糖原合成酶激酶3β(GSK3β)參與調(diào)控視網(wǎng)膜疾病的研究進(jìn)展△

劉曉暉 徐 靜 吳 京

目前，全世界有數(shù)百萬患有各類視網(wǎng)膜疾病患者，如糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)、老年性黃斑變性(SMD)等。視網(wǎng)膜作為眼球最內(nèi)部的感光結(jié)構(gòu)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分。視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)特征和功能的多樣性決定了其易受內(nèi)外環(huán)境的影響，其調(diào)節(jié)自身狀態(tài)的機制也更為復(fù)雜。糖原合成酶激酶3β(GSK3β)是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，存在于幾乎所有的真核生物中。越來越多的證據(jù)表明，GSK3β是影響視網(wǎng)膜疾病進(jìn)展的重要分子，并且GSK3β作為綜合多條信號通路的中心點，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞功能障礙的多種病理事件[1-2]。然而，不同研究者之間的實驗結(jié)果存在一定的矛盾性，這表明GSK3β調(diào)控視網(wǎng)膜疾病的復(fù)雜性[3-4]。為此，本研究回顧并整理了GSK3β在不同視網(wǎng)膜疾病中的調(diào)節(jié)作用的相關(guān)研究，并進(jìn)行綜述。

1 GSK3β的生物學(xué)特性

GSK3β是糖原合成酶激酶3的兩種經(jīng)典亞型之一，它在結(jié)構(gòu)上高度保守。最初的研究表明GSK3β是調(diào)節(jié)糖原代謝的關(guān)鍵酶，近來研究發(fā)現(xiàn)其可以參與許多其他細(xì)胞活動的調(diào)節(jié)，廣泛地影響多種生物功能。GSK3β在靜息細(xì)胞中的活性很高，其活性受到許多因素的影響。研究證實，GSK3β含有負(fù)調(diào)節(jié)的N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域以及包括ATP結(jié)合位點和酶活性位點的激酶結(jié)構(gòu)域。GSK3β可以整合各種上游通路的信號刺激并通過多種調(diào)節(jié)方式調(diào)控自身的活性從而影響下游通路特異性底物來發(fā)揮不同的功能。磷酸化作為常見的翻譯后修飾之一，是GSK3β活性最重要的調(diào)節(jié)方法，主要依賴于GSK3β N端Ser9的快速和可逆的磷酸化，磷酸化的Ser9與位于啟動磷酸鹽結(jié)合位點內(nèi)的3個高度保守的基本殘基相互作用，繼而阻斷底物結(jié)合和失活催化底物結(jié)構(gòu)域。除了翻譯后修飾，其他形式的調(diào)節(jié)如GSK3β-β-catenin蛋白復(fù)合體形成和亞細(xì)胞定位也對GSK3β的活性有重要的調(diào)節(jié)作用[5-6]。

2 GSK3β參與調(diào)控視網(wǎng)膜疾病

2.1 DRDR是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，血-視網(wǎng)膜屏障(BRB)的結(jié)構(gòu)破壞和通透性增加是DR的重要病理改變。BRB是由內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)和周細(xì)胞組成的內(nèi)屏障以及視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞組成的外屏障共同構(gòu)成。研究表明，ECs間黏附分子的完整性是BRB內(nèi)屏障功能完善的關(guān)鍵因素，GSK3β可以介導(dǎo)ECs過度增殖及黏附連接破壞最終導(dǎo)致血管滲漏從而參與調(diào)控DR的病程發(fā)展[7]。在高血糖刺激下，GSK3β被VEGF/p38α/MAPK通路磷酸化失活，失活的GSK3β不能泛素化降解β-catenin，使得β-catenin積聚在細(xì)胞質(zhì)并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，這一方面使得ECs緊密連接和黏附連接蛋白復(fù)合物遭到破壞，另一方面促使β-catenin作為共轉(zhuǎn)錄因子激活與細(xì)胞遷移和增殖相關(guān)的各種基因，如uPA/uPAR，兩方面共同作用，引起ECs過度增殖和細(xì)胞連接松散，導(dǎo)致細(xì)胞旁通透性增加和血管滲漏，BRB功能受損[8-9]。

