間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體在糖尿病性骨質(zhì)疏松中的研究進(jìn)展

阮澤松 陳云豐

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院骨科，上海 200233

糖尿病性骨質(zhì)疏松(diabetic osteoporosis，DO)是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，由糖尿病相關(guān)的血糖調(diào)節(jié)受損、微血管損傷、晚期糖基化終末產(chǎn)物堆積等病理因素導(dǎo)致[1-2]，主要表現(xiàn)為骨量減少、骨脆性增加、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。目前常規(guī)用來治療骨質(zhì)疏松的藥物對糖尿病性骨質(zhì)疏松療效有限[3]，存在增加非典型性骨折發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[4]，如何安全有效地進(jìn)行糖尿病性骨質(zhì)疏松治療成為亟待解決的難題。

近年來，許多研究報(bào)道了關(guān)于運(yùn)用間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)治療骨質(zhì)疏松的潛在療效。MSCs來源廣泛，在體內(nèi)體外均能誘導(dǎo)成骨分化[5]，此外，諸如改善胰島素抵抗、促進(jìn)微血管的生長等特性在治療糖尿病性骨質(zhì)疏松擁有巨大前景[6]。但干細(xì)胞療法存在諸如免疫排斥、惡變等安全問題與倫理道德問題[7]，阻礙其在臨床治療中的發(fā)展與運(yùn)用。

間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體(mesenchymal stem cell-derived exosomes，MSC-Exos)是MSCs旁分泌形成的一類胞外囊泡，介導(dǎo)MSCs在多種疾病中的治療作用[8-9]。應(yīng)用MSC-Exos治療骨質(zhì)疏松也具有一定療效[10-12]，且能夠避免免疫排斥等風(fēng)險(xiǎn)[13]，有望發(fā)展成為一種醫(yī)治糖尿病性骨質(zhì)疏松的新手段。本文綜述了MSC-Exos與糖尿病性骨質(zhì)疏松相關(guān)研究，探求將MSC-Exos應(yīng)用于治療糖尿病性骨質(zhì)疏松的治療機(jī)制。

1 MSC-Exos的一般特性

外泌體是一類由脂質(zhì)雙分子層包含多種蛋白質(zhì)、脂肪、核酸形成的胞外囊泡。其中，蛋白質(zhì)可分為膜蛋白和囊內(nèi)蛋白，分別參與細(xì)胞的識別與外泌體的釋放過程[14]。脂肪酸、膽固醇、鞘磷脂、鞘糖脂等脂質(zhì)能增強(qiáng)外泌體的穩(wěn)定性，促進(jìn)外泌體的出芽釋放[15]。核酸如DNA、miRNA能在外泌體保護(hù)不被降解，確保在受體細(xì)胞中參與基因轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的調(diào)節(jié)[16]。外泌體通過其包含的蛋白質(zhì)、核酸等生物活性物質(zhì)介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，參與體內(nèi)組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種病理生理過程[17]。

最初認(rèn)為MSCs在治療中發(fā)揮的作用是通過增殖并分化成為效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生，然而最近諸多研究表明MSCs通過其旁分泌產(chǎn)生的外泌體發(fā)揮治療效果。最早由Lai等[18]在2010年首次發(fā)現(xiàn)了MSC-Exos對小鼠心肌缺血再灌注損傷的修復(fù)作用，隨后陸續(xù)揭示了MSC-Exos在肺、肝等疾病中的治療作用[8-9]。其中，也有相關(guān)研究指出MSC-Exos對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨功能具有促進(jìn)作用，有效改善骨質(zhì)疏松小鼠骨量情況[19]，是潛在的骨代謝疾病治療方法。

