生長素2,4-D對獼猴桃果實抗灰霉病的誘導(dǎo)作用

楊 帥，張劍濤，唐建民，李哲馨

（1.重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，重慶 萬州 404100；2.重慶文理學(xué)院 a.園林與生命科學(xué)學(xué)院；b.特色植物研究院，重慶 永川 402160）

獼猴桃Actinidia chinensis原產(chǎn)于我國，是我國山區(qū)脫貧攻堅的特色優(yōu)勢樹種，具有較高的經(jīng)濟效益、生態(tài)效益和社會效益。獼猴桃果實采后易受多種真菌感染，真菌感染果實后會造成巨大的經(jīng)濟損失并引發(fā)潛在的食品安全問題?；颐咕鶥otrytis cinerea是引起獼猴桃采后病害的主要病原菌之一，其孢子在傷口處感染果實，導(dǎo)致果實迅速腐爛變質(zhì)[1-4]。目前，獼猴桃灰霉病的防治仍以化學(xué)措施為主?；瘜W(xué)殺菌劑能夠有效防治獼猴桃灰霉病，卻存在較多問題，例如導(dǎo)致病原體產(chǎn)生耐藥性、食用后危害人體健康等[5]。

以物理、化學(xué)和生物激發(fā)子誘導(dǎo)水果對致病微生物產(chǎn)生自然抗性受到了越來越多的關(guān)注[6-7]。植物生長素是植物體內(nèi)重要的生長調(diào)節(jié)因子，近年來被證實在植物病害防御中也發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。生長素可分為植物內(nèi)源生長素和人工合成生長素。研究結(jié)果表明，外源生長素處理可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)源生長素的水平來調(diào)控植物體細胞分裂。不同激素配合使用可能更有利于植株生長[8]。生長素、細胞分裂素和脫落酸的平衡作用可調(diào)控植株的生長勢，且濃度較高的生長素和細胞分裂素或濃度較低的ABA 有利于植株的生長[9]。吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）和吲哚-3-丁酸（indole-3-butyric acid，IBA）均屬于植物內(nèi)源生長素。其中IAA 是活性內(nèi)源生長素的主要表現(xiàn)形式，IBA 是IAA 的前體物質(zhì)。人工合成生長素種類繁多，包括1-萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid，NAA）和2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D）等，其化學(xué)性質(zhì)較IAA 更穩(wěn)定[10-11]。研究結(jié)果表明，各類生長素均可參與植物對病原微生物的防御。擬南芥中，生長素信號突變體axr1、axr2 和axr6在生長素誘導(dǎo)的Skp1-Cullin-F-box（SCF）泛素化途徑中存在缺陷，會導(dǎo)致生長素的運輸受到抑制，并增強擬南芥對黃瓜知球殼菌Plectosphaerella cucumerina和灰霉菌的易感性[12]。在煙草中木薯MeAux/IAAs基因的過表達，提高了其對細菌性萎蔫病菌Xanthomonas axonopodis的抗性，MeAux/IAAs沉默的煙草植株則表現(xiàn)出對該病菌的高度敏感性，MeAux/IAAs基因表達的改變也導(dǎo)致植物防御反應(yīng)中致病相關(guān)基因、活性氧積累和胼胝質(zhì)發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化[13]。在水稻中IAA 代謝相關(guān)基因OsGH3.1和OsCYP71Z2的過表達均能顯著提高水稻植株對細菌稻黃單胞菌Xanthomonas oryzae和稻瘟病菌Magnaporthe grisea的廣譜抗性[14-15]。病原菌通過向被侵染的細胞分泌生長素IAA 或增強寄主植物IAA 的合成，使寄主細胞內(nèi)IAA 水平迅速增加，高濃度的IAA可降低植物細胞壁的pH，導(dǎo)致胞壁結(jié)構(gòu)蛋白酸化，細胞壁發(fā)生重排，繼而引起細胞壁松弛，細胞擴張，從而有利于病原微生物的入侵和擴散[14]。

