Keap1/Nrf2信號(hào)通路與神經(jīng)退行性疾病的研究進(jìn)展

許莉莉，高雅然，呂佩源,

(1.河北北方學(xué)院研究生院，河北 張家口 075000； 2.河北醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)病學(xué)教研室，石家莊 050017；3.河北省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，石家莊 050051)

神經(jīng)退行性疾病是指一類(lèi)慢性、不可逆性、進(jìn)行性的以神經(jīng)元退行性病變?yōu)榛A(chǔ)的疾病，主要包括阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)、帕金森病(Parkinson′s disease，PD)、肌萎縮性側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、亨廷頓病(Huntington disease，HD)等，其病因和發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，主要發(fā)病機(jī)制可能與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[1]。氧化應(yīng)激是自由基及活性代謝物或活性氧的產(chǎn)生與通過(guò)保護(hù)機(jī)制(如抗氧化酶、抗氧化劑)消除之間的不平衡，這種不平衡可以導(dǎo)致細(xì)胞、組織和器官損傷，是各種病理過(guò)程的主要指征之一。核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是抗氧化防御關(guān)鍵因子，可增強(qiáng)抗氧化反應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)氧化應(yīng)激增強(qiáng)時(shí)伴隨Nrf2的表達(dá)減少，在各種神經(jīng)退行性疾病中均起保護(hù)作用[2]，推測(cè)Nrf2可能是針對(duì)神經(jīng)退行性疾病的潛在治療靶點(diǎn)，但尚缺乏針對(duì)該病治療的臨床研究，且療效不滿(mǎn)意，迫切需要尋求新的有效的神經(jīng)退行性疾病治療方法。由于Nrf2可能控制、調(diào)節(jié)和維持解毒以及抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)的表達(dá)，其激活在氧化應(yīng)激與神經(jīng)退行性疾病的病理中起著關(guān)鍵作用[3]。現(xiàn)就Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1)/Nrf2信號(hào)通路與相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的相關(guān)性予以綜述，以期為相關(guān)疾病的早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)防提供幫助。

1 Keap1/Nrf2信號(hào)通路

Keap1/Nrf2信號(hào)通路介導(dǎo)的抗氧化防御系統(tǒng)是保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激的主要機(jī)制，該通路可以調(diào)節(jié)抗氧化劑的轉(zhuǎn)錄，從而保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。Nrf2由NFE2L2基因編碼，屬于轉(zhuǎn)錄因子CNC家族，含有605個(gè)氨基酸，包含一段含有高度保守的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，分布于不同組織和器官，并同時(shí)表達(dá)于不同類(lèi)型細(xì)胞。通過(guò)核磁共振波譜和高分辨率晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的分析表明，Nrf2分子結(jié)構(gòu)中含有7個(gè)Nrf2-ECH的同源(Nrf2-ECH homologous，Neh)功能結(jié)構(gòu)域(Neh1～7)，它們主要參與調(diào)節(jié)該物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄活性及穩(wěn)定性。Neh1是第一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，包含3個(gè)堿性亮氨酸拉鏈基序，允許Nrf2與ARE序列結(jié)合。在Nrf2從Keap1釋放后，Neh1結(jié)構(gòu)域暴露Nrf2所需的核定位信號(hào)，從而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中；此外，該結(jié)構(gòu)域還可與E2泛素結(jié)合酶UbcM2相互作用調(diào)節(jié)Nrf2蛋白穩(wěn)定性。Neh1和Neh2在Nrf2調(diào)節(jié)方面發(fā)揮不同的作用，Neh2是位于N端的負(fù)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，可促進(jìn)Nrf2泛素化，隨后蛋白酶體降解，這是Keap1-Nrf2結(jié)合增強(qiáng)的結(jié)果。Neh3結(jié)構(gòu)域位于C端，可調(diào)節(jié)ARE基因的轉(zhuǎn)錄激活。Neh4及Neh5屬于轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，可與共激活cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)結(jié)合，從而促進(jìn)Nrf2轉(zhuǎn)錄，并通過(guò)與核激素受體轉(zhuǎn)錄共激活因子AIB1相互作用增強(qiáng)Nrf2-ARE基因的表達(dá)。Neh6和Neh7結(jié)構(gòu)域是Nrf2活性的負(fù)調(diào)節(jié)因子，Neh6結(jié)構(gòu)域Nrf2的非Keap1依賴(lài)性降解是β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素重復(fù)蛋白的結(jié)合點(diǎn)。Neh7結(jié)構(gòu)域通過(guò)與視黃酸X受體α相互作用，抑制Nrf2表達(dá)[3-4]。

