山豆根種子帶菌檢測(cè)和殺菌處理的效應(yīng)分析

馮世鑫 蔣妮 陳乾平

山豆根種子帶菌檢測(cè)和殺菌處理的效應(yīng)分析

馮世鑫 蔣妮 陳乾平

（廣西壯族自治區(qū)藥用植物園 廣西南寧 530023）

以山豆根種子為材料，研究不同產(chǎn)地的種子攜帶真菌的種類及其帶菌率，觀察殺菌處理對(duì)真菌抑制作用及種子萌發(fā)的影響，為山豆根種子育苗前處理提供參考。采用洗滌離體、PDA培養(yǎng)的平皿法，對(duì)種子外部和內(nèi)部攜帶真菌進(jìn)行檢測(cè)，考察其攜帶真菌的孢子負(fù)荷量、種類、分離頻率；選用5種殺菌劑對(duì)種子進(jìn)行殺菌處理，以清水為對(duì)照，觀察其對(duì)真菌抑制作用及對(duì)種子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明：（1）種子外部表面攜帶的優(yōu)勢(shì)菌群為刺盤孢屬（spp.）、鐮孢霉屬（spp.）和亞隔殼孢屬（spp.）。種子內(nèi)部寄藏的真菌主要為刺盤孢屬、假尾孢屬 ()、間作殼屬（spp.）真菌。不同產(chǎn)地的種子表面攜帶真菌種類差異較大，而種子內(nèi)部寄藏的真菌種類差異不明顯。（2）多菌靈、多抗霉素、大黃素甲醚·綠色木霉、蛇床子素·枯草芽孢桿菌對(duì)山豆根種子攜帶的真菌有較好的抑制作用，以大黃素甲醚·綠色木霉較好。常用的多菌靈抑制的真菌主要是刺盤孢屬和青霉菌屬真菌；而大黃素甲醚·綠色木霉對(duì)山豆根種子攜帶的刺盤孢屬、鐮孢霉屬、亞隔孢殼屬、鏈格菌屬、青霉菌屬真菌的殺菌效果均達(dá)到82.4%以上。（3）各殺菌處理對(duì)種子發(fā)芽率影響差異不顯著；大黃素甲醚·綠色木霉處理和蛇床子素·枯草芽孢桿菌處理對(duì)發(fā)芽勢(shì)和根的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

山豆根；種子；真菌；殺菌處理；效應(yīng)

山豆根為豆科植物越南槐（Gagnep.）的干燥根及根莖，又名廣豆根，為《中華人民共和國(guó)藥典》歷年收載的品種。主產(chǎn)于廣西、貴州、云南。含生物堿和黃酮等活性成分。具有清火解毒、消腫利咽之功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明：山豆根提取物有抗病毒、保肝抗炎、抗腫瘤、解痙平喘等藥理作用[2-3]。以山豆根為主要原料的藥品有肝炎靈、清咽利火丸、鼻咽片、桂林西瓜霜、復(fù)方山豆根注射液、復(fù)方山豆根片、復(fù)方山豆根口服液、咽熱清合劑、參蓮膠囊等[4]。此外，山豆根還廣泛用于中藥配伍。原料供不應(yīng)求。然而，在生產(chǎn)中，山豆根常受根腐病、白絹病[5]、圓斑病、白粉病、炭疽病和豆莢螟蟲(chóng)[6]等病蟲(chóng)的危害，造成生長(zhǎng)滯慢，產(chǎn)量品質(zhì)下降、甚至失收，增大了生產(chǎn)成本，阻礙其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