近年來有研究表明，在DR中，神經(jīng)變性先于視網(wǎng)膜微血管病變發(fā)生，而突觸功能障礙被認(rèn)為是神經(jīng)病變惡化的第一步[10]。GSK3β介導(dǎo)線粒體受損使得微管功能障礙，使得依賴于微管運輸?shù)耐挥|傳遞不能完整有效地進(jìn)行，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能障礙和丟失，介導(dǎo)DR神經(jīng)突觸損傷。Shu等[11]使用高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型揭示了在DR發(fā)病初期，異常GSK3β激活可導(dǎo)致β-catenin下調(diào)，通過抑制活性氧自由基(ROS)清除酶觸發(fā)氧化應(yīng)激，從而驅(qū)動線粒體損傷，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)的突觸變性。而人參皂苷Rg1可通過IRS1/Akt信號通路抑制GSK3β活性，逆轉(zhuǎn)微管結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定和軸漿運輸障礙，有效預(yù)防tau過度磷酸化介導(dǎo)的RGCs突觸變性[10-12]。相似的研究顯示，GSK3β活性可被GLP1R/Akt通路抑制，阻止過度磷酸化的tau觸發(fā)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元突觸變性[13]。突觸變性進(jìn)一步繼發(fā)胞體功能障礙導(dǎo)致RGCs凋亡，而有研究證實，GSK3β可直接參與RGCs的凋亡調(diào)控。Szabadfi等[14]在糖尿病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，垂體腺苷酸環(huán)酶活化多肽通過增加GSK3β的磷酸化水平來降低RGCs凋亡。進(jìn)一步的研究提示，GSK3β通過激活下游的重要抗氧化應(yīng)激反應(yīng)元件轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)參與抵抗高糖小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)氧化應(yīng)激損傷，減少甚至逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的RGCs凋亡[15-16]。

2.2 SMDSMD包括非滲出性SMD和滲出性SMD兩種類型，是老年人視力損傷的主要原因。非滲出性SMD以RPE細(xì)胞的功能障礙和凋亡繼而形成玻璃膜疣為特征。GSK3β可以通過多種機制介導(dǎo)RPE細(xì)胞的功能障礙和凋亡，促進(jìn)非滲出性SMD發(fā)病。Ebrahimi等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在暴露于SMD的致病危險因素后，其視網(wǎng)膜中GSK3β的組成性活性升高，使得Wnt和Nrf2在雙向反饋回路中同時下降，阻止細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，使得RPE細(xì)胞走向凋亡。而Baek等[18]的研究表明，GSK3β通過NK1R/Akt生存通路失活后，可促進(jìn)細(xì)胞增殖并激活細(xì)胞存活信號來抑制RPE細(xì)胞凋亡。另外一些研究報道，間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基可以通過激活SIRT1/Akt/GSK-3β/β-catenin信號傳導(dǎo)，阻斷RPE細(xì)胞凋亡途徑，治療腦室內(nèi)Aβ1-42注射誘導(dǎo)的大鼠SMD[19]。另一篇研究中也指出，GSK3β可以介導(dǎo)代謝信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子的激活來降低視網(wǎng)膜中過度磷酸化的tau毒性，從而阻止高磷酸化的tau從微管中解離，減少RPE細(xì)胞凋亡。此外，GSK3β是細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬的匯合點，通過持續(xù)的自噬減少細(xì)胞毒性以維持細(xì)胞存活，或者在自噬無法抑制細(xì)胞毒性的情況下啟動凋亡以減少細(xì)胞毒性因子的釋放[20]。