Keap1含有624個(gè)氨基酸，作為Cullin-Ring E3泛素連接酶多亞基蛋白復(fù)合物的組成部分，是細(xì)胞內(nèi)Nrf2的主要調(diào)控因子。Keap1作為KLHL家族成員，由N端區(qū)域、BTB結(jié)構(gòu)域、C端Kelch結(jié)構(gòu)域(又稱(chēng)IVR區(qū)域)組成。其中，BTB結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域，在體外形成異構(gòu)體和同源二聚體，與Nrf2-Keap1的結(jié)合力相關(guān)；Kelch結(jié)構(gòu)域位于Keap1的C端，由6個(gè)Kelch重復(fù)序列組成，是Keap1-Nrf2的結(jié)合位點(diǎn)。Kelch結(jié)構(gòu)域與Nrf2蛋白中的兩個(gè)基序結(jié)合，分別稱(chēng)為ETGE基序(起“鉸鏈”作用)和DLG基序(起“閂鎖”作用)，被泛素-蛋白酶體降解，從而維持Nrf2的穩(wěn)定表達(dá)。但是暴露在親電試劑或活性氧條件下，Keap1中的半胱氨酸殘基被修飾，引起多泛素的停止?！般q鏈”和“閂鎖”的相互作用可以降低Keap1對(duì)Nrf2的親和力，但不會(huì)導(dǎo)致釋放[5],而新合成的Nrf2被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，可觸發(fā)Nrf2依賴(lài)基因的轉(zhuǎn)錄，從而提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激防御能力[6]。

在正常生理?xiàng)l件下，Nrf2通過(guò)ETGE和DLG基序與Keap1結(jié)合，激活Cullin3的E3連接酶復(fù)合物與Nrf2泛素化，隨后蛋白酶體降解[7]。在氧化應(yīng)激條件下，Nrf2從Keap1分離并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并與小Maf(肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源物)蛋白異二聚體化。ARE是Nrf2靶基因調(diào)控區(qū)的增強(qiáng)子序列，異二聚體通過(guò)識(shí)別ARE發(fā)揮調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的作用[3]。故Nrf2/ARE信號(hào)通路在調(diào)控參與活性氧解毒和細(xì)胞毒性中起關(guān)鍵作用。

2 Keap1/Nrf2信號(hào)通路與神經(jīng)退行性疾病

活性氧的積累是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的主要機(jī)制，若維持活性氧生成和消耗的平衡被破壞可能導(dǎo)致大腦穩(wěn)態(tài)喪失，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病。目前，已在神經(jīng)退行性疾病患者中檢出氧化標(biāo)志物水平升高以及細(xì)胞成分的破壞，Keap1/Nrf2信號(hào)通路與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和進(jìn)展存在復(fù)雜聯(lián)系，該類(lèi)疾病的共同特征之一是氧化還原代謝的受損，可導(dǎo)致活性氧積累，影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。因此，干預(yù)Keap1/Nrf2信號(hào)通路的靶點(diǎn)可能為抗氧化應(yīng)激提供機(jī)會(huì)，并可能預(yù)防或延緩疾病進(jìn)展。

2.1Keap1/Nrf2信號(hào)通路與AD AD是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為認(rèn)知下降和記憶功能障礙，其病理學(xué)標(biāo)志是來(lái)自淀粉樣斑塊和腦內(nèi)淀粉樣血管病的β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)以及異常磷酸化tau蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)[8]，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能減退和非認(rèn)知性神經(jīng)精神癥狀。AD早期階段可出現(xiàn)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的損傷，標(biāo)志物主要為蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸的氧化損傷。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶是大腦中活性氧的主要來(lái)源，其激活介導(dǎo)的氧化應(yīng)激造成的損傷與AD中Aβ及tau病理機(jī)制相關(guān)[9]。