山豆根以種子繁殖為主，每年的10～11月種子成熟，育苗分春播和秋播。春播在2月下旬至3月中旬進(jìn)行，種子需低溫保濕貯藏[7]。秋播于11月前后進(jìn)行，采收果莢，陰晾取出種子后，即可播種[8]。種子在生長(zhǎng)、脫莢、篩選、儲(chǔ)存的過(guò)程中，容易受到病原菌的依附、侵染或再侵染，導(dǎo)致種子帶菌，增大病害發(fā)生和流行的風(fēng)險(xiǎn)。作物種子安全是農(nóng)產(chǎn)品豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要前提和保證，對(duì)種子的健康檢驗(yàn)和殺菌消毒是關(guān)鍵[9]。目前，種子消毒有物理、化學(xué)和生物等方法，其中化學(xué)方法最為常見(jiàn)[10-12]。然而，化學(xué)殺菌劑毒性大、污染和殘留風(fēng)險(xiǎn)高，已不符合當(dāng)今社會(huì)可持續(xù)發(fā)展和綠色農(nóng)業(yè)的要求。生物農(nóng)藥具有對(duì)人畜和非標(biāo)靶生物安全、環(huán)境污染小、不容易產(chǎn)生抗性、容易保護(hù)生物多樣性、來(lái)源廣泛等優(yōu)點(diǎn)[13]而倍受關(guān)注和利用。本試驗(yàn)擬對(duì)山豆根種子外部和內(nèi)部攜帶真菌進(jìn)行檢測(cè)，了解其攜帶真菌種類和帶菌程度，并探討利用生物殺菌劑對(duì)種子進(jìn)行消毒處理，篩選出效果較佳的生物殺菌劑，降低污染，消除或減弱山豆根種傳病害，提高種子活力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試種子 于2020年11月，采集廣西河池市金城江區(qū)（代號(hào)T1，下同）、廣西百色市靖西縣（T2）、廣西桂林市興安縣（T3）、云南文山州富寧縣（T4）、貴州黔西南布依族自治州安龍縣（T5）共5個(gè)產(chǎn)區(qū)的山豆根種子作為攜帶真菌的檢測(cè)材料。為減小因材料而引起的誤差，選用來(lái)源于廣西金城江的種子為代表，進(jìn)行殺菌效果試驗(yàn)及其對(duì)種子活力的影響試驗(yàn)。

1.1.2 供試殺菌劑 選用的5種殺菌劑中，化學(xué)殺菌劑1個(gè)、抗生素類殺菌劑1個(gè)、植物源和微生物源復(fù)合制劑2個(gè)、純微生物源殺菌劑1個(gè)。具體的品名和使用濃度等信息見(jiàn)表1。

表1 供試殺菌劑

1.2 方法

1.2.1 山豆根種子攜帶真菌的檢測(cè)

1.2.1.1 種子外部帶菌檢測(cè) 取種子100粒，放入250 mL錐形瓶中，加入25 mL無(wú)菌水充分振蕩，吸取懸浮液5 mL以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，棄除上清液5 mL，再加入5 mL無(wú)菌水懸浮，制成孢子懸浮原液；吸取100mL懸浮原液，制成稀釋100倍的孢子懸浮液；從中吸取100mL加入到PDA平板的培養(yǎng)皿上涂勻，以無(wú)菌水作對(duì)照，重復(fù)4次；置于28 ℃的恒溫箱中，黑暗條件下培養(yǎng)5 d，記錄菌落數(shù)量、真菌種類和數(shù)量，計(jì)算出孢子負(fù)荷量（）和分離頻率（）。

=/××············································（1）

式中，為每百粒種子的孢子負(fù)荷量；為4個(gè)重復(fù)菌落總數(shù)的平均值；為吸取懸浮原液數(shù)量；為稀釋倍數(shù)；為最初添加的溶液數(shù)量。

=×100%································· （2）

式中，為某一種類真菌的分離頻率；為某一種類真菌數(shù)；為真菌總數(shù)。

1.2.1.2 種子內(nèi)部帶菌檢測(cè) 取種子適量，放入水中浸泡24 h，棄去浮于水面的種子，隨機(jī)選取飽滿的種子40粒，放入10%次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，無(wú)菌水沖洗，70%乙醇浸泡1 min，然后用無(wú)菌水沖洗4遍；將種子分成4等份，每份10粒，將每份種子分別橫切，每粒種子棄去一半保留另一半，保留的一半即為供試組織塊；將供試組織塊均勻擺放在PDA平板上，切口一側(cè)緊靠培養(yǎng)基，以空白培養(yǎng)基作對(duì)照；4次重復(fù)。在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，黑暗下培養(yǎng)5 d，考察帶菌種子數(shù)和菌落生長(zhǎng)情況；記錄真菌種類、帶菌率（N）。

