評價MALDI-TOF MS 在快速鑒定腹膜透析相關(guān)腹膜炎病原菌的價值

吳清念，劉春林，黃德兵

（佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，廣東 佛山528200）

腹膜透析是治療終末期腎病的有效手段之一[1]。 腹膜炎是腹膜透析患者常見的并發(fā)癥，嚴(yán)重的腹膜炎或多次腹膜炎發(fā)作是導(dǎo)致患者退出腹膜透析的主要原因，治療不及時，一方面會導(dǎo)致腹膜超濾能力下降加劇病情；另一方面，造成醫(yī)療費用增加，死亡率可高達20%[2-3]。 明確腹膜炎感染病原菌有助于臨床進行針對性治療， 但現(xiàn)有基于培養(yǎng)的傳統(tǒng)檢測方法，通常耗時18~48 h，并不能及時滿足臨床的需要。 近年來，基質(zhì)輔助激光解離電離飛行時間質(zhì)譜 （Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight，MALDI-TOF MS，簡稱MS）在臨床微生物的鑒定應(yīng)用得到廣泛關(guān)注，具有快速、經(jīng)濟、準(zhǔn)確等優(yōu)點[4-5]。因而，本研究擬評價MALDITOF MS 在快速鑒定腹膜透析相關(guān)腹膜炎病原菌的價值，以期為臨床提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 收集2018 年1 月至12 月在本院住院臨床診斷腹膜透析相關(guān)腹膜炎患者125 例，將腹膜透析液培養(yǎng)陽性45 例作為樣本來源。

1.2 傳統(tǒng)鑒定方法 腹膜透析液檢測采用美國BD9120 全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)，細菌分離及鑒定依據(jù)全國臨床檢驗操作規(guī)程第三版。 取腹膜透析液培養(yǎng)陽性瓶并從中吸取培養(yǎng)液涂片， 干燥后固定并進行革蘭染色； 同時接種固體培養(yǎng)基包括哥倫比亞血瓊脂平板、麥康凱平板和巧克力平板（均購自江門市凱林貿(mào)易有限公司）。 菌株的鑒定采用梅里埃VITEK 2 Compact 細菌鑒定藥敏儀。

1.3 MALDI-TOF MS 方法

1.3.1 標(biāo)本前處理 采用差速離心聯(lián)合分離膠促凝管富集法：第一步，用5 mL 注射器從陽性瓶中抽取5 mL 培養(yǎng)液至無菌潔凈的試管中，1 000 r/min離心10 min（將大部分紅細胞、白細胞及大分子雜質(zhì)分離至底部），用加樣槍吸取上清液轉(zhuǎn)移至分離膠促凝管。 第二步，將上清液3 500 r/min 離心15 min，棄去上清液，加70%乙醇反復(fù)吹打沉淀物，然后1 000 r/min 離心10 min， 用加樣槍吸取上清液轉(zhuǎn)移至1 mL Ep 管，13 000 r/min 離心2 min，棄去上清液。第三步，向EP 管中加入生理鹽水900 μL，充分混勻懸液1 min，離心菌體細胞13 000 r/min，2 min（洗去乙醇避免影響圖譜質(zhì)量），留下沉淀物備用。

1.3.2 標(biāo)本檢測 將50 μL 70%甲酸水溶液加入沉淀物中，通過移液槍反復(fù)吹打，然后進行漩渦充分混勻。 進一步加入50 μL 乙腈，通過移液槍反復(fù)吹打混合懸液。 13 000 r/min，2 min 離心微生物提取物。 將1 μL 微生物提取物上清液吸取到MALDI靶板上，室溫晾干。 加入1 μL HCCA 基質(zhì)液覆蓋在樣本上，室溫晾干。 將MALDI 靶板放入質(zhì)譜儀檢測。 以上嚴(yán)格按照質(zhì)譜操作流程進行。

1.3.3 試劑耗材 MALDI-TOF MS 儀及其配套試劑乙腈、 甲酸、HCCA 基質(zhì)液、96 孔不銹鋼靶板均購自德國Bruker 公司； 血清分離促凝膠管購自廣州科普醫(yī)療生物技術(shù)有限公司。 質(zhì)控菌株包括大腸 埃 希 菌 （ATCC25922）、 金 黃 色 葡 萄 球 菌（ATCC25923）均購自廣東省臨床檢驗中心。