生長素在果實采后貯運保鮮中也起到了積極的作用。采用生長素IAA 處理可以延緩采后草莓果實的成熟，且對草莓果實理化性質(zhì)相關(guān)基因的表達具有重要的調(diào)節(jié)作用，包括上調(diào)表達AUX/IAA、ARF、TOPLESS和編碼E3 泛素蛋白連接酶及膜聯(lián)蛋白的基因，下調(diào)與果膠解聚、細胞壁降解、蔗糖和花青素生物合成相關(guān)基因的表達[16]。IAA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過調(diào)節(jié)乙烯的生物合成，參與調(diào)控木瓜、蘋果等果實的采后成熟過程[17-18]。采用2,4-D 處理橙子，可導(dǎo)致果實中水楊酸、脫落酸含量的增加和乙烯含量的降低，木質(zhì)素和水分含量的增加，防御酶基因的上調(diào)表達，從而提高橙子的防御脅迫能力，緩解果實衰老[19]。使用NAA 處理草莓果實時，可通過降低重要細胞壁降解基因的轉(zhuǎn)錄水平，防止冷藏期間細胞壁的正常降解，說明NAA 可通過影響草莓果實細胞壁組成和細胞壁修飾基因表達來調(diào)控果實成熟等[20]。因此，在采收階段，提前進行生長素干預(yù)，可能對釆后獼猴桃果實抗灰霉病有一定的作用。

目前，關(guān)于生長素在植物病害防御中的作用有著較為廣泛的研究報道，卻鮮見生長素對采后果蔬病害或抗性影響的相關(guān)研究報道。為了明確植物生長素對采后果實抗性誘導(dǎo)的作用，本研究中以采后常溫儲藏且遺傳背景明確的紅陽獼猴桃果實為材料，研究各類植物生長素對獼猴桃果實灰霉病的誘導(dǎo)抗性作用規(guī)律，并檢測外源生長素處理后獼猴桃果實組織中抗性相關(guān)生理指標和理化品質(zhì)指標及抗性相關(guān)基因的表達。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 果實選擇與預(yù)處理

以紅陽獼猴桃果實為研究對象。在授粉后第130 天，采收形狀、大小、質(zhì)量（93 g）、成熟度等外觀品質(zhì)基本相同且無機械損傷及病菌感染的果實，并在采后5 h 內(nèi)運回實驗室。使用0.1%的次氯酸鈉（NaClO）溶液浸泡消毒2 min，再用流動的自來水沖洗，并在室溫下晾干（20 ～25 ℃）后備用。

1.1.2 培養(yǎng)基配制

馬鈴薯葡萄糖固體（PDA）培養(yǎng)基：稱取200 g新鮮馬鈴薯，洗凈、去皮、切碎，加1 000 mL 水煮沸0.5 h，紗布過濾取汁，加入20 g 葡萄糖、20 g 瓊脂，定容至1 000 mL。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，稍冷卻后加入終質(zhì)量濃度50 mg/L 卡那霉素，倒平板備用。

1.1.3 病原菌

灰霉菌為實驗室保藏菌種CJLC2，菌種保存在-80 ℃超低溫冰箱中。將菌種取出后，置于冰上溶解，無菌條件下接種于PDA 培養(yǎng)基上，在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)活化3 周后，再次轉(zhuǎn)接到新的PDA 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2 周后即可稀釋并用于侵染獼猴桃果實。

1.2 試驗方法

1.2.1 灰霉菌侵染試驗設(shè)計

1）不同種類生長素對獼猴桃果實灰霉病抗性的誘導(dǎo)作用。使用已消毒的打孔器在5 組獼猴桃果實表面形成大小、深度一致的傷口（5 mm×3 mm），使用移液槍在傷口處分別注入10 μL 的IAA、IBA、2,4-D、NAA 溶液（質(zhì)量濃度均為50 mg/L，已過濾除菌），以無菌水為對照（CK）。在恒溫恒濕條件下（25 ℃，相對濕度高于95%）誘導(dǎo)處理24 h 后，在已干燥的傷口處注入10 μL 灰霉菌孢子懸浮液（每毫升孢子數(shù)量為1×104），并用PE 塑料膜密封，貯藏于恒溫箱。選取4 種生長素中誘導(dǎo)抗性效果最好的生長素進行后續(xù)試驗。

