糖尿病中腎纖維化與miRNA相關(guān)研究進(jìn)展

王亞楠，李勇，高仕奇，韋妙靈，胡祖梁，付燦

（桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，廣西 桂林 451000）

0 引言

國際糖尿病聯(lián)合會和世界衛(wèi)生組織的估計，糖尿病影響著全球超過4億人[1]。糖尿病大多數(shù)是由疾病并發(fā)癥引起，包括慢性腎功能不全、心力衰竭、肝功能不全、視網(wǎng)膜病變和周圍神經(jīng)病變等。纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積，經(jīng)常在糖尿病組織中發(fā)現(xiàn)，高血糖和胰島素能激活成纖維細(xì)胞并且刺激免疫細(xì)胞、血管細(xì)胞等特異性實質(zhì)細(xì)胞發(fā)生纖維化。成纖維細(xì)胞來源于多種細(xì)胞系，包括成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、通過上皮或內(nèi)皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以及纖維細(xì)胞。當(dāng)肌成纖維細(xì)胞合成過量的膠原蛋白和其他ECM蛋白時，由此產(chǎn)生的纖維化可導(dǎo)致心肌梗死、心肌病和心力衰竭,因此由糖尿病引起的腎纖維化通常認(rèn)為是不可逆的。高血糖引起的腎纖維化涉及多種機制：激活神經(jīng)體液通路，誘導(dǎo)、激活生長因子(如TGF-β)，刺激促炎細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1β)，誘導(dǎo)整合素及分泌基質(zhì)細(xì)胞蛋白(如TSP-1、SPARC、CCN2)。此外，高糖會破壞ROS誘導(dǎo)的DNA修復(fù)，導(dǎo)致持續(xù)損傷，促進(jìn)細(xì)胞衰老、炎癥激活和纖維化[2]。

1 MicroRNA介紹

MicroRNA是高度保守的短鏈非編碼RNA，是一種調(diào)控多種基因蛋白表達(dá)的非編碼單鏈小RNA。通過與3’-UTR結(jié)合，抑制mRNA表達(dá)以促進(jìn)或抑制糖尿病腎病發(fā)病機制[3]。自從第一個miRNA在1993年被克隆以來，已經(jīng)鑒定出超過2000個人類成熟miRNA，目前至少有60%的人類蛋白質(zhì)編碼基因受miRNAs調(diào)控。大量證據(jù)表明，miRNAs的異常表達(dá)可能是各種疾病的發(fā)展的基礎(chǔ)，包括糖尿病引起的各種器官纖維化[4-5]。miRNA失調(diào)可破壞足細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，增進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）途徑，使得纖維化和腎小球功能障礙相關(guān)的ECM蛋白的積累[6-7]。因此，miRNA作為疾病生物標(biāo)志物的作用不可忽視，現(xiàn)將圍繞不同miRNA對DKD的影響進(jìn)行綜述。

2 MicroRNA與糖尿病性腎纖維化

2.1 miRNA-21

作為第一批人類miRNA基因之一，miR-21已被廣泛用于各種疾病的研究，包括腎纖維化[8-9]。miR-21參與腎臟疾病的急性和慢性階段，并且在疾病的早期和晚期有不同的作用[10]。大量證據(jù)證明由TGF-β誘導(dǎo)的多細(xì)胞系中miR-21的表達(dá)上調(diào)[11]。在缺血再灌注損傷(IRI)誘導(dǎo)的急性腎損傷（AKI）中，通過激活炎癥反應(yīng)，促使上皮細(xì)胞的調(diào)亡和纖維化[12]。炎癥過程中，巨噬細(xì)胞通過兩種途徑激活腎成纖維細(xì)胞中miR-21的表達(dá)：1、巨噬細(xì)胞分泌過量的白細(xì)胞介素-6(IL-6)，激活STAT3，進(jìn)一步誘導(dǎo)腎成纖維細(xì)胞中miR-21的過表達(dá)。2、巨噬細(xì)胞分泌富含miR-21的小胞外囊泡，轉(zhuǎn)移到腎成纖維細(xì)胞[13]。miR-21過表達(dá)可抑制Notch2進(jìn)而誘導(dǎo)纖維化標(biāo)志物α-SMA和膠原I增加，所以miR-21可作為腎纖維的標(biāo)志靶點。在接受腹膜透析的患者中發(fā)現(xiàn)miR-21在接受纖維化的腹膜中上調(diào)，并且在透析流出物中是穩(wěn)定的，這表明miR-21是一種有前途的生物標(biāo)志物，可用于監(jiān)測接受腹膜透析治療的患者的腹膜[14]。