=×100%································· （3）

式中，為帶菌率；帶菌種子數(shù)；為檢測(cè)種子總數(shù)

1.2.1.3 種子帶菌鑒定 將分離到的真菌分別進(jìn)行純化、形態(tài)鏡檢和轉(zhuǎn)管保存，根據(jù)真菌培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征，參照《種子病理學(xué)》[14]和《植物病原真菌學(xué)》[15]等真菌鑒定工具書(shū)進(jìn)行鑒定。

1.2.2 殺菌劑對(duì)種子殺菌效果分析 取供試種子240粒，按設(shè)計(jì)，用殺菌劑分別浸種24 h；取出、瀝干表面水分，分成4等份（即4次重復(fù)），每份60粒，待用；以無(wú)菌水浸種為對(duì)照；按處理將種子均勻擺放在PDA平板上，每皿10粒，置于28 ℃的恒溫箱中黑暗條件下培養(yǎng)5 d，觀測(cè)種子經(jīng)處理后的帶菌種類和數(shù)量，計(jì)算帶菌率和殺菌率(T)。

=（ck-t）/ck×100% （4）

式中，為殺菌率；ck為對(duì)照組的帶菌率；t處理組的帶菌率。

1.2.3 殺菌劑處理后對(duì)種子活力的影響 參照已有的發(fā)芽方法[16]，取供試種子120粒，分別用殺菌劑水溶液浸種，方法與1.2.2項(xiàng)相同。播種于裝有已滅菌沙子的塑料盒中，每盒30粒，每個(gè)處理4次重復(fù)，在28℃的恒溫光照培養(yǎng)箱中（L:D=14∶10）進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h觀測(cè)一次，記錄其種子發(fā)芽情況。以胚芽冒出土?xí)r記為種子發(fā)芽。根據(jù)山豆根種子萌發(fā)特點(diǎn)，在第20天時(shí)，計(jì)算種子發(fā)芽勢(shì)；第36天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù)，并用游標(biāo)尺和天平測(cè)定已發(fā)芽生長(zhǎng)的植株高度、根長(zhǎng)和鮮重。

發(fā)芽率=()×100% （5）

式中，指種子正常發(fā)芽粒數(shù)(在規(guī)定時(shí)間內(nèi))，指供試種子總數(shù)。

發(fā)芽勢(shì)=()×100% （6）

式中，指規(guī)定時(shí)間內(nèi)發(fā)芽種子總數(shù)，指供試種子總數(shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016和SPSS 19.0進(jìn)行處理，用Duncan＇法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 山豆根種子攜帶真菌的分析

2.1.1 種子外部攜帶真菌種類和分離頻率 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山豆根種子外部攜帶的真菌較多，百粒種子的孢子負(fù)荷量為470～1 086。包含有鐮孢霉屬、刺盤孢屬、亞隔孢殼屬、鏈格菌屬和青霉菌屬5個(gè)屬的真菌。所攜帶真菌的種類、分離頻率與種子產(chǎn)地有關(guān)。從表2可以看出，攜帶鐮孢霉屬真菌最高的處理是T1，為來(lái)自廣西金城江的種子，其分離頻率為26.7%，與其他來(lái)源的種子相比，差異達(dá)到顯著水平。攜帶青霉菌屬真菌則以T2處理最高，差異顯著性也很明顯。攜帶刺盤孢屬真菌較多的是云南富寧的種子（T4），分離頻率高達(dá)37.6%，顯著高于其他處理。再有，T4處理的鏈格菌屬真菌分離頻率也顯著高于T2、T3、T5和CK。來(lái)源于廣西興安縣的T3處理，卻攜帶亞隔孢殼屬真菌較多，分離頻率位居第一，顯著高于其他處理。根據(jù)各產(chǎn)地種子攜帶的真菌及其分離頻率，依照優(yōu)勢(shì)菌種的分類原則：菌種總數(shù)的百分比（分離頻率）大于10%的菌株屬于優(yōu)勢(shì)菌種來(lái)劃分，山豆根種子外部表面攜帶的優(yōu)勢(shì)菌群為刺盤孢屬（spp.）、鐮孢霉屬(spp.)和亞隔孢殼屬(spp.)真菌。

