高效液相色譜法測(cè)定飼料中黃霉素含量

鄭 蓉，鈄麗敏，魯丁丁

鈦和檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司，上海 200060

黃霉素（Flavomycin）又稱為斑伯霉素、默諾霉素A，是從灰綠鏈霉素菌（斑伯氏鏈絲菌）的發(fā)酵產(chǎn)物中分離的磷酸多糖類抗生素。黃霉素主要是通過(guò)干擾構(gòu)成細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)物質(zhì)肽聚糖的生物合成而抑制細(xì)菌的繁殖[1]，對(duì)大多數(shù)的革蘭氏陽(yáng)性菌和部分革蘭氏陰性菌有效。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的主要作用是通過(guò)影響腸道細(xì)菌的滋生，使腸道菌群的代謝活動(dòng)變得有益于動(dòng)物生長(zhǎng)，間接改善了營(yíng)養(yǎng)的消化和吸收，是一種新型的抗生素類藥物添加劑或促生長(zhǎng)劑[2-5]。

黃霉素至少含有5 種活性成分，其主要活性組分為黃霉素A，根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定，其含量應(yīng)大于總活性成分的50%，因此可以通過(guò)檢測(cè)樣品中黃霉素A 的含量來(lái)確定黃霉素用藥情況。黃霉素A 的檢測(cè)方法多采用配有紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀（HPLC）或采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定（LC-MS/MS）[6-9]，液質(zhì)聯(lián)用儀雖然靈敏度高，但價(jià)格昂貴，基層檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室往往難以配置，且因飼料中黃霉素的含量高，用液相色譜儀就能進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)。本研究對(duì)黃霉素液相色譜檢測(cè)方法進(jìn)行研究，黃霉素藥物經(jīng)色譜柱分離后可用紫外檢測(cè)器進(jìn)行定性定量分析。該方法的建立可以提供結(jié)果準(zhǔn)確可靠的黃霉素殘留測(cè)定，為養(yǎng)殖企業(yè)及時(shí)檢測(cè)飼料中黃霉素含量提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1）甲醇、乙腈、正己烷，為色譜級(jí)試劑（美國(guó)Tedia公司），其余為分析純?cè)噭?。黃霉素標(biāo)準(zhǔn)品（99%，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）。

2）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取一定量的黃霉素標(biāo)準(zhǔn)品，分別用體積比1∶1 的甲醇水溶液超聲溶解，配置成1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

3）流動(dòng)相緩沖液：分別準(zhǔn)確稱取3.0 g 庚烷基磺酸鈉、l5.5 g 磷酸氫二鉀、1.0 g 磷酸二氫鉀，加水溶解后稀釋至l 000 mL，用20%的磷酸溶液調(diào)節(jié)至pH 值為7.0±0.1。

4）Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），配有紫外檢測(cè)器，CF16RXⅡ型離心機(jī)（HITACHI 公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 樣品處理方法

稱?。?.00±0.05）g 樣品于50 mL 離心管中，加入5 mL 甲醇水（體積比1∶1）溶液，振蕩5 min，50 ℃水浴超聲提取30 min，4 000 r/min 離心5 min，將提取溶液轉(zhuǎn)入另一離心管中，殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄔ偬崛? 次，合并提取液。在提取液中加入5 mL 正己烷振蕩5 min，離心，去除上層，重復(fù)操作1 次，下層溶液過(guò)0.45 μm 水相濾膜，供高效液相色譜測(cè)定。

1.3 儀器分析方法

色譜柱：Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，2.5 μm）；柱溫：40 ℃；柱流速1.0 mL/min；運(yùn)行時(shí)間：50 min；進(jìn)樣量50 μL；流動(dòng)相為乙腈：緩沖液（35∶65，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)256 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法線性范圍與定量限

將1 mg/mL 的黃霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用1∶1 的甲醇水溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.0、2.5、10、50、100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，取50 μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜儀中，按以上儀器條件進(jìn)行分析，以黃霉素化合物的峰面積對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度做校準(zhǔn)曲線。黃霉素藥物的線性回歸方程為：Y=6.786X+4.495，相關(guān)系數(shù)為0.997。

