宏基因組測序分析奶牛運動場土壤抗生素抗性基因

胡 平，關文怡，雷莉輝，蔡澤川

北京農業(yè)職業(yè)學院，北京 102442

抗生素的使用在養(yǎng)殖業(yè)中不可避免，研究表明，真正參與動物新陳代謝而被利用的抗生素僅占用藥總量很少的比例，而大部分抗生素則隨著動物糞便和尿液直接排出體外，隨糞尿排出體外的還包括在動物腸道內誘導產生的帶有抗性基因的菌株[1-4]。動物糞便中含有抗性基因的菌株成為了土壤和地下水中重要的抗性基因污染源[5]。研究表明，抗性基因除了可以在動物的腸道菌群之間傳播，還會在進入土壤后與土壤中的微生物之間發(fā)生傳播[6]。通過基因的橫向轉移，抗性基因在土壤、水源、空氣等環(huán)境介質中遷移轉化，并在生存選擇中逐漸增加豐度，當這些抗性基因隨著食物鏈進入人體時，就增加了人體的抗生素耐藥性[7]。為了減少奶牛蹄病發(fā)生，奶牛運動場地面通常使用三合土或部分鋪設透水磚，隨著沖洗用水和降雨等沖刷作用，糞便與尿液中殘留的抗生素與微生物逐漸滲透進入土壤并向周圍逐漸擴散，造成養(yǎng)殖場糞便中抗生素抗性基因在環(huán)境中的富集與傳播。因此，研究土壤中抗性基因分布情況對減少抗生素的濫用和耐藥菌株的產生具有重要意義。本試驗通過采集北京市某區(qū)規(guī)?；膛＿\動場土壤對抗性基因進行宏基因組分析，旨在找出奶牛場抗性基因分布情況，并指導抗生素使用。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與處理

試驗樣本采集自北京市某規(guī)?；膛＿\動場內，共計12 份土壤樣本。按照采樣部位不同分為3組，CTN（1-4）為運動場中心位置土壤樣本，CBH（1-4）為運動場圍欄外0.5 m 土壤樣本，CB2M（1-4）為運動場外2 m 土壤樣本。所有土壤樣本均采集自距地表0～20 cm 深度的松軟土壤，采用滅菌鏟子取樣，封裝于滅菌樣本管中。所有樣本均置于干冰盒中迅速轉運到實驗室-80 ℃冰箱中保存待檢。

1.2 總基因組DNA 提取與建庫測序

將土壤樣本按照PowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio Laboratories，Carlsbad，CA）試劑盒說明書進行微生物組DNA 提取。然后用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法檢測DNA 質量和濃度。質檢合格的DNA 樣品用Covaris 超聲波破碎儀將基因組DNA 隨機打斷成長度約300 bp 的小片段，經純化、PCR 擴增等步驟完成文庫制備。使用Qubit 初步定量構建完成的文庫，然后使用Agilent 2100 檢測文庫的插入片段，符合預期后使用Q-PCR 法對文庫的有效濃度進行準確定量（文庫有效濃度＞3 nmol/L）。最后把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求進行pooling，在Illumina HiSeq4000 平臺上進行測序。

1.3 數據分析處理

原始數據使用Trimmomatic 軟件進行系列質控，將質控后得到的高質量序列clean reads 使用DIAMOND BLASTX 算法進行比對和物種注釋。用組裝軟件MEGAHIT（v1.0.6）對測序數據進行組裝，過濾組裝結果中500 bp 以下的片段。采用Prodigal 軟件對組裝得到的contig 序列進行ORF（open reading frame）預測，使用CD-HIT 軟件對預測的結果去冗余，從而得到非冗余基因集。采用Bowtie 軟件將測序數據與構建的非冗余基因集進行比對，并統(tǒng)計單個基因在不同樣本的豐度信息。將預測得到的非冗余基因集與功能注釋數據庫nr、Swiss-Prot、Kegg、Cog/Kog、eggNOG、GO、Pfam、ARDB/CARD、CAZyme 進行比對和注釋。

1.4 前期研究基礎

本試驗前期通過宏基因組測序對該奶牛運動場土壤和糞便微生物群落結構進行分析，測序結果表明變形菌門和放線菌門在土壤中占據絕對優(yōu)勢；子囊菌門、擔子菌門為土壤中的優(yōu)勢真菌，奇古菌門和廣古菌門為優(yōu)勢古菌群落。在新鮮糞便中厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌；優(yōu)勢真菌群落為擔子菌門、毛霉門和壺菌門。土壤中微生物豐度見表1。

表1 宏基因組測序分析土壤中微生物豐度排名

2 結果與分析

2.1 測序數據組裝與分析

通過宏基因組測序，3 個組12 個樣本中，總計獲得343 850 519 條clean reads，每個樣本的reads數范圍在16 632 548～25 716 812 條，組裝后的總contigs 長度超過1 000 bp 的為778 998，N50 為893 bp，L50 為989 937 bp，表明組裝的結果較好，序列長度可用。