miR-21可調(diào)控TGF-β1的下游分子，并作為腎臟中的促纖維化分子參與TGF-β1介導(dǎo)的纖維化信號通路。麥克萊蘭等人發(fā)現(xiàn)miR-21促進(jìn)腎纖維化是通過靶向Smad7、磷酸酶和緊張素同源物(PTEN)，通過Smad3和PI3k-TGF-β1信號通路，使得Smad3增加及AKT磷酸化，最終ECM堆積而導(dǎo)致纖維化[15]。miR-21不僅調(diào)控10號染色體上缺失的磷酸酶和緊張素同源物(PTEN)，而且還靶向Fas配體(FasL)，通過AKT通路正向調(diào)控而抑制細(xì)胞凋亡[16]。

此外，在其他缺血/再灌注誘導(dǎo)AKI病例中，miR-21具有腎保護(hù)作用。miR-21通過阻止腎上皮細(xì)胞凋亡以及抑制炎癥反應(yīng)來保護(hù)腎臟免受缺血/再灌注誘導(dǎo)的AKI[12]。與AKI不同，在糖尿病腎病小鼠模型中，miR-21主要在皮質(zhì)腎小球和腎小管細(xì)胞中表達(dá)，誘導(dǎo)腎纖維化，最終導(dǎo)致DKD[17]。在糖尿病腎病小鼠模型中，抑制miR-21表達(dá)可顯著降低炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，并降低I型膠原、α-SMA和FN（纖維連接蛋白）的表達(dá)量[17]。此外，TGF-β1不僅在心臟成纖維細(xì)胞中激活miR-21過表達(dá)，還通過Smad3激活腎小管上皮細(xì)胞(TECs)的表達(dá)[11]，因而抑制Smad3可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的miR-21的表達(dá)，從而防止腎纖維化。

2.2 miRNA-29

miR-29家族(miR-29a/b/c)參加多條信號通 路 的 調(diào) 控，如 TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin和MAPK，被認(rèn)為是纖維化腎臟疾病中EMT的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子[4]。miR-29能夠降低近端小管上皮細(xì)胞和足細(xì)胞中膠原mRNA水平，通過靶向膠原基質(zhì)合成過程負(fù)調(diào)控纖維化。Chen等人發(fā)現(xiàn)與糖尿病WT小鼠相比，糖尿病miR-29a轉(zhuǎn)基因小鼠的纖維化因子表達(dá)和尿蛋白分泌較低，腎小球纖維化程度也較輕[18]。此外，用AngⅡ?qū)Ω哐獕捍笫?SHRs)和人胚胎腎上皮細(xì)胞(NRK-52E)處理后，miR-29b表達(dá)降低，而TGF-β、α-SMA、膠原I表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致EMT發(fā)生?？固悄虿∷幬锢歉窳型】梢酝ㄟ^靶向DPP-4誘導(dǎo)miR-29上調(diào)提供腎保護(hù)作用，改善DN小鼠模型的纖維化[19]。因此，miR-29b可能對DN有保護(hù)作用。

miR-29b通過靶向特定的纖維化分子（膠原蛋白和α-SMA），其表達(dá)被TGF-β1抑制，因此miR-29b家族是TGF-β1介導(dǎo)的纖維生成的重要下游介質(zhì)[20]。此外，在腎衰竭動物模型中miR-29c表達(dá)下調(diào)，HIF-α激活使其恢復(fù)，TPM1和 COL2A1為miR-29c的靶基因，miR-29c通過抑制TPM1進(jìn)而預(yù)防腎纖維化[21]。miRNA-29a可以通過調(diào)控 Wnt /β-catenin 信號通路抑制 TGF-β1 誘導(dǎo)的纖維化[22]。綜上所述，miR-29 針對多條信號通路的調(diào)節(jié)，直接抑制 ECM 相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制 ECM 的合成與沉積，從而發(fā)揮重要的抗纖維化作用。