2）不同濃度生長素對獼猴桃果實灰霉病抗性的誘導(dǎo)作用。使用已消毒的打孔器在6 組獼猴桃果實表面形成大小、深度一致的傷口（5 mm×3 mm），使用移液槍在傷口處分別注入10 μL 10、50、100、200、500 mg/L 的生長素溶液（已過濾除菌），以無菌水為對照（CK）。在恒溫恒濕條件下（25 ℃，相對濕度高于95%）誘導(dǎo)處理24 h后，在已干燥的傷口處注入10 μL 灰霉菌孢子懸浮液（每毫升孢子數(shù)量為1×104），并用PE 塑料膜密封，貯藏于恒溫箱。

3）生長素不同誘導(dǎo)時長對獼猴桃果實灰霉病抗性的誘導(dǎo)作用。使用已消毒的打孔器在2組獼猴桃果實表面形成大小、深度一致的傷口（5 mm×3 mm），使用移液槍在傷口處分別注入10 μL 無菌水（CK）和50 mg/L 的生長素。在恒溫恒濕條件下（25 ℃，相對濕度高于95%）分別誘導(dǎo)處理0、6、12、24、48 h 后，在已干燥的傷口處注入10 μL 灰霉菌孢子懸浮液（每毫升孢子數(shù)量為1×104），并用PE 塑料膜密封，貯藏于恒溫箱。

每個處理重復(fù)3 次，每次重復(fù)9 個果實。每天定時測量并記錄果實傷口的發(fā)病率和病斑直徑，結(jié)果以接種后72 h 時的平均發(fā)病率和平均病斑面積表示。

1.2.2 防御酶活性檢測

在使用生長素和無菌水（CK）處理獼猴桃果實0、24、48、96、120 h 后，測定果肉中防御酶活性。

1）采用愈創(chuàng)木酚法檢測POD 活性。采集1 g 樣品，加入磷酸緩沖液（pH=7.8）和石英砂研磨勻漿，離心取上清，加入反應(yīng)液（0.1 mol/L 磷酸緩沖液加入28 μL 愈創(chuàng)木酚），待反應(yīng)液溶解后加入H2O2，并迅速測定吸光度。結(jié)果以每分鐘內(nèi)470 nm 處光密度（A470）變化0.01 為1 個酶活力單位。

2）采用紫外吸收法測定CAT 活性。采集1 g樣品，加入磷酸緩沖液（pH=7.8）和石英砂研磨勻漿，離心取上清，加入H2O2，迅速測定吸光度。以每分鐘內(nèi)240 nm 處光密度（A240）降低0.1 為1 個酶活力單位。

3）采用氮藍四唑（NBT）光化還原法測定SOD 活性。采集1 g 樣品，加入磷酸緩沖液（pH=7.8）和石英砂研磨勻漿，離心取上清，依次加入0.05 mol/L 磷酸緩沖液、130 nmol/L Met 溶液、750 μmol/L NBT、100 μmol/L EDTA、20 μmol/L核黃素和酶液，測定吸光度（A560）。以抑制NBT光化還原50%的酶用量為1 個酶活力單位[4]。

1.2.3 基因表達量分析

在使用生長素和無菌水（CK）處理獼猴桃果實0、24、48、96、120 h 后，將其迅速使用液氮冷凍并研磨，使用RNAiso Plus 和fruitmate 試劑盒（Takara，大連）提取獼猴桃總RNA，使用Allin-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR 試劑盒（全式金，北京）合成cDNA。根據(jù)獼猴桃基因組信息（http://kiwifruitgenome.org/），克隆獼猴桃抗病相關(guān)基因PR1（Actinidia00340）、PR4（Actinidia18363） 和PAL（Actinidia32440）的CDS 全長序列，并測序驗證。使用Green Two-Step qRT-PCR SuperMix 試劑盒（全式金，北京）進行基因表達量檢測，內(nèi)參基因選用β-actin[3]。獼猴桃qRT-PCR 引物序列見表1。

表1 獼猴桃果實抗病相關(guān)基因qRT-PCR 引物Table 1 qRT PCR primers for disease resistance related genes in kiwifruit