試驗(yàn)測(cè)得在黃霉素加標(biāo)量為1.0 mg/kg 時(shí)，儀器信噪比＞3；加標(biāo)量為2.0 mg/kg 時(shí)，儀器信噪比＞10，同時(shí)回收率＞70%，精密度≤15%，因此將1.0 mg/kg 確定為方法檢測(cè)限，2.0 mg/kg 確定為定量限。

2.2 方法回收率與精密度

在陰性飼料樣品中添加3 個(gè)水平的黃霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平做6 個(gè)平行樣。測(cè)定結(jié)果顯示，平均添加回收率為83.9%～88.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.40%～10.20%（表1），空白飼料樣品加標(biāo)樣品色譜圖見圖1。

表1 飼料樣品中添加黃霉素的平均回收率和精密度

3 討 論

1）提取方法的選擇。黃霉素為有機(jī)弱酸，易溶于水，因此確定將有機(jī)溶劑與水混合后作為提取劑。同時(shí)，采用加熱超聲的方法能使溶劑完全滲透飼料肌肉組織，促進(jìn)黃霉素的溶出。本試驗(yàn)分別用純甲醇、30%甲醇水、50%甲醇水和70%甲醇水作為提取劑，在50 ℃加熱超聲30 min，比較提取效率，結(jié)果回收率分別為58.2%、77.4%、89.3%、82.7%，50%甲醇水溶液提取效率略高。此外，考慮到水相比例高的情況下，用正己烷去脂效果更好，確定采用50%甲醇水溶液提取。

由于飼料樣品中含有脂肪，需要對(duì)提取液凈化，常用的樣品凈化方法包括液液萃取和使用固相萃取柱等，黃霉素藥物結(jié)構(gòu)中有羥基，可以采用陰離子柱或C18 柱固相萃取凈化的方法，但是過(guò)柱凈化時(shí)間較長(zhǎng)，操作步驟復(fù)雜。因此，利用黃霉素藥物不易溶于正己烷的性質(zhì)，采用液液萃取的方式。試驗(yàn)采取在50%的甲醇水溶液中添加黃霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用5 mL 正己烷去脂2 遍，下層溶液上機(jī)測(cè)定，來(lái)考察正己烷去脂帶來(lái)的損失，結(jié)果回收率為99.6%，幾乎沒有損失。因此，可以采用在提取液中加入正己烷進(jìn)行液液萃取的方法對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化。

2）儀器條件的優(yōu)化。選擇高效液相色譜法較為常用的C18 柱作為色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃霉素在Agilent SB-C18 色譜柱上能獲得理想的分離效果，再采用2種儀器條件進(jìn)行分析。A 的流動(dòng)相采用藥典中推薦的0.2%甲酸銨與乙腈以45∶55 的體積比混合，紫外吸收波長(zhǎng)為258 nm。B 的流動(dòng)相采用離子對(duì)試劑庚烷磺酸鈉、磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀的混合液與洗脫能力較強(qiáng)的試劑乙腈以35∶65 的體積比混合。按B 方法分析的黃霉素峰形更好，穩(wěn)定性好，同時(shí)有效成分黃霉素A 與其他組分完全分離（圖1）。庚烷磺酸鈉在水中電離成庚烷磺酸鈉負(fù)離子，與胺類電離成的胺正離子結(jié)合，黃霉素分子中含有胺基，與庚烷磺酸鈉形成離子對(duì)，使各組分間得到很好分離。黃霉素在流動(dòng)相中完全電離受pH 值及離子對(duì)試劑濃度影響較大。本試驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相的pH 值、離子對(duì)試劑濃度、流速以及配比均進(jìn)行了優(yōu)化，最后確定最佳儀器條件。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)色譜條件的優(yōu)化和樣品前處理方法的篩選，建立了飼料中黃霉素殘留量的高效液相色譜方法，該方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度和精密度均能滿足方法要求，可實(shí)現(xiàn)對(duì)飼料中黃霉素殘留含量的快速檢測(cè)。