綜上，動物和細(xì)胞模型中的實驗結(jié)論表明，干預(yù)GSK3β相關(guān)通路可以通過抑制RPE細(xì)胞凋亡保護(hù)視網(wǎng)膜功能，然而這并不能有效抵抗SMD的進(jìn)展，當(dāng)RPE細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少時，患者視力將發(fā)生嚴(yán)重下降，因此，尋求更有效的方法維持甚至重建RPE細(xì)胞的數(shù)目平衡將對SMD晚期患者視力恢復(fù)具有重大意義。自體RPE細(xì)胞移植是治療視網(wǎng)膜變性疾病的一種主要方法，但在SMD患者中，自體RPE細(xì)胞由于自身基因及環(huán)境導(dǎo)致衰老及功能失調(diào)，活力低下，難以逆轉(zhuǎn)視功能障礙。而研究表明，抑制GSK3β可以通過阻斷細(xì)胞分化的進(jìn)程，激活細(xì)胞增殖狀態(tài)，使得RPE細(xì)胞獲得“恢復(fù)活力”的潛力，同時不會損害RPE細(xì)胞的特異性表型及形態(tài)[21]。此外，干細(xì)胞來源的RPE細(xì)胞移植是SMD的一種新的治療方法，抑制GSK3β可以高效誘導(dǎo)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化為RPE細(xì)胞[22]。

滲出性SMD以脈絡(luò)膜新生血管(CNV)穿透RPE屏障生長，破壞視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)為主要特征，另外，GSK3β參與介導(dǎo)病理性新生血管的形成并促進(jìn)發(fā)生滲出性SMD。Wang等[23]利用ARPE-19細(xì)胞和RF/6A恒河猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜ECs的共培養(yǎng)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，ARPE-19細(xì)胞中的GSK3β受到組織因子的刺激后，可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)，從而促進(jìn)脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜血管ECs的遷移，引發(fā)CNV。當(dāng)前的抗新生血管治療主要是以VEGF為靶標(biāo)，但是，單純抗VEGF的血管新生作用仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床需求。最近的研究發(fā)現(xiàn)，血小板衍生生長因子(PDGF)家族可能是抗血管生成治療的新靶標(biāo)，在多種視網(wǎng)膜細(xì)胞中均表達(dá)的PDGF家族可以激活A(yù)kt并增加GSK3β的Ser9磷酸化和Tyr216去磷酸化，促進(jìn)視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜新生血管的形成[24]。另一方面，血管生成是缺血組織恢復(fù)血流灌注的代償性表現(xiàn)，然而這些功能缺陷的新生血管無法從根本上緩解缺血缺氧對組織的損害，相反會導(dǎo)致更多的病理性新生血管形成和視網(wǎng)膜損傷。而有研究顯示，通過抑制GSK3β可促進(jìn)功能完善的新生血管形成，在不抑制新生血管形成的情況下減少血管功能缺陷，從根本上減少組織的缺氧損傷，為CNV提供了一種新的有前途的治療策略[25]。

2.3 青光眼青光眼是由于RGCs的進(jìn)行性死亡引起的一種神經(jīng)退行性疾病，最終導(dǎo)致不可逆的視力喪失。眼壓(IOP)升高是青光眼中RGCs損傷的主要危險因素，正常IOP的維持取決于房水分泌及排出的速率，有研究使用非色素性睫狀上皮衍生的細(xì)胞外囊泡(EVs)作用下的正常小梁網(wǎng)細(xì)胞模擬人眼引流系統(tǒng)，顯示在高EVs劑量下，GSK3β的活性被激活的Wnt信號抑制，引起細(xì)胞質(zhì)中β-catenin的積累以及Pro-MMP9和MMP9活性的顯著增強，影響房水引流的阻力，從而調(diào)節(jié)房水分泌與吸收之間的平衡，以維持正常的IOP[26]。研究表明，IOP持續(xù)升高時，GSK3β誘導(dǎo)線粒體動力相關(guān)蛋白表達(dá)，繼而誘導(dǎo)線粒體分裂，過度的線粒體裂變會導(dǎo)致電子傳輸鏈?zhǔn)軗p，從而引發(fā)RGCs和RPE細(xì)胞死亡[27]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，由高IOP引起的缺血使得視網(wǎng)膜中的PI3K/Akt途徑被阻斷，導(dǎo)致生存蛋白Akt的去磷酸化和促凋亡蛋白GSK3β的激活。當(dāng)IOP降低時，血管再灌注會通過磷酸化激活A(yù)kt，從而使GSK3β失活逆轉(zhuǎn)細(xì)胞損傷[28]。此外，對于無明顯IOP升高的正常IOP青光眼(NTG)，目前臨床治療主要是控制IOP，但是效果十分有限，單純降低IOP無法有效阻止RGCs的進(jìn)行性死亡。有研究表明，GSK3β可以通過被E-LPs去磷酸化來保護(hù)NTG小鼠視網(wǎng)膜及原代RGCs免受由谷氨酸誘導(dǎo)的Ca2+升高的損傷，從而抑制線粒體功能障礙并阻止RGCs凋亡[29]。