2 結(jié)果與分析

2.1 生長素誘導(dǎo)對獼猴桃果實灰霉病抗性的影響

2.1.1 不同種類生長素對獼猴桃果實灰霉病抗性的誘導(dǎo)作用

在灰霉菌侵染72 h 后，不同種類生長素處理下獼猴桃果實感染灰霉病的情況如圖1所示。由圖1可以看出，與無菌水對照組相比，使用相同濃度的4 種生長素誘導(dǎo)相同時長，均可有效降低獼猴桃果實灰霉病的發(fā)病率。與對照組相比，經(jīng)50 mg/L 生長素IAA 處理的獼猴桃果實的灰霉病發(fā)病率降低了24 個百分點（P＜0.05）；經(jīng)50 mg/L生長素IBA 處理的獼猴桃果實的灰霉病發(fā)病率降低了30 個百分點（P＜0.05）；經(jīng)50 mg/L 生長素2,4-D 處理的獼猴桃果實的灰霉病發(fā)病率降低了36 個百分點（P＜0.05）；經(jīng)50 mg/L 生長素NAA 處理的獼猴桃果實的灰霉病發(fā)病率降低了24個百分點（P＜0.05）。經(jīng)無菌水處理的獼猴桃果實病斑面積為1.021 cm2，經(jīng)IAA 處理的獼猴桃果實病斑面積為0.773 cm2，經(jīng)IBA 處理的獼猴桃果實病斑面積為0.688 cm2，經(jīng)2,4-D 處理的獼猴桃果實病斑面積為0.818 cm2。選取2,4-D 進行后續(xù)試驗。

圖1 不同種類生長素處理下獼猴桃果實感染灰霉病的情況Fig.1 Infection of actinidia fruit with B.cinerea under different auxin treatments

2.1.2 不同濃度2,4-D 對獼猴桃果實灰霉病抗性的誘導(dǎo)作用

在灰霉菌侵染72 h 后，不同濃度2,4-D 處理下獼猴桃果實感染灰霉病的情況如圖2所示。由圖2可以看出，不同濃度2,4-D 處理可影響獼猴桃果實灰霉病的發(fā)生和發(fā)展。當質(zhì)量濃度為100 ～500 mg/L 時，2,4-D 可不同程度抑制灰霉菌在獼猴桃傷口的侵染；當質(zhì)量濃度為50 mg/L 時，2,4-D 處理能顯著降低獼猴桃果實上灰霉病的發(fā)病率和平均病斑面積，與對照相比，處理后獼猴桃發(fā)病率降低了40 個百分點（P＜0.05），病斑面積也顯著減少。

圖2 不同濃度2,4-D 處理下獼猴桃果實感染灰霉病的情況Fig.2 Infection of actinidia fruit with B.cinerea under different concentrations of 2,4-D

2.1.3 不同2,4-D 誘導(dǎo)時長對獼猴桃果實灰霉病抗性的誘導(dǎo)作用

在灰霉菌侵染72 h 后，不同2,4-D 誘導(dǎo)時長條件下獼猴桃果實感染灰霉病的情況如圖3所示。由圖3可以看出，2,4-D 誘導(dǎo)時長可影響獼猴桃灰霉病的發(fā)生和發(fā)展。使用50 mg/L 的2,4-D 處理后直接接種，不能抑制獼猴桃果實傷口處灰霉菌的侵染。當誘導(dǎo)時長為12、24 和48 h 時，2,4-D 能在一定程度上抑制灰霉病的發(fā)生和發(fā)展。與對照無菌水處理相比，當誘導(dǎo)時長為12 h 時發(fā)病率降低了51.5 個百分點（P＜0.05），當誘導(dǎo)時長為24 h時發(fā)病率降低了50 個百分點（P＜0.05），當誘導(dǎo)時長為48 h 時發(fā)病率降低了58 個百分點（P＜0.05）。與對照相比較，當誘導(dǎo)時長為12 h 時病斑面積平均減少0.429 cm2，當誘導(dǎo)時長為24 h 時病斑面積平均減少0.397 cm2，當誘導(dǎo)時長為48 h時病斑面積平均減少0.367 cm2。

