāo)濃度的驗(yàn)證數(shù)據(jù)表

不同加標(biāo)水平下，AOZ、AHD、SEM的加標(biāo)回收率均符合GB 31656.13—2021的要求。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取水產(chǎn)品樣品5.00 g（精確至0.001 g）3份，分別加入2.00 μg·kg-1的呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，靜置30 min、60 min、90 min和120 min后上機(jī)測定，分別測定60 min內(nèi)（30 min及 60 min）精密度 RSD% 及120 min內(nèi)（30 min、60 min、90 min和120 min）精密度RSD%。

由表12可得，呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因加標(biāo)樣品均應(yīng)在0～4 ℃避光保存，60 min內(nèi)測定值穩(wěn)定。

表12 樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)混合溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)表

2.2.4 檢出限與定量限試驗(yàn)

檢出限與定量限試驗(yàn)結(jié)果見表13。

表13 檢出限與定量限結(jié)果表

2.3 樣品含量測定

選取市場中兩種不同水產(chǎn)品，編號為A、B，每個(gè)樣品稱取5.00 g（精確至0.001 g），按最終優(yōu)化后的前處理方法對樣品進(jìn)行處理，上機(jī)測定。

由表14可知，不同水產(chǎn)品中的呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因符合GB 31656.13—2021標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。

表14 樣品測定結(jié)果表（單位：μg·kg-1）

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了檢測水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的方法，結(jié)論如下。

（1）質(zhì)譜條件的確定。電噴霧電壓為3.0 kv，離子源溫度為150 ℃，脫溶劑氣溫度為500 ℃、脫溶劑氣流速為1 000 L·Hr-1，柱溫為30 ℃，選用ACQUITY UPLC BEH C18（ 1.7 μm，2.1 mm×100 mm）色譜柱，得出良好峰型的色譜圖。以乙酸胺和甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫。采用正模式ESI源，定量檢測選用多重反應(yīng)模式。該方法具有良好的穩(wěn)定性、操作簡單方便、快速且靈敏高等特點(diǎn)。

（2）前處理?xiàng)l件的確定。選用渦旋和超聲相結(jié)合的提取方式，0.1%甲酸-乙腈溶液為提取溶劑，CNW POLY-SERY MCX為固相萃取柱。

（3）呋喃唑酮、呋喃西林和呋喃妥因等標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍分別為10～200 ng·mL-（1R2=0.996 9）、10 ～ 200 ng·mL-1（R2=0.999 2）、10 ～ 200 ng·mL-1（R2=0.999 0），有良好線性關(guān)系。方法學(xué)驗(yàn)證表明該方法準(zhǔn)確率高、精密度良好。

綜上，本次實(shí)驗(yàn)將質(zhì)譜法作為檢測方法，具有精密度高、定性準(zhǔn)確、定量精度高等特點(diǎn)。檢測指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求，適合于水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留檢測。