有研究發(fā)現(xiàn)，GSK3β還可以參與調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的干細(xì)胞特性，使得視網(wǎng)膜在遭受打擊后可以自我修復(fù)，從而逆轉(zhuǎn)RGCs進(jìn)行性丟失引起的視力損害。Yao等[30]的研究表明，成年哺乳動物視網(wǎng)膜中的GSK3β活性被抑制后，可以促使β-catenin結(jié)構(gòu)維持穩(wěn)定并與下游的啟動子結(jié)合從而激活轉(zhuǎn)錄，刺激Müller細(xì)胞增殖以及獲得向神經(jīng)元分化的神經(jīng)源性潛力。因此，在視網(wǎng)膜損傷后，如何靶向GSK3β啟動神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞向RGCs分化，將成為未來青光眼神經(jīng)保護(hù)研究的重要課題。

2.4 增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)是一種復(fù)雜的纖維化疾病，常發(fā)生在視網(wǎng)膜脫離手術(shù)后，其特征在于視網(wǎng)膜上增殖膜的形成和牽拉。RPE細(xì)胞在受到多種細(xì)胞因子和生長因子刺激后，通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的過程而去分化并轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞和成肌纖維，GSK3β被認(rèn)為是該過程的負(fù)調(diào)節(jié)劑。Zhang等[31]的研究顯示，在新西蘭兔的PVR模型中，RPE細(xì)胞中的GSK3β表達(dá)下調(diào)，Wnt/β-catenin和PI3K/Akt信號通路的激活導(dǎo)致進(jìn)一步的成纖維細(xì)胞增殖，膠原蛋白合成和EMT進(jìn)展。另有研究表明，GSK3β在受到PVR患者玻璃體中含量豐富的TGF-β2刺激后磷酸化水平下調(diào)，參與促進(jìn)ARPE-19細(xì)胞的EMT進(jìn)程[32]。Huang等[33]的研究顯示，GSK3β的活性形式GSK3β-S9A和PI3K/Akt抑制劑處理ARPE-19細(xì)胞可中斷細(xì)胞轉(zhuǎn)化和遷移以及膠原蛋白的收縮，減緩PVR的進(jìn)程。

2.5 視網(wǎng)膜色素變性視網(wǎng)膜色素變性(RP)是一組遺傳性視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病，由于感光細(xì)胞的功能障礙和死亡，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的視力障礙。RP的發(fā)病機制尚不清楚，有研究提示，GSK3β可以通過介導(dǎo)氧化應(yīng)激、興奮性毒性和炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，參與介導(dǎo)RP的病理過程。Lavoie等[34]在GSK3β+/-小鼠中觀察到視網(wǎng)膜電圖異常，證實感光細(xì)胞功能與GSK3β表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步的研究表明，GSK3β受到IR/PI3K/Akt信號通路的調(diào)控而失去活性，從而維持感光細(xì)胞線粒體的完整性及促進(jìn)Müller細(xì)胞的糖原合成，以應(yīng)對正常程度下的氧化應(yīng)激損傷，有效保護(hù)RPE細(xì)胞功能[35-36]。Wyse等[37]的研究也發(fā)現(xiàn)，PKA依賴性的GSK3β失活通過激活CREB上調(diào)Bcl-2，提高感光細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力。Wang等[38]和Carullo等[39]在RP10小鼠模型中發(fā)現(xiàn)GSK3β抑制劑可以通過減少變性視網(wǎng)膜中促炎性標(biāo)志物α2m、IL-1β和TNF-α的釋放以及減輕由N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)引起的興奮性毒性來抑制感光細(xì)胞的死亡。