圖3 不同2,4-D 誘導(dǎo)時長處理下獼猴桃果實感染灰霉病的情況Fig.3 Infection of kiwifruit fruit with B.cinerea under different 2,4-D induction duration treatments

2.2 2,4-D 對獼猴桃果實防御酶活性的影響

2,4-D 處理下獼猴桃果實防御酶活性的變化如圖4所示。由圖4可以看出，使用2,4-D 處理獼猴桃果實可誘導(dǎo)獼猴桃果實防御酶活性的增強。獼猴桃果實SOD 活性在2,4-D 處理24 h 時顯著升高并達到峰值，約為對照組活性的1.10 倍，雖然之后活性降低，但至120 h 時活性仍然高于對照組，約是對照組的1.05 倍。獼猴桃果實CAT 活性在2,4-D 處理后呈波動上升，且在處理72 h 時達到峰值，約為對照組活性的1.19 倍，雖然之后活性降低，但至120 h 時仍然高于對照組，約是對照組的1.08倍。獼猴桃果實POD 活性在2,4-D 處理后72 h 時達到峰值，約為對照組活性的1.14 倍，雖然之后活性降低，但至120 h 時仍然高于對照組，約是對照組的1.03 倍。

圖4 2,4-D 處理下獼猴桃果實防御酶活性的變化Fig.4 Changes of defense enzyme activities in kiwifruit treated with 2,4-D

2.3 2,4-D 對獼猴桃果實抗病相關(guān)基因表達的影響

2,4-D 處理下獼猴桃果實抗病相關(guān)基因PR1、PR4和PAL表達的變化如圖5所示。由圖5可以看出，使用2,4-D 處理獼猴桃果實可誘導(dǎo)獼猴桃抗病相關(guān)基因上調(diào)表達。在使用2,4-D 處理24 h時，PR1和PR4的表達量迅速增加，與對照組相比表達量分別上調(diào)了9.33 和2.27 倍，隨后兩者均有逐漸降低的趨勢。與對照組相比，PAL的表達量在2,4-D 處理24 h 時也出現(xiàn)了上調(diào)，在處理48 h 時表達量最高，是對照的5.27 倍，隨后表達量下調(diào)。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果顯示，濃度適宜的內(nèi)源生長素IAA和IBA 以及合成生長素NAA 和2,4-D，均可誘導(dǎo)獼猴桃果實對灰霉菌產(chǎn)生抗性，但誘導(dǎo)抗性的強度存在差異。使用相同濃度的4 種生長素誘導(dǎo)相同時長后，受灰霉菌侵染的獼猴桃果實的發(fā)病率以2,4-D 處理的為最低。抑制獼猴桃果實灰霉病的最適2,4-D 質(zhì)量濃度為50 mg/L，在此濃度下可顯著降低灰霉病的發(fā)病率和平均病斑面積，在誘導(dǎo)12 ～48 h 后2,4-D 均能抑制灰霉病的發(fā)生和發(fā)展。為了解生長素2,4-D 誘導(dǎo)獼猴桃果實抗病的機制，檢測了防御相關(guān)酶活性和抗病相關(guān)基因表達量，結(jié)果表明生長素2,4-D 可能通過增加防御酶活性及調(diào)控抗病相關(guān)基因的表達，誘導(dǎo)獼猴桃對灰霉病的抗性響應(yīng)。因此，生長素2,4-D 處理是誘導(dǎo)獼猴桃果實自然抗性和抑制灰霉病的有效方法。