2.2 運動場土壤樣本中ARGs 多樣性

通過宏基因組檢測及CARD 數據庫注釋，在3個分組的12 個樣本中，占比前10 的抗性基因為ARO:3000501、ARO:3004480、ARO:3000804、ARO:3000444、ARO:3002983、ARO:3003318、ARO:3004144、ARO:3003031、ARO:3003923、ARO:003010。其 中，ARO:3000501 在CB2M 組中占比為29.67%，在CBH組占比為28.29%，在CTN 組占比為32.67%；ARO:3004480 在CB2M 組占比為16.49%，在CBH 組占比為28.96%，在CTN 組占比為19.87%；ARO:3000804 在CB2M 中占比為9.69%，在CBH 中占比為4.84，在CTN 中占比為13.46%；ARO:3000444 在CB2M 組占比為5.67%，在CBH 組占比為4.61%，在CTN 占比為6.80%；ARO:3002983 在CB2M 占比為5.08%，在CBH 占比為7.22%，在CTN 占比為2.13%；ARO:3004144 在CB2M 占比為4.78%，在CBH 占比為3.81%，在CTN 占比為7.24%；其余抗性基因在各組占比都低于5%（圖1、圖2）。

2.3 CRAD 注釋的前13 位抗性基因

通過分析抗生素抗性基因檢出率發(fā)現(xiàn)，土壤中抗性基因檢出率最高的是rpoB2 和rpoB，在CRAD注釋為利福霉素抗性基因，耐藥菌為諾卡氏菌屬和雙歧桿菌屬。其次是MexF和MexW，注釋為苯丙醇類、二氨基嘧啶、氟喹諾酮、四環(huán)素類、吖啶染料、大環(huán)內酯類抗生素，顯示了多重耐藥特點，耐藥菌株主要為銅綠假單胞菌。此外值得注意的是抗性基因mexQ、oqxB、MuxC和MexK都顯示為多重耐藥性，主要耐藥菌株為肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和伯克氏菌等。此外rphA和oleB分別顯示了多重耐藥性，但是在CARD 注釋中未有報告，顯示了上述2個抗性基因可能是少見但容易被忽略的多重耐藥基因，其中攜帶oleB的耐藥菌株可能導致大部分G+球菌發(fā)生廣泛耐藥（表2）。

表2 運動場土壤抗性基因與抗生素類別

續(xù)表2

2.4 Lefse 分析組間差異抗性基因

通過LDA 閾值3 篩選3 組樣本之間的差異基因，結果顯示，在CB2M 組中顯著高于其他組的抗性基因主要有以下12 個：parY、oqxB、MexW、MexI（ARO:3000808）、MexK、aadA11（ARO:3002611）、cmlR（ARO:3002690）、mexQ、mexX（ARO:3003034）、smeR（ARO:3003066）、aadA6（ARO:3002606）、CpxR（ARO:3004054）。

在CBH 組中顯著高于其他組的抗性基因主要有以下10 個：利福霉素耐藥雙歧桿菌rpoB突變株（ARO:3004480）、amrB、oleB、vanRO（ARO:3002930）、MexB（ARO:3000378）、ceoB、NovA（ARO:3002522）、MuxC（ARO:3004075）、tlrC（ARO:3002827）、muxB（ARO:3004074）。

在CTN 組中顯著高于其他組的抗性基因主要有 以 下5 個：MexF（ARO:3000804）、rphA、AxyY、MexD（ARO:3000801）、oleC（ARO:3003748）（圖3）。

2.5 抗性基因circlize 分析

基因抗性基因的注釋結果，選取Top10 的抗性基因進行circlize 分析（圖4）：圖4 上半圓顯示的是樣本名稱，下半圓為各個樣本對應的抗性基因，從圖4 可以看出不同抗性基因在每個樣本中的豐度情況。

3 討 論

3.1 運動場不同位置土壤中抗性基因分布情況

通過對奶牛運動場3 個不同位置CB2M、CBH和CTN 的土壤宏基因組分析可見，從運動場中心向運動場外的土壤中，隨著與運動場中心點半徑增大，其相應的土壤中抗性基因數量也顯著增多。其中，CB2M 組檢出率最高的抗性基因是parY，CBH組檢出率最高的抗性基因是rpoB，CTN 組檢出率最高的抗性基因是MexF。分析該結果可能的原因是，奶牛場排泄物中攜帶的抗生素殘留物以及奶牛消化道中攜帶抗性基因的耐藥菌隨著糞便和尿液逐漸滲透進入運動場的土壤中，并隨著滲透與沖刷向外擴散。因為土壤和沉積物是固體物質，密度較大、流動較慢，容易發(fā)生富集作用，造成抗生素更易在土壤中富集和持久傳播，從而脅迫土壤中原有的土著微生物產生耐藥性[8]。