隨著AD患者及健康老年人年齡的增加，Nrf2水平均降低，Nrf2在維持神經(jīng)元線粒體功能、突觸可塑性和衰老過(guò)程的認(rèn)知功能中起著重要作用。Keap1是改善AD中Nrf2缺陷和保護(hù)神經(jīng)元免受損傷的有效靶點(diǎn)，使用Nrf2抑制劑可有效保護(hù)小鼠神經(jīng)元培養(yǎng)物免受天然來(lái)源Aβ寡聚體的突觸毒性[10]。另有研究證實(shí)，miR-592通過(guò)激活Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路，降低C-Keap1表達(dá)，增強(qiáng)Nrf2和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸:醌氧化還原酶1的表達(dá)，提高細(xì)胞活力，從而保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷[11]。

AD的病理改變主要為Aβ和異常磷酸化tau蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。硫胺素(維生素B1)在腦能量代謝中起著重要作用，其缺乏與癡呆的嚴(yán)重程度存在一定關(guān)系，苯二胺是一種合成的S-硫胺素的?；苌铮撐镔|(zhì)及其代謝產(chǎn)物在細(xì)胞和動(dòng)物水平是Nrf2的激活劑，可顯著增加Nrf2依賴(lài)基因的表達(dá)，具有抗tau蛋白磷酸化和神經(jīng)原纖維纏結(jié)的神經(jīng)保護(hù)作用，長(zhǎng)期使用苯二胺可有效改善認(rèn)知障礙、延長(zhǎng)壽命、防止運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡[12]。同時(shí)，Aβ在AD的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。采用Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷模型在激活Keap1/Nrf2信號(hào)通路后，血紅素加氧酶-1和其他抗氧化酶[如超氧化物歧化酶(superoxide dismutas，SOD)、過(guò)氧化氫酶]的表達(dá)水平升高，表明Keap1/Nrf2信號(hào)通路的激活在預(yù)防或修復(fù)神經(jīng)損傷方面發(fā)揮保護(hù)作用[13]。在動(dòng)物以及細(xì)胞水平，激活Nrf2具有顯著的抗Aβ作用以及由大腦中增強(qiáng)的磷酸化tau蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)毒性作用，可調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激酶水平、改善與記憶和認(rèn)知相關(guān)的病理行為，從而有效治療AD[14]。已有研究證實(shí)，Keap1/Nrf2信號(hào)通路的激活與AD密切相關(guān)[15]，可能是治療AD的靶點(diǎn)，且可預(yù)防或改善AD，但目前還缺乏關(guān)于其臨床應(yīng)用的安全性和有效性研究。

2.2Keap1/Nrf2信號(hào)通路與PD PD是繼AD后第二大常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，其主要特征是位于黑質(zhì)的多巴胺神經(jīng)元丟失導(dǎo)致的多巴胺水平降低，主要臨床表現(xiàn)包括靜止震顫、肌肉僵直和運(yùn)動(dòng)遲緩。PD患者的大腦中存在生化和細(xì)胞異常，包括線粒體功能障礙、自由基導(dǎo)致的損傷、興奮毒性和炎癥等變化，其中氧化應(yīng)激起關(guān)鍵作用。Bhattacharyya等[16]報(bào)道，血清尿酸鹽水平越高，PD進(jìn)展越慢，抗氧化藥物可改善機(jī)體的抗氧化能力，因此抗氧化藥物對(duì)PD患者具有潛在益處。PD中氧化應(yīng)激指標(biāo)(如丙二醛、乳酸脫氫酶)水平明顯升高，而總SOD、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、血紅素加氧酶-1、Nrf2蛋白表達(dá)明顯減少[17]，推測(cè)激活Nrf2通路可以減緩氧化應(yīng)激導(dǎo)致的損傷，從而保護(hù)神經(jīng)元。