2.6 外傷性視神經(jīng)病變外傷性視神經(jīng)病變通常是由于鈍性眼外傷和顱面損傷引起的視神經(jīng)(ON)的直接或間接損傷。ON由RGCs的軸突形成，具有單向軸突的特性。對ON的機械破壞會導(dǎo)致RGCs死亡，最終導(dǎo)致視力喪失。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠ON夾傷模型中，GSK3β可通過調(diào)節(jié)生長錐動力學(xué)來促進(jìn)軸突生長和分支及神經(jīng)元極化[1,40-41]。進(jìn)一步的研究表明，RGCs通常由于軸突生長錐的生長環(huán)境抑制及其進(jìn)入軸突再生程序的內(nèi)在能力不足而無法再生受損的軸突。GSK3β促進(jìn)軸突再生的作用不是直接啟動軸突再生以彌補丟失的軸突，而是通過消除影響軸突再生的抑制環(huán)境，從而使得軸突正常順暢地完成其再生進(jìn)程而不影響RGCs的存活機制[3]。Kondo等[42]的研究也發(fā)現(xiàn)，GSK3β-/-主要以去抑制方式起作用來促進(jìn)ON再生，活性GSK3β介導(dǎo)的CRMP2磷酸化可將CRMP2滅活，從而取消CRMP2對微管聚合的促進(jìn)作用和對軸突再生的去抑制作用，使得ON無法再生。研究已經(jīng)證實，神經(jīng)元極性是一個神經(jīng)突迅速長成軸突，其余神經(jīng)突分化成樹突的過程，是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)定向信息流的先決條件，在視神經(jīng)再生中起著重要作用。Huang等[43]利用原代培養(yǎng)的RGCs發(fā)現(xiàn)，GSK3β在受到Sema3A/PKA通路的調(diào)控后其磷酸化水平下降，使得下游CRMP2的穩(wěn)定性受到破壞，從而抑制RGCs的軸突生長，促進(jìn)樹突生長，這不利于ON損傷的早期恢復(fù)。另有研究表明，磷酸化的GSK3β不僅可以通過激活MAP1B來減少微管蛋白的脫酪氨酸作用，調(diào)節(jié)軸突生長錐中的微管動力學(xué)，促進(jìn)軸突生長，還在一定程度上參與調(diào)節(jié)軸突的最終成熟及其末端向大腦皮層投射的準(zhǔn)確定位[3]。

3 總結(jié)與展望

近幾年來，GSK3β在介導(dǎo)視網(wǎng)膜疾病中的調(diào)控作用研究已有一定進(jìn)展。雖然基于細(xì)胞通路調(diào)控的治療方法已經(jīng)取得了一定的效果，但它未能逆轉(zhuǎn)退行性過程，因為大多數(shù)治療措施只關(guān)注單一通路的變化，忽視了疾病的進(jìn)展是細(xì)胞狀態(tài)和組織環(huán)境綜合作用的結(jié)果。此外，單一途徑的干預(yù)也可能干擾與其相關(guān)的其他生命過程，由此產(chǎn)生的副作用不應(yīng)被低估。因此，未來的研究應(yīng)該聚焦于GSK3β在視網(wǎng)膜疾病進(jìn)展過程中的聯(lián)合作用，針對GSK3β的藥物研發(fā)應(yīng)該考慮到不同通路的綜合作用，從而實現(xiàn)對靶點的精準(zhǔn)控制。