2.3 miRNA-192

miR-192在腎臟疾病中的表達(dá)比其他miRNAs更復(fù)雜。研究表明miRNA-192與缺血再灌注腎損傷、腎臟纖維化和高糖腎病密切相關(guān)。2007年首次觀察到在注射STZ的糖尿病小鼠和db/db小鼠中，miR-192水平顯著升高[23]。miR-192在纖維化腎中表達(dá)上調(diào)，TGF-β1通過Smad 3對miR-192起正調(diào)控，并通過Smad 7負(fù)調(diào)控miR-192的表達(dá)。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抑制Smad3的表達(dá)，進(jìn)而降低miR-192的表達(dá)，從而抑制EMT，從而減輕纖維化[24]。雖然miR-192在TGF-β處理的小鼠間皮細(xì)胞和糖尿病小鼠的腎小球中上調(diào)，使得MCs中膠原積累增加，但其他學(xué)者注意到在糖尿病腎病纖維化的晚期miR-192顯著減少，miR-192的低表達(dá)與腎小管間質(zhì)纖維化相關(guān)。這些結(jié)果表明miR-192，可以作為保護(hù)因素，發(fā)揮抗纖維化的作用。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-192通過誘導(dǎo)smad互作蛋白SIP1(一種E-box抑制因子)的表達(dá)，增加了膠原I-α2(Col1a2)的表達(dá)，從而導(dǎo)致糖尿病腎小球膠原沉積和腎纖維化。除SIP1外，miR-192也可以靶向其他兩個鋅指轉(zhuǎn)錄因子Zeb1和Zeb2，從而上調(diào)MCs中關(guān)鍵的纖維化基因Col1a2和膠原Ⅳ-α1(Col4a1)[25]。自噬是一種溶酶體蛋白降解途徑，在腎臟疾病的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)敲除miR-192基因的小鼠腎小球MCs自噬減少，因此，抑制miR-192可導(dǎo)致自噬激活并且減少糖尿病腎病早期腎小球系膜增生[26]。

2.4 miRNA-30

miR-30家族(miR-30a/b/c/d/e)在腎臟中大量表達(dá)，雖然 miR-30家族5個成員之間序列高度相同，但功能卻有差別。有研究表明miRNA-30a在腎癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，miRNA-30a-5p在腎癌細(xì)胞中起抑癌基因的作用，miRNA-30a-5p 通過靶向XIAP調(diào)節(jié)腎癌細(xì)胞的增殖凋亡。此外，miR-30a的過表達(dá)增強了上皮標(biāo)記物，但減少了間充質(zhì)標(biāo)記物。在db/db小鼠的腎組織和高糖處理的腎TECs中，miR-30e減少，而膠質(zhì)瘤相關(guān)蛋白-2(GLIPR-2)上調(diào)，更重要的是，miR-30e過表達(dá)抑制GLIPR-2，促進(jìn)腎TECs增殖，通過下調(diào)波形蛋白、α-SMA和上調(diào)E-cadherin抑制EMT的形成，最終避免DN的腎纖維化[4]。

miR-30a通過靶向活化T細(xì)胞的核因子3(NFATc3)，通過抑制NFATc3的核易位來保護(hù)足細(xì)胞的細(xì)胞骨架紊亂或重排。另一方面，miR-30c已被證明對正常腎穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，并在DN中發(fā)揮保護(hù)作用[4,27]。同時結(jié)締組織生長因子(CTGF)是miR-30c的靶點，miR-30c直接下調(diào)CTGF表達(dá)進(jìn)而減輕腎纖維化，改善腎形態(tài)結(jié)構(gòu)。相反，在miR-30c基因缺失的小鼠上皮細(xì)胞中TGF-β1的分泌增多，并顯著促進(jìn)了EMT。MiR-30e在纖維化腎小管細(xì)胞和TGF-β1處理的NRK-52E細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)[4]。

miR-30不僅參與糖尿病和腎臟疾病，而且與器官纖維化密切相。miR-30a、miR-30c和miR-30e參與了大鼠和人類對比誘導(dǎo)的急性腎損傷[28]，miR-30的丟失導(dǎo)致心臟纖維化[29]。