PD以蛋白質(zhì)病和線粒體功能障礙為特征，大多數(shù)為病因不明的散發(fā)型和少數(shù)家族性，其病理機(jī)制為氧化應(yīng)激的增加。激活Keap1/Nrf2通路可延緩PD患者的神經(jīng)退行性病變進(jìn)展[18]。體外研究顯示，不同PD相關(guān)藥物對(duì)PD模型多巴胺神經(jīng)元具有保護(hù)作用，其中茶多酚通過(guò)抑制多巴胺氧化、結(jié)合、清除活性氧，調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2抗氧化信號(hào)通路，進(jìn)而保護(hù)多巴胺相關(guān)毒性[19]。Rizzi等[20]采用一種成像的方法發(fā)現(xiàn)，在小鼠大腦的黑質(zhì)致密部區(qū)域Nrf2激活早于多巴胺能神經(jīng)變性。體內(nèi)外研究均證明，上調(diào)Nrf2以及通過(guò)Nrf2調(diào)節(jié)其他基因和蛋白質(zhì)水平，可以減輕機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥，起到神經(jīng)保護(hù)作用[21]。因此，Nrf2的激活可能是PD神經(jīng)退行性病變的關(guān)鍵靶點(diǎn)，可為預(yù)防多巴胺能神經(jīng)退行性病變和運(yùn)動(dòng)缺陷提供幫助。

Lastres-Becker等[22]利用α-突觸病模型對(duì)野生型小鼠與Nrf2-/-小鼠進(jìn)行的對(duì)照實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Nrf2缺乏可加重PD早期的蛋白質(zhì)聚集、自噬、神經(jīng)元死亡和炎癥反應(yīng)，在細(xì)胞和動(dòng)物水平上，利用富馬酸二甲酯靶向Nrf2作為一種治療策略，可通過(guò)激活Nrf2通路增強(qiáng)內(nèi)源性腦防御機(jī)制，對(duì)抗PD相關(guān)的突觸核蛋白病，從而發(fā)揮多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)作用。而另一項(xiàng)研究報(bào)告顯示，Nrf2基因表達(dá)水平與rs35652124基因型、PD或發(fā)病年齡無(wú)關(guān)[23]。PD腦中多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性退化導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺水平急劇下降，引發(fā)PD臨床癥狀，其中氧化應(yīng)激起關(guān)鍵作用，但目前尚無(wú)緩解PD進(jìn)行性多巴胺神經(jīng)元變性的特異性藥物，Nrf2與PD發(fā)病機(jī)制的關(guān)系仍存在爭(zhēng)議。

2.3Keap1/Nrf2信號(hào)通路與HD HD是一種常染色體顯性遺傳病，主要病理特征是突變的亨廷頓蛋白在胞質(zhì)聚集，導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生增多，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性增加，損害神經(jīng)，臨床表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知障礙、人格改變和精神障礙。對(duì)體外細(xì)胞(木犀草衍生物C6處理的HD細(xì)胞)的研究闡明，活性氧水平的降低主要與Nrf2磷酸化和Nrf2/ARE核轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)、SOD1基因和SOD活性的增加以及谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基基因和蛋白水平的升高有關(guān)[24]。在HD小鼠模型和HD患者中，一種含苯三唑的Nrf2誘導(dǎo)劑在激活Nrf2信號(hào)通路后與ARE結(jié)合，導(dǎo)致活性氧的生成顯著減少[25]，故推測(cè)氧化應(yīng)激中的Keap1/Nrf2信號(hào)通路在其中起著關(guān)鍵作用。

激活Nrf2/ARE通路以及應(yīng)用膳食抗氧化劑化合物同時(shí)提高抗氧化酶的水平，可有效降低氧化應(yīng)激、慢性炎癥和谷氨酸的釋放，延緩HD癥狀的出現(xiàn)[26]。通過(guò)設(shè)計(jì)和測(cè)試幾種環(huán)肽發(fā)現(xiàn)，Keap1/Nrf2質(zhì)子泵抑制劑可能有效治療HD，這為臨床治療提供了重要見(jiàn)解[27]。激活Nrf2及下游基因可有效提供HD紋狀體細(xì)胞中的抗氧化能力，證實(shí)Nrf2通路對(duì)HD細(xì)胞氧化應(yīng)激的神經(jīng)保護(hù)作用[28]。由于Nrf2信號(hào)對(duì)下游成分的調(diào)控，激活Nrf2在成年動(dòng)物中可發(fā)揮抗氧化作用，但在老年動(dòng)物中可增加機(jī)體損害[29]。此外，人參皂苷是一種人參衍生的溶血磷脂酸受體配體，可在HD體外(細(xì)胞)和體內(nèi)(AAV載體感染的HD小鼠模型)通過(guò)聯(lián)合或協(xié)同機(jī)制激活脫脂轉(zhuǎn)化酶和Keap1/Nrf2信號(hào)通路，為HD的臨床治療提供了證據(jù)[30]。Moretti等[31]證明，激活Keap1/Nrf2通路可以保留細(xì)胞中的ATP含量和線粒體電位，以保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷，證實(shí)內(nèi)源性抗氧化劑不受HD中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中亨廷頓蛋白的損害，這為HD的治療提供了可靠依據(jù)。由此可見(jiàn)，氧化應(yīng)激的增加和慢性炎癥是HD發(fā)病機(jī)制中的早期事件，但目前尚無(wú)有效手段來(lái)阻止或推遲HD癥狀的出現(xiàn)。