2 糖尿病性骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制

糖尿病性骨質(zhì)疏松主要表現(xiàn)為繼發(fā)于糖尿病后出現(xiàn)的骨量降低、骨脆性增加、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加，主要涉及以下機(jī)制：(1)高血糖水平使得正常骨組織的生長代謝受到影響。其中BMSCs由于凋亡增加導(dǎo)致數(shù)量明顯減少，并且其分化為成骨細(xì)胞的能力減弱，導(dǎo)致了“成骨”與“破骨”之間的平衡被破壞。此外，糖尿病患者體內(nèi)高糖環(huán)境誘導(dǎo)BMSCs趨向脂肪細(xì)胞分化，導(dǎo)致髓腔內(nèi)脂肪堆積，進(jìn)一步抑制了成骨分化[20]。(2)糖尿病的微血管病變導(dǎo)致骨的血供受限，降低了成骨龕的氧氣以及營養(yǎng)供應(yīng)，骨組織的正常代謝受到影響。同時(shí)由于局部缺氧，髓腔內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化，使得原本供氧不足的骨組織病情加重[21]。(3)晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是在糖尿病患者體內(nèi)由膠原蛋白的氨基酸殘基與高濃度糖通過非酶促糖化形成的一類有害代謝物質(zhì)。AGEs在骨組織中的積累會影響骨骼的結(jié)構(gòu)特性，使得骨脆性增加。AGEs還會引起局部炎癥水平增加誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，影響骨形成[22-23]。(4)胰島素分泌不足或胰島素抵抗可引起骨組織能力代謝障礙，導(dǎo)致成骨減少[24]；一些治療糖尿病的藥物對骨形成的過程也會產(chǎn)生不利影響[25]。此外，其他并發(fā)癥如糖尿病腎病導(dǎo)致血鈣、維生素D水平降低，將加重骨質(zhì)疏松水平[26]。

3 MSC-Exos對糖尿病性骨質(zhì)疏松的治療機(jī)制

3.1 MSC-Exos參與調(diào)節(jié)BMSCs成骨分化

如何實(shí)現(xiàn)促進(jìn)BMSCs向成骨分化是恢復(fù)正常骨組織密度的核心問題，在這過程中MSC-Exos可通過以下途徑發(fā)揮作用。

3.1.1MSC-Exos能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，抑制其凋亡：Yang等[27]評估臍帶源性間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對BMSCs的保護(hù)作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)來自外泌體的miRNA-1263抑制了受體細(xì)胞中Mob1蛋白的活性并激活Hippo通路中的效應(yīng)蛋白YAP，從而實(shí)現(xiàn)對BMSCs的保護(hù)。Zhu等[28]在體外模擬高濃度葡萄糖條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了在模擬高血糖狀態(tài)下MSC-Exos對BMSCs的增殖也具有促進(jìn)作用。

3.1.2MSC-Exos能夠促進(jìn)BMSCs向成骨分化：成骨細(xì)胞具有合成、分泌礦化骨基質(zhì)的功能，其生成受損是骨質(zhì)疏松致病過程的關(guān)鍵。Qi等[29]利用人源性多能干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞(hiPSC-MSC)產(chǎn)生的外泌體處理BMSCs，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中RUNX-2、COL1和ALP等成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，體外成骨實(shí)驗(yàn)如ALP染色與茜素紅染色結(jié)果也顯示骨形成增強(qiáng)。越來越多的研究表明這一誘導(dǎo)成骨的效應(yīng)可能是通過外泌體中的miRNA介導(dǎo)。Qin等[10]證實(shí)BMSC源性外泌體中miRNA-196a、miRNA-27a和miRNA-206促進(jìn)BMSC向成骨分化，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了除這三類microRNA之外，外泌體中還存在其他影響B(tài)MSC成骨分化的成分。

3.1.3MSC-Exos能抑制BMSCs向脂肪細(xì)胞的分化：MSCs在糖尿病患者體內(nèi)趨向脂肪細(xì)胞分化并出現(xiàn)骨髓脂肪堆積，增加的脂肪細(xì)胞上調(diào)PPARγ、CEBPα和CEBPδ等基因的表達(dá)，進(jìn)一步影響B(tài)MSCs的分化以及抑制成骨細(xì)胞的成骨作用[30-31]?？梢?，有效地抑制BMSCs脂肪分化能夠恢復(fù)正常的成骨水平。有研究報(bào)道BMSC源性外泌體中的miRNA126-3p可降低BMSCs中FTO蛋白的活性，抑制其分化為脂肪細(xì)胞。此外，miRNA126-3p還通過抑制MYC/PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)BMSCs的成骨分化[32-33]。