2.1.2 種子內(nèi)部攜帶真菌的種類和分離頻率 從表3可知，5個(gè)產(chǎn)地的種子內(nèi)部帶菌率高達(dá)62.5%～90%。種子內(nèi)部攜帶的真菌種類與外部攜帶的不完全相同。種子內(nèi)部攜帶的真菌除了分離得到刺盤孢屬、鏈格孢屬、青霉菌屬真菌以外，還分離得到假尾孢屬、間作殼屬、枝孢屬、尾孢菌屬、小球腔菌屬、炭角菌屬、腔菌屬7個(gè)屬的真菌。不同產(chǎn)地種子內(nèi)部所攜帶真菌種類無(wú)明顯差別，但分離頻率不盡相同。來(lái)自廣西金城江（T1）和云南富寧縣（T4）的種子攜帶刺盤孢屬真菌較高，顯著高于其他處理；來(lái)自廣西靖西縣（T2）的種子攜帶的枝孢屬真菌較高，而來(lái)自貴州安龍（T5）的種子攜帶假尾孢屬真菌較多。其他的雖然有一定差異，但差異不顯著。按優(yōu)勢(shì)菌種的分類原則劃分，山豆根種子內(nèi)部寄藏的優(yōu)勢(shì)真菌是刺盤孢屬真菌、假尾孢屬()真菌和間作殼屬（spp.）真菌。

表2 山豆根種子懸浮液攜帶真菌種類和分離頻率

注：表中數(shù)據(jù)為4個(gè)重復(fù)平均值；±為標(biāo)準(zhǔn)差；不同小寫(xiě)字母表示樣品間有顯著性差異（<0.05）。下同。

表3 山豆根種子內(nèi)部寄藏真菌檢測(cè)結(jié)果 單位：%

2.2 殺菌劑對(duì)種子攜帶真菌的殺菌效果分析

從表4可看出，5種殺菌劑對(duì)山豆根種子外部攜帶的真菌均有一定的殺菌效果，其殺菌率均顯著高于對(duì)照組。不同的殺菌劑對(duì)所抑制真菌種類及其殺菌率有較大的區(qū)別。以抑制真菌種類多、殺菌率高為評(píng)價(jià)指標(biāo)，P3處理較優(yōu)。P3處理對(duì)刺盤孢屬、鐮孢霉屬、青霉菌屬、亞隔孢殼屬和鏈格菌屬真菌均有很好的抑制作用，其殺菌率為82.4%～100.0%，尤其是對(duì)鏈格菌屬真菌殺菌率更高，經(jīng)處理后已檢測(cè)不到該屬真菌病原菌。其次為P2處理，P2對(duì)攜帶的5個(gè)屬真菌的殺菌率為70.4%～91.5%，集中表現(xiàn)在對(duì)青霉菌屬和刺盤孢屬真菌抑制較好。第三為P4處理，整體的殺菌率在52.8%～82.3%，對(duì)鐮孢霉屬真菌有較好的抑制作用。P1處理對(duì)攜帶的5個(gè)屬真菌的殺菌率為49.4%～81.5%，比P5處理稍好。其主要是對(duì)青霉菌屬真菌、刺盤孢屬真菌有較好的抑制作用，而對(duì)其他真菌的抑制效果則較差。也就是說(shuō)，對(duì)山豆根種子所攜帶的真菌而言，用P3消毒處理其殺菌廣譜性和殺滅效果均優(yōu)于P2、P4、P1、P5和CK處理。