1.3.4 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)在EXCEL 2003 軟件包處理，與傳統(tǒng)方法為對照，計算MS 質(zhì)譜儀鑒定的一致率和準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果

在本次研究中， 共有125 例腹膜透析相關(guān)腹膜炎患者， 腹膜透析液培養(yǎng)陽性45 例， 檢出率36%。 其中送檢腹透液培養(yǎng)523 瓶，陽性報警瓶為112 瓶。 單一感染42 例占93.3%，混合感染3 例占6.7%（大腸埃希菌+表皮葡萄球菌、 金黃色葡萄球菌+糞腸球菌、銅綠假單胞菌+表皮葡萄球菌）。 以傳統(tǒng)鑒定方法為參照， 傳統(tǒng)鑒定方法與MALDITOF MS 法總體一致性為80%，其中對革蘭陰性菌一致性較高為86.9%，革蘭陽性菌為70.6，見表1。

3 討論

本研究首次報道了，MALDI-TOF MS 在快速鑒定腹膜透析相關(guān)腹膜炎患者腹透液病原菌的價值，結(jié)果提示，傳統(tǒng)鑒定方法與MALDI-TOF MS 法總體一致性為80%， 其中對革蘭陰性菌一致性較高為86.9%，革蘭陽性菌為70.6，展示了較好的鑒定能力。

MALDI-TOF MS 是一種檢測微生物的新型工具，具有快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟等優(yōu)勢[4-5]。 大量的文獻報道[6-8]，MS 能夠?qū)蝹€細菌菌落快速鑒定，MS 數(shù)據(jù)庫能夠覆蓋常見的細菌、 真菌以及分枝桿菌。 MS還可以直接檢測臨床樣本比如血液、 尿液、 腹水等。 與直接鑒定單個菌落的不同，直接檢測樣本，其前處理方法與正確鑒定率有很大的關(guān)系。 目前，MS 直接檢測血培養(yǎng)陽性病原菌比較成熟，提取細菌蛋白方法有Sepsityper 試劑盒、 分離膠促凝管、濾 膜 吸 附 法 等[9]。 Wüppenhorst 等 報 道[10]，應(yīng) 用Sepsityper 試劑盒，MS 對500 個需氧和厭氧陽性瓶檢測，正確鑒定率89.5%。 另一篇報道[11]，比較不同富集法聯(lián)合MS 檢測中段尿病原菌的價值，分離膠促凝管離心和差速離心富集聯(lián)合MS 檢測，總體鑒定一致性分別為86.7%和81.9%。 最近丁秀榮等報道[12]，采用差速離心法評價MS 對196 陽性瓶為單株感染腹水，菌株的種鑒定符合率為77.6%，其中革蘭陰性菌的種75.9%，革蘭陽性菌的種鑒定符合率為80.2%，但他們對6 瓶混合菌感染樣本，均鑒定出其中一種菌。 與上述研究稍有不同，本研究采用差速離心聯(lián)合分離膠促凝管富集法對腹透液陽性瓶直接檢測， 結(jié)果提示總體細菌鑒定一致性達80%，對革蘭陰性桿菌鑒定率較高達86.9%。 尤其值得注意的是， 本研究中3 個混合感染樣本，MS準(zhǔn)確地鑒定出2 個混合細菌感染樣本， 作者主要是基于陽性培養(yǎng)液革蘭染色涂片結(jié)果， 同時采用MS 混合菌庫模式手工分析圖譜峰，都得到了較滿意的結(jié)果。 與本研究樣本處理方法不同，蘆嘉報道[13]，采用腹水短期培養(yǎng)后再進行MS 檢測，單一細菌生長的樣本鑒定結(jié)果與常規(guī)方法符合率達到94.1%，高于本研究（符合率80%），究基原因可能是病原譜構(gòu)成不同，以及標(biāo)本類型不一樣（腹透液VS 腹水）， 細胞和蛋白含量都可能影響細菌蛋白的提純。 此外，有學(xué)者報道，同一份樣本多孔涂布在靶板上， 增加檢測次數(shù)有助于提高鑒定的準(zhǔn)確性， 這可以嘗試地運用在鑒定結(jié)果不理想的樣本中[14]。

總之， 本研究采用差速離心聯(lián)合分離膠促凝管富集法對腹透液陽性瓶直接檢測， 得到較高的準(zhǔn)確性，能夠為臨床提供病原學(xué)證據(jù)，助于臨床早期使用抗生素改善患者的預(yù)后。