3.2 MSC-Exos對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的影響

成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間相互作用以促進(jìn)正常骨生長及維持合理骨密度，但這種平衡狀態(tài)在糖尿病性骨質(zhì)疏松中被打破。MSC-Exos除影響B(tài)MSCs的分化外，還可通過調(diào)節(jié)“成骨”與“破骨”的水平來參與骨代謝。Yang等[34]研究表明來自BMSC源性外泌體中的lncRNA-MALAT1進(jìn)入成骨細(xì)胞后與胞內(nèi)miRNA-34c結(jié)合，增加STAB2的表達(dá)并增強(qiáng)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Runx2、ATF4的活性，促進(jìn)成骨作用。MALAT1也可通過抑制miR-22-5p促進(jìn)RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞溶骨作用[35]，但是整體來看，經(jīng)MSC-Exos治療的骨質(zhì)疏松動物模型表現(xiàn)為骨量增加，骨質(zhì)疏松緩解[34]。其他的研究表明MSC-Exos對破骨細(xì)胞活動的調(diào)節(jié)存在爭議，Hu等[36]研究臍帶間充質(zhì)源性外泌體對骨質(zhì)疏松小鼠的保護(hù)作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)外泌體中的CLEC11A通過抑制RANKL的表達(dá)從而表現(xiàn)出對破骨細(xì)胞骨吸收的抑制作用。Chen等[11]研究經(jīng)尿源性間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體治療后的骨質(zhì)疏松小鼠的骨代謝水平，通過qPCR發(fā)現(xiàn)成骨相關(guān)基因如Ocn、Alp和Runx2的mRNA含量增加明顯；而破骨細(xì)胞相關(guān)基因如Trap、Mmp9、Ctsk受到了抑制，證實(shí)了外泌體中CTHRC1和OPG產(chǎn)生的促成骨和抗破骨作用。

在這些研究中，不同來源的MSC-Exos都促進(jìn)了成骨細(xì)胞的骨形成作用，然而對于破骨細(xì)胞的作用尚無確定結(jié)論。因此仍需進(jìn)一步比較不同來源的MSC-Exos的作用，并篩選出能高效治療糖尿病性骨質(zhì)疏松的類型。

3.3 MSC-Exos改善骨組織的血供

正常情況下骨的血供滿足組織必需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)并提供激素、生長因子等刺激骨的生長。而在糖尿病的病理?xiàng)l件下，血供受損無法維持骨組織正常的生長代謝[21]。而MSC-Exos攜帶的物質(zhì)能夠通過參與多種信號通路影響血管生成，改善血供不足的情況。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一類通過趨化內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)現(xiàn)耦合骨與血管生長的蛋白[37]。MSC-Exos包含有VEGF以及促進(jìn)靶細(xì)胞VEGF表達(dá)的多種物質(zhì)，通過激活靶細(xì)胞的PIK3/AKT/mTOR通路以及抑制PTEN的表達(dá)，通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成來提高成骨水平[38-39]。除VEGF通路外，MSC-Exos也可通過NOTCH通路對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生類似的作用[40]。Gonzalez-King等[41]對過表達(dá)HIF-1的MSC-Exos進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)NOTCH通路配體Jagged1與內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合后能促進(jìn)胞內(nèi)NICD形成，影響靶基因如HES1、HEY2的表達(dá)，使得內(nèi)皮細(xì)胞血管網(wǎng)的形成增加。

除誘導(dǎo)血管生成外，MSC-Exos還能夠改善AGEs誘導(dǎo)的微血管病變。糖尿病引起的血管鈣化是發(fā)生骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)因素[42]。Wang等[43]在模擬的糖尿病環(huán)境下發(fā)現(xiàn)BMSCs產(chǎn)生的外泌體中miRNA146a含量增加，通過減少TXNIP基因在血管平滑肌組織中的表達(dá)，抑制了血管平滑肌鈣化。應(yīng)用MSC-Exos治療能有效促進(jìn)血管生成和改善血管的順應(yīng)性，恢復(fù)骨骼正常的血液供應(yīng)，促進(jìn)骨形成。