有報道稱施用過奶牛和豬糞的土壤中，以低G+C 革蘭氏陽性硬壁菌和高G+C 革蘭氏陽性放線菌占主導地位，尤其是鏈霉菌屬占主導地位[9]。這與本次試驗中統(tǒng)計的CB2M 檢出率最高的parY抗性基因相一致。不同的國家和地區(qū)施用過奶牛糞便的土壤中優(yōu)勢菌種也有區(qū)別[10-12]，但從各項研究均可看出糞便污染的土壤中都含有大量抗生素抗性細菌和抗性基因，對環(huán)境中的耐藥菌株產生都有重要的意義。

3.2 奶牛運動場土壤中抗性基因菌群分析

由圖4 觀察可見，3 組土壤樣本中排名前10 位的 抗 性 基 因 為rpoB2、rpoB、MexF、rphA、amrB、AxyY、streptomyces、mexW、oqxB、ceoB，對應的耐藥菌株分別為諾卡氏菌屬、雙歧桿菌屬、銅綠假單胞菌、不溶性無色桿菌、鏈霉菌屬、肺炎克雷伯菌等。

rpoB是來源于雙歧桿菌的抗性基因。雙歧桿菌是耐抗生素的益生菌，是腸道的有益菌群，然而腸道微生物之間的水平基因轉移可能產生有害的耐藥菌株，如結核分枝桿菌。Dhanashree 等[13]分析了雙歧桿菌抗結核藥物耐藥和rpoB突變，研究發(fā)現(xiàn)動物雙歧桿菌、長雙歧桿菌和青少年雙歧桿菌對吡嗪酰胺、異煙肼和鏈霉素表現(xiàn)出相當大的耐藥性，而青少年雙歧桿菌在利福霉素袋和袋外區(qū)域都有突變，并且對利福霉素也表現(xiàn)出相當大的耐藥性。由于基因重復，諾卡氏菌的基因組包括對利福平敏感的RNA 聚合酶β 亞單位（rpoB）和對利福平耐藥的RNA 聚合酶β 亞單位（rpoB）基因，2 種基因產物之間約有88%的相似性。rpoB變體的表達導致利福平敏感性被利福平耐藥性取代[14]。

MexF 是MexEF-OprN 復合物的多藥內膜轉運體。mexF對應于銅綠假單胞菌PAO1 中的2 個位點（基因名稱：mexF/mexB）和銅綠假單胞菌LESB58 中的4 個位點（基因名稱：mexD/mexB）。MexW 是外排復合物MexEF-OprN 的RND 型膜蛋白，具有廣泛的耐藥性。攜帶該突變基因的銅綠假單胞菌對多種抗生素產生多重耐藥，如苯丙醇類、二氨基嘧啶、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、吖啶染料、大環(huán)內酯類[15]。

amrB 是AmrAB-OprM 多藥外排復合物的膜融合蛋白，具有該抗性基因的類鼻疽伯克氏菌，銅綠假單胞菌具有抗生素外排泵，從而對氨基糖苷類抗生素發(fā)生耐藥。

AxyY 是無色桿菌AxyXY-OprZ 外排泵系統(tǒng)的周質銜接蛋白，具有該抗性基因的不溶色桿菌、木糖氧化酶無色桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、阪崎克龍桿菌、肺炎克雷伯菌通過抗生素外排泵，對多種抗生素如大環(huán)內酯類、頭孢菌素、氨基糖苷類和氟喹諾酮產生多重耐藥性。

oqxB是對氟喹諾酮耐藥的RND 外排泵，具有該抗性基因的弗氏檸檬酸桿菌、霍瑪腸桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、腸沙門氏菌、宋內志賀氏菌等菌株對多種抗生素如四環(huán)素類、甘氨酰環(huán)素、硝基呋喃類、二氨基嘧啶類和氟喹諾酮類產生多重耐藥性[16]。

3.3 奶牛場耐藥情況分析

通過本試驗分析發(fā)現(xiàn)，該奶牛運動場土壤中存在大量抗性基因分布，耐藥菌包括諾卡式菌屬、鏈霉菌屬、銅綠假單胞菌、雙歧桿菌屬、肺炎克雷伯菌等。其中，諾卡氏菌屬、銅綠假單胞菌感染常與嚴重的奶牛乳房炎有關[17-19]。銅綠假單胞菌又稱綠膿桿菌，是引起奶牛乳房炎的重要致病菌之一。在本試驗的檢測中發(fā)現(xiàn)奶牛場綠膿桿菌多個抗性基因，具有多重耐藥菌株出現(xiàn)。此外，本奶牛場出現(xiàn)對利福霉素顯著耐藥的抗性基因，利福霉素是治療奶牛子宮內膜炎常用的抗生素種類，隨著利福霉素類抗生素使用量的增加，該奶牛場土壤中抗利福霉素的抗性基因逐漸富集[20]。

4 結 論

通過分析發(fā)現(xiàn)，該奶牛場土壤中利福霉素、苯丙醇類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內酯類、氨基糖苷類抗生素抗性基因數量多，說明該牛場對這幾類抗菌藥物已經產生了較明顯的耐藥性，建議減少上述抗菌藥物的使用，并應根據抗性基因情況選擇其他有效替代藥物，從而減少抗生素濫用，降低對環(huán)境中微生物的脅迫，減少超級耐藥菌株的產生幾率。