表4 殺菌處理后對(duì)山豆根種子攜帶真菌情況及殺菌效果 單位：%

2.3 殺菌劑對(duì)山豆根種子活力的影響

從殺菌劑浸種后的發(fā)芽情況（表5）可知，5個(gè)處理組和對(duì)照組之間的種子發(fā)芽率雖有一定的差異，但差異不顯著，說(shuō)明5種殺菌劑對(duì)山豆根種子萌發(fā)所造成的影響均不大。而種子的發(fā)芽勢(shì)和幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重則有不同的表現(xiàn)。發(fā)芽勢(shì)以P3處理的最高，達(dá)到74.2%，其次為P4處理，二者差異不顯著，但均顯著高于其他處理。P1、P2、P5和CK之間差異不顯著。發(fā)芽勢(shì)衡量種子發(fā)芽力，發(fā)芽勢(shì)高則表示種子活力強(qiáng)，發(fā)芽整齊，也就是說(shuō)P3和P4有增強(qiáng)種子活力、提高出苗整齊度的作用。幼苗的株高以P4處理的最大，P3處理次之，兩者差異不顯著，但均顯著高于其他處理；大小排序?yàn)镻4＞P3＞P5＞P2＞P1＞CK。根長(zhǎng)以P3處理最大，顯著高于P4處理，P4與P5、P2和P1、CK之間差異達(dá)顯著水平。幼苗的鮮重也以P3處理最高，顯著高于其他處理，大小排序?yàn)镻3＞P4＞P2＞P5＞CK＞P1。株高和根長(zhǎng)是衡量植株地上部和地下部器官生長(zhǎng)速度重要指標(biāo)；幼苗鮮重是體現(xiàn)植株內(nèi)在質(zhì)量增減程度。說(shuō)明P4和P3均有促進(jìn)山豆根幼苗生長(zhǎng)的作用，P3則更能提升內(nèi)在質(zhì)量，有利于培育壯苗。

表5 殺菌劑處理種子對(duì)其萌發(fā)和生長(zhǎng)的測(cè)定

3 討論與結(jié)論

山豆根種子外部和內(nèi)部均攜帶有較多的真菌，雖然外部和內(nèi)部所攜帶的真菌優(yōu)勢(shì)菌群有所區(qū)別，但均有刺盤孢屬、鐮孢菌屬和亞隔孢殼屬真菌。有研究報(bào)道，山豆根根腐病是由半知菌類鐮孢霉屬真菌茄腐鐮孢[(Mart) Sacc.]引起[17]；山豆根圓斑病的病原菌為亞隔殼菌屬真菌()菌株[18]，該真菌可為害近百種植物[19]，病原可以通過(guò)種子傳播，是一種潛在危險(xiǎn)性病原菌，我國(guó)將其列入進(jìn)境植物檢疫有害生物名錄[20]；刺盤孢菌屬真菌可引發(fā)植物炭疽病，如核桃炭疽病菌（）[21]。黃瓜炭疽病病原（）[22]均為刺盤孢菌屬真菌。山豆根種子所攜帶的真菌中有與致病病原菌同為一個(gè)屬的真菌，盡管它們是何菌株及致病性還需進(jìn)一步鑒定和驗(yàn)證，山豆根種子播前殺菌消毒也顯得十分必要。

如何選擇環(huán)保、有效的山豆根種子殺菌劑，是生產(chǎn)急需解決的問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)中，植物源與微生物源復(fù)配的大黃素甲醚·綠色木霉（P3）殺菌劑，對(duì)山豆根種子外部攜帶的真菌均有較強(qiáng)抑制作用。大黃素甲醚是從掌葉大黃（）根莖提取的高活性抗菌化合物，具有較好的廣譜抑菌作用[23]。Pham等[24]測(cè)定用大黃根提取物對(duì)5種真菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)提取物大黃素甲醚濃度在75～300 mg/L時(shí)對(duì)大麥白粉病的抑制率達(dá)80%～96.7%。元維軍等[25]用0.8%大黃素甲醚懸浮種衣劑，以有效成分計(jì)算，按8～16 g/100 kg種子的用藥量，在小麥播前進(jìn)行種子包衣，對(duì)小麥紋枯病防治效果較好。大黃素甲醚與殺菌劑（如三唑類殺菌劑）按一定比例混用，對(duì)病害（如稻瘟?。┑姆乐斡性鲂ё饔肹26]。綠色木霉是木霉菌中活性較高的菌株之一，木霉菌具有明顯的抗山豆根根腐病的效果，其機(jī)理是菌絲纏繞和寄生的方式，產(chǎn)生大量木霉孢子于病原菌體上，使病原菌菌絲斷裂、縊縮、消解，從而達(dá)到抑菌效果[27]。木霉菌對(duì)黃瓜枯萎病也有較好的抑制作用[28]。木霉菌與殺菌劑聯(lián)用增效作用明顯[29-30]。結(jié)果與前人的研究相一致。在相同環(huán)境條件下，種子的萌發(fā)主要受種子活力的影響。試驗(yàn)中，5種殺菌劑處理后的山豆根種子發(fā)芽率差異不明顯，說(shuō)明所選用的5種殺菌劑對(duì)山豆根種子活力影響不大。而大黃素甲醚·綠色木霉處理種子的發(fā)芽勢(shì)、株高、根長(zhǎng)和生物量（幼苗鮮重）的促進(jìn)較明顯，可能是有綠色木霉存在的緣故。木霉菌除了有較強(qiáng)的抗拮作用外，還能促進(jìn)植株生長(zhǎng)，結(jié)果與谷祖敏等[28]、周羅娜等[31]研究相同。