2.4Keap1/Nrf2信號(hào)通路與ALS ALS是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，其特征是脊髓前角和運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)元的進(jìn)行性喪失，導(dǎo)致骨骼肌萎縮、無(wú)力以及癱瘓。氧化應(yīng)激升高是ALS腦和脊髓的主要病理過(guò)程，不均一核糖核蛋白K與編碼Nrf2抗氧化轉(zhuǎn)錄因子的抗氧化NFE2L2轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，導(dǎo)致Nrf2信號(hào)的下游抗氧化轉(zhuǎn)錄物表達(dá)增加[32]。利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型的研究已闡明，Keap1/Nrf2信號(hào)通路在抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[33]?？梢?jiàn)，Keap1/Nrf2信號(hào)調(diào)節(jié)的氧化應(yīng)激與ALS發(fā)病機(jī)制有關(guān)，干預(yù)Keap1/Nrf2信號(hào)通路的靶點(diǎn)可能是預(yù)防或治療ALS的關(guān)鍵。

ALS發(fā)病機(jī)制仍不明確，約90%的病例為散發(fā)，10%為家族性；在家族性病例中，20%由SOD1基因的點(diǎn)突變引起。給予SOD1 G93A ALS小鼠模型清除自由基的藥物通過(guò)Nrf2途徑激活線粒體抗氧化活性，并降低SOD1表達(dá)和活性氧水平，改善運(yùn)動(dòng)性能，減少脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損失和相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)[34]。在體外(突變?nèi)薙OD1的NSC-34細(xì)胞)和體內(nèi)(果蠅ALS模型)使用內(nèi)源性抗氧化劑可以減少活性氧的產(chǎn)生，刺激Nrf2的激活可導(dǎo)致谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基的表達(dá)和谷胱甘肽的合成增加，可作為治療ALS的臨床候選藥物[35]。Zhang等[36]證實(shí)，抗氧化劑可通過(guò)激活Nrf2/谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基通路改善運(yùn)動(dòng)缺陷，調(diào)節(jié)氧化還原穩(wěn)態(tài)。綜上，氧化應(yīng)激是ALS的主要病理過(guò)程，但仍需研究評(píng)估Keap1/Nrf2信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞蛋白酶抑制以及其他ALS相關(guān)基因突變的影響，以及激活Nrf2對(duì)預(yù)防氧化應(yīng)激的影響。

3 小 結(jié)

近年來(lái)，氧化應(yīng)激在多種疾病中發(fā)揮重要作用。Nrf2是抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵因子，同時(shí)參與抗炎、抗衰老、改善糖脂代謝紊亂、線粒體功能等過(guò)程。在AD、PD、HD及ALS等神經(jīng)退行性疾病的治療中，激活Keap1/Nrf2通路具有神經(jīng)保護(hù)作用，但該通路的縱向研究尚缺乏針對(duì)疾病表現(xiàn)的治療，且相關(guān)細(xì)節(jié)尚不清楚，需進(jìn)一步研究和探討Keap1/Nrf2通路在神經(jīng)退行性疾病發(fā)病過(guò)程中的作用，深入了解該通路在神經(jīng)退行性疾病中的作用及作用機(jī)制，以期為疾病的預(yù)防和治療提供新的方法和思路。