近年來，生長素在植物抗病及植物激素互作中的作用逐漸被關(guān)注[13,21-23]。如在玉米Zea mays中發(fā)現(xiàn)的抗病基因座qRfg2，可以預(yù)防玉米赤霉病以及真菌類病害如赤霉病等，qRfg2 的致病基因ZmAuxRP1可促進IAA 的生物合成，IAA 可以及時有效地調(diào)節(jié)生長-防御平衡，從而優(yōu)化植物的適應(yīng)性等[22]。然而關(guān)于生長素對采后果實的抗病作用機制的研究鮮有報道。Zhang 等[21]在研究生長素誘導(dǎo)梨果實抗性中的作用時，發(fā)現(xiàn)使用100 ～500 mg/L 的IAA 誘導(dǎo)24 ～48 h 時，梨果實對藍霉腐病的抗性明顯增強，表明IAA 在誘導(dǎo)梨果實對病原菌產(chǎn)生抗性方面具有顯著作用，通過對防御酶活性及抗病相關(guān)基因的表達水平進行檢測，推測該機制可能與誘導(dǎo)防御相關(guān)酶和調(diào)節(jié)基因表達密切相關(guān)。植物受到外源因素刺激后，不能立刻獲得抗性，而是需要一定時長才能發(fā)生響應(yīng)[24]。在前期試驗中，將不同濃度生長素2,4-D添加至PDA 培養(yǎng)基對灰霉菌進行接種培養(yǎng)，未發(fā)現(xiàn)顯著的抑制作用。這些結(jié)果表明，生長素可能通過誘導(dǎo)獼猴桃果實產(chǎn)生抗性，抵御灰霉菌的侵染。可以將生長素2,4-D 作為有效防治果實采后病害的手段。

生物和非生物脅迫因子誘導(dǎo)植物組織產(chǎn)生過量的活性氧。SOD、POD 和CAT 是植物組織中重要的抗氧化酶，在清除活性氧方面起重要作用[25]。例如，2年生赤皮青岡幼苗較1年生幼苗具備更強的抗氧化能力，脅迫狀態(tài)下赤皮青岡幼苗POD、SOD 的響應(yīng)也更為迅速，間接說明赤皮青岡能通過POD 等抗氧化物來適應(yīng)一定程度下的脅迫環(huán)境[26]。本研究結(jié)果顯示，使用無菌水處理獼猴桃果實時，由于造成傷口且與空氣接觸，果實中SOD、POD 及CAT 活性均有所增加。使用2,4-D處理后，獼猴桃果實的SOD、POD 活性可在短時間內(nèi)（24 h）被誘導(dǎo)迅速增加，顯著高于對照組，但在誘導(dǎo)72 h 時出現(xiàn)下降的趨勢。

植物在受到生物或非生物脅迫時會誘發(fā)病原相關(guān)蛋白（PRs）的表達，在較多植物物種中PR1被用作系統(tǒng)獲得抗性的分子標記[27]。本研究結(jié)果顯示：在2,4-D 誘導(dǎo)處理24 h 時獼猴桃PR1和PR4基因的表達量迅速增加，與無菌水處理相比分別上調(diào)了9.33 和2.27 倍，隨后其表達量有逐漸降低的趨勢；在2,4-D 處理24 h 時，PAL基因的表達量也出現(xiàn)了上調(diào)，在處理48 h 時表達量最高，是對照的5.27 倍，隨后表達量下調(diào)。這與前人研究結(jié)果相一致，例如：外源2,4-D 處理可導(dǎo)致PR4基因在柑橘類果實的上調(diào)表達，并顯著減少水果腐敗的發(fā)生[19]；Gamma 輻射可誘導(dǎo)梨果實產(chǎn)生對病原真菌擴展青霉Penicillium expansu的抗性，并可上調(diào)表達PR1和PR4基因[28]；苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶基因PAL可促進植物產(chǎn)生木質(zhì)素等抗性次生代謝產(chǎn)物，與植物抗病息息相關(guān)[29]；采用不同灰霉菌菌種侵染番茄果實，可誘導(dǎo)果實產(chǎn)生生長素IAA、水楊酸，并伴隨著PAL 酶活性的顯著提升[30]。但其具體作用機制有待進一步探索。

本研究結(jié)果證明了生長素在植物與真菌的相互作用中具有一定的重要性[31]，但尚未闡明病毒蛋白與生長素調(diào)節(jié)因子之間的相互作用。后續(xù)可研究2,4-D 對未受傷獼猴桃果實自然腐爛的影響，以及在生化和分子水平上IAA 信號通路與獼猴桃果實防御機制之間的潛在相互作用。闡明生長素精確防御病毒侵染的機制，明確生長素信號通路在宿主防御反應(yīng)中的作用及其被病毒破壞的機制，將有助于為提高植物的抗病毒能力提供新思路。