種子在生產(chǎn)、采收、加工和運(yùn)輸過(guò)程中，均有感染、攜帶病原微生物菌的風(fēng)險(xiǎn)。在擴(kuò)大生產(chǎn)中，種子病原菌檢測(cè)和有效的消毒藥劑篩選起到關(guān)鍵作用?；瘜W(xué)殺菌劑雖有較好的速效性，但長(zhǎng)期使用會(huì)引起生物安全、環(huán)境污染，研制或篩選出無(wú)毒、無(wú)殘留的生物型廣譜殺菌制劑對(duì)藥材綠色生產(chǎn)具有十分重要的意義。

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Detection of Germs in Seed and Effect Analysis of Sterilization Treatment ofHook. f. ex Regel

FENG Shixin JIANG Ni CHEN Qianping

(Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant, Nanning, Guangxi 530023, China)

Taking the seeds ofHook. f. ex Regel as materials, this paper studied the species and rate of fungi carried by seeds from different producing areas, and observed the effect of sterilization treatment on fungal inhibition and seed germination, so as to provide reference for the pre-treatment ofHook. f. ex Regel. The fungi carried outside and inside the seeds were detected by washing in vitro and PDA culture plate method, and the spore load, species and isolation frequency of the fungi were investigated; Five kinds of fungicides were selected to sterilize the seeds, and the effects of water on fungal inhibition and seed germination were observed. The results showed that: (1) the dominant flora carried on the outer surface of seeds were.,. and. The fungi in the seeds were mainly,and. The species of fungi carried on the surface of seeds from different producing areas were quite different, but the species of fungi embedded in seeds were not obvious. (2) Carbendazim, polyoxins, Emodin methyl ether·Trichoderma green and Osthole·Bacillus subtilis had good inhibitory effects on the fungi carried byseeds, and Emodin methyl ether·Trichoderma green was better. The fungi inhibited by carbendazim were mainlyandFungi. The fungicidal effect of Emodin methyl ether·Trichoderma green on five dominant fungi of.,,.. Andstored inseeds was more than 82.4%. (3) There was no significant difference between seed germination rate among sterilization treatments; The treatments of Emodin methyl ether·Trichoderma green and Osthole·Bacillus subtilis could promote the growth of root and germination.

Hook. f. ex Regel; seeds; fungus; sterilization treatment; effect

S567.19

A

10.12008/j.issn.1009-2196.2022.06.012

2021-11-09；

2022-03-21

廣西中醫(yī)藥適宜技術(shù)開(kāi)發(fā)和推廣項(xiàng)目（No.GZSY20-02）；廣西藥用植物園科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（No.2019003）；廣西衛(wèi)健委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（No.ZJC2020003）。

馮世鑫（1966—），男，主任技師，研究方向?yàn)樗幱弥参镔Y源保護(hù)和持續(xù)利用，E-mail：870330655@qq.com。

（責(zé)任編輯 龍婭麗）