3.4 MSC-Exos對糖尿病及其并發(fā)癥的作用

針對糖尿病的病理機(jī)制，選擇合適的治療和預(yù)防手段能有效提高糖尿病性骨質(zhì)疏松的治療效果。Sun等[44]研究結(jié)果表明MSC-Exos能夠協(xié)同胰島素激活A(yù)KT、IRS-1信號通路改善胰島素抵抗，增加靶組織GLUT2、GLUT4的表達(dá)以促進(jìn)對葡萄糖的攝取及利用。Exos還能夠緩解鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損害，通過恢復(fù)胰島素受體底物1和蛋白激酶B的磷酸化改善胰島素分泌并維持血糖穩(wěn)定，加強(qiáng)肝糖原的儲存以減少AGEs的產(chǎn)生與蓄積?？梢奙SC-Exos恢復(fù)組織對葡萄糖的利用這一特性可能成為其治療糖尿病性骨質(zhì)疏松的潛在機(jī)制。

糖尿病腎病是最常見的糖尿病并發(fā)癥。腎臟的病變導(dǎo)致尿蛋白丟失增加，血鈣、維生素D水平降低[26]。因此改善糖尿病的腎損害，維持血鈣、維生素D正常水平也是治療糖尿病性骨質(zhì)疏松的重要部分。Jin等[45]發(fā)現(xiàn)MSC-Exos中的miRNA-486可降低足細(xì)胞中Smad1蛋白表達(dá)，通過抑制mTOR的磷酸化來下調(diào)足細(xì)胞的凋亡水平，有效緩解了糖尿病腎病的進(jìn)程。此外，MSC-Exos在對諸如糖尿病足、周圍神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變等其他糖尿病并發(fā)癥也具有一定的治療作用[46-48]。可見應(yīng)用MSC-Exos能夠兼顧對原發(fā)病及其他繼發(fā)疾病的治療，以有望切實(shí)提高治療糖尿病性骨質(zhì)疏松的效果。

4 MSC-Exos臨床的應(yīng)用展望

糖尿病及其相應(yīng)的并發(fā)癥如糖尿病性骨質(zhì)疏松儼然已成為現(xiàn)代社會嚴(yán)重的健康問題，亟待有效解決。應(yīng)用MSC-Exos治療糖尿病性骨質(zhì)疏松切合其發(fā)病機(jī)制，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動物模型上具有一定效果。但是將其真正運(yùn)用于臨床還需解決許多問題：(1)MSC-Exos治療糖尿病性骨質(zhì)疏松的具體機(jī)制并不完全明確?，F(xiàn)有的研究表明多種miRNA與蛋白質(zhì)參與疾病的治療。此外，不同組織來源的MSC-Exos對糖尿病性骨質(zhì)疏松的治療機(jī)制和治療效果存在差異，有待進(jìn)一步研究以明確應(yīng)用于疾病治療的最佳MSC-Exos來源。(2)將MSC-Exos通過靜脈注射后會在肝、肺等組織富集[49]，無法靶向到損傷部位。將MSC-Exos摻入β-TCP支架中可直接在骨缺損部位發(fā)揮療效[29]，后續(xù)可通過尋找契合MSC-Exos生物活性功能的可降解生物支架材料以最大化其治療效果。(3)MSC-Exos能夠高效介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，可作為治療用蛋白、核酸的輸送載體，通過調(diào)節(jié)對應(yīng)信號通路發(fā)揮治療作用[41]。利用這一特性，可設(shè)計(jì)運(yùn)載特定生物活性分子以實(shí)現(xiàn)對糖尿病性骨質(zhì)疏松的治療效果。若能修飾其表面蛋白，將MSC-Exos高效地靶向?qū)?yīng)病變組織，可明顯減少不良反應(yīng)并提升療效。

MSC-Exos的優(yōu)秀特性為治療糖尿病性骨質(zhì)疏松提供了新的方向。隨著MSC-Exos相關(guān)研究不斷發(fā)展，對其認(rèn)識更加明確，MSC-Exos將成為治療糖尿病性骨質(zhì)疏松有效的新方案。