2.5 miRNA-34

miRNA34a也可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。腎纖維化患者腎小管上皮細(xì)胞和單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠梗阻腎中miR-34a表達(dá)上調(diào)，由此miR-34a促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化。用miR-34a轉(zhuǎn)染近端腎小管細(xì)胞可增加α-平滑肌肌動蛋白和纖維連接蛋白的表達(dá)，同時降低E-鈣粘蛋白的表達(dá)。miR-34a通過與Klotho的3UTR直接結(jié)合而下調(diào)Klotho的表達(dá)。相反，Klotho的過表達(dá)阻止了miR-34a在HK-2細(xì)胞中誘導(dǎo)的EMT。這些結(jié)果證明miR-34a升高在腎纖維化的進(jìn)展中起重要作用[30]。此外，SIRT1為miR-34a-5p在DN中的下游靶基因，在高糖刺激的人近端小管細(xì)胞系(HK-2)細(xì)胞中，SIRT1 mRNA水平與miR-34a-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。miR-34a-5p通過靶向SIRT1的3’非翻譯區(qū)，直接抑制SIRT1以增加TGFβ1的促纖維化作用[31]。將miR-34c的前體注射到單側(cè)輸尿管梗阻小鼠體內(nèi)，miR-34c減少了腎纖維化面積和結(jié)締組織生長因子、α-SMA、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和纖連蛋白的表達(dá)。由此miR-34c可減輕輸尿管梗阻小鼠的EMT和腎臟纖維化[32]。這些結(jié)果均可表示miR-34a-5p是DN治療的新靶點。

2.6 miRNA-200

miR-200家 族 (miR-200a/b/c，miR-141和miR-429)是上皮分化的調(diào)節(jié)因子，主要通過靶向TGF-β/Smad和Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路介導(dǎo)EMT形成。在TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程中，miR-200家族的減少在Zeb1和Zeb2對E-cadherin的抑制中起著關(guān)鍵作用。Wang等人發(fā)現(xiàn)miR-200a/141通過抑制TGF-β1和TGF-β2表達(dá)、激活Smad-3并降低基質(zhì)蛋白水平，阻止TGF-β介導(dǎo)的EMT和腎纖維生成[33]。在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中，Wei等人揭示了一種新的機制，即高血糖誘導(dǎo)的醛糖還原酶通過轉(zhuǎn)錄后靶向miR-200a/141的STZ相關(guān)蛋白1(Keap1)，協(xié)調(diào)控制高糖誘導(dǎo)的腎氧化應(yīng)激反應(yīng)、纖維生成和EMT[34]。

miR-200b/c可以通過抑制Zeb1來促進(jìn)小鼠MCs中膠原和TGF-β1的表達(dá)。miR-200b前體通過抑制Ⅰ膠原、Ⅲ膠原和纖維黏連蛋白的合成來改善腎小管間質(zhì)纖維化。此外，miR-200b/c可以通過靶向GATA結(jié)合蛋白2(FOG2)激活A(yù)kt，從而抑制磷酸肌醇3-激酶(PI3K)導(dǎo)致DN的腎小球系膜肥大[35]。綜上所述，miR-200是DN中腎纖維化的重要調(diào)控因子。而miR-200a/141主要作為保護(hù)分子，而miR-200b/c主要是促進(jìn)DN的纖維化和進(jìn)展。

3 結(jié)論

纖維化在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機制中起著重要的作用，阻礙腎、肝和心功能的發(fā)展。miRNA在DKD腎纖維化病程中起到重要作用，其可能依賴于經(jīng)典的 TGF-β 信號通路或其他非典型信號通路調(diào)控EMT和ECM蛋白的表達(dá)。然而，miRNA在腎臟疾病發(fā)展中的研究仍處于早期階段， DKD靶向治療的應(yīng)用也面臨著巨大挑戰(zhàn)。我們需要對miRNA在腎纖維化過程中的作用機制不斷地探索，為腎纖維化的治療提供新的線索。