研究RH（D）陰性冰凍解凍紅細(xì)胞的制備及臨床意義

肖明星 丁璇 陳婷

（廣東省潮州市中心血站 潮州 521000）

ABO 血型為臨床輸血工作中最為重要的血型，RH 血型為人類第二大血型系統(tǒng)，其臨床價(jià)值均較高[1～2]。我國居民的RH（D）陰性血型比例大約為0.2%～0.5%，故稀有血型患者緊急用血需求常難以得到充分滿足，RH（D）陰性血的收集供應(yīng)與臨床需求，或供不應(yīng)求，或供過于求，整體表現(xiàn)為不均衡的現(xiàn)象，無任何規(guī)律，這就給采供血與輸血搶救工作帶來極大程度的困難[3～4]。為了提高RH（D）陰性血液的保存技術(shù)，臨床以復(fù)方甘油配方深低溫保存紅細(xì)胞，解凍后運(yùn)用不同濃度梯度的氯化鈉溶液洗滌紅細(xì)胞去除甘油成功[5～6]。該手段使得RH（D）陰性血液可長期保存，自采血之日起可保留10 年，有效滿足RH（D）陰性患者現(xiàn)用現(xiàn)供ABO 血型同型RH（D）陰性血液的需求，緩解RH（D）陰性血液收集供應(yīng)與臨床需求不均衡的問題?；诖耍狙驹?021 年展開RH（D）陰性冰凍解凍紅細(xì)胞的制備、保留與臨床使用研究，旨在為臨床提供更可靠的參考依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 血液來源 選取2021 年12 月至2022 年5 月無償獻(xiàn)血血液篩查出的RH（D）陰性血，按庫存RH（D）陰性血的采集時(shí)間與庫存量，對收集6 d 內(nèi)的RH（D）陰性血液冰凍保留，于迫切需要臨床供血時(shí)進(jìn)行制作，供臨床使用。

1.2 材料與儀器 材料：236 型去甘油耗材（美國Haemonetics 公司）；復(fù)方甘油溶液（山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品股份有限公司）；塑料血袋（山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品股份有限公司）；9%氯化鈉溶液與0.9%氯化鈉溶液。儀器：血液處理機(jī)（美國Haemonetics Corporation 公 司 ， 型 號 ：ACP215），-80℃超低溫保存箱（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司），大容量成分離心機(jī)（美國貝克曼公司），無菌接合機(jī)（日本泰爾茂公司，型號：TSCD-Ⅱ）

1.3 操作方法 （1）冰凍紅細(xì)胞：將采集6 d 內(nèi)的RH（D）陰性血液以離心力2 500 g 進(jìn)行12 min 的離心處理，設(shè)定溫度為4℃，去除上清液后獲得約200 ml 的紅細(xì)胞；之后將其轉(zhuǎn)移到專用一次性使用塑料血袋內(nèi)，將盛有紅細(xì)胞的塑料袋放于振蕩器上（頻率200 次/min）；開啟振蕩器加甘油，緩慢加速，于0.5 h 內(nèi)將320 ml 甘油加完，待室內(nèi)環(huán)境達(dá)到穩(wěn)定0.5 h之后貼標(biāo)簽進(jìn)行包裝，之后平放于-80℃冰箱進(jìn)行保存。（2）解凍紅細(xì)胞：將貯存在-80℃冰箱中的血袋取出（切忌勿弄壞血袋），放在37～40℃水浴箱內(nèi)進(jìn)行水浴加熱解凍；輕輕震動，促使其快速融化，一直到冰凍紅細(xì)胞全部解凍完成；解凍過后從水浴箱內(nèi)取出融化的紅細(xì)胞，擦拭干凈，仔細(xì)觀看血袋是否存在損壞現(xiàn)象；檢查需保障所用的236 型去甘油耗材包裝無裂縫或漏洞，且處在有效期中，拆開單包裝，肉眼檢查是否存在管路扭結(jié)、部件缺損等影響正常操作的狀況，排除上述狀況后用無菌接合機(jī)將解凍紅細(xì)胞、236 型去甘油耗材的紅色管路無菌接合，夾緊耗材上的全部滑動夾，將236 耗材的紅細(xì)胞成品袋懸掛在ACP215 型血液處理機(jī)前面板左側(cè)的小袋釘上，嚴(yán)格依據(jù)ACP215 型血液處理機(jī)的時(shí)機(jī)應(yīng)用操作規(guī)范對去甘油耗材進(jìn)行裝配，核對精準(zhǔn)無誤差之后依次啟動不同按鈕，機(jī)器提示開始自動化去甘油與洗滌步驟；洗滌完畢后，確認(rèn)廢液上清液顏色無明顯溶血現(xiàn)象，按下確定鍵，此時(shí)機(jī)體暫停使用，由鹽水清洗之后的添加液懸浮紅細(xì)胞轉(zhuǎn)換至洗滌紅細(xì)胞袋中；產(chǎn)品轉(zhuǎn)移完畢后，關(guān)閉所有的閥，并將產(chǎn)品信息輸入電腦中，貼上標(biāo)簽，送交至儲血發(fā)血科。

1.4 觀察指標(biāo) （1）質(zhì)控抽檢檢測結(jié)果：質(zhì)控科分次對24 U 去甘油洗滌后懸浮RH（D）陰性紅細(xì)胞進(jìn)行抽檢，將血紅蛋白含量、游離血紅蛋白含量、白細(xì)胞殘留量、甘油殘留量、無菌試驗(yàn)與國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比。用全自動血細(xì)胞分析儀[桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司，型號：URIT-3010，批準(zhǔn)文號：桂食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2013 第2400004 號]檢測血紅蛋白含量與白細(xì)胞殘留量。用鄰-甲聯(lián)苯胺法測定游離血紅蛋白含量：取0.02 ml 上層血清，將其置放于檢測管內(nèi)，并將0.2 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)血紅蛋白放在標(biāo)準(zhǔn)管中，取3 支試管，分別標(biāo)為空白管、標(biāo)準(zhǔn)管與測定管，之后取1.0 ml 鄰-甲聯(lián)苯胺與1 g/L 的過氧化鈉溶液，放進(jìn)3支試管內(nèi)，完全混合后放置10 min；之后于3 支試管內(nèi)放入10%乙酸溶液100 ml，進(jìn)行435 nm 的比色，期間空白管歸零，讀取每個(gè)管內(nèi)的吸光度，取得相應(yīng)的血紅蛋白含量，依據(jù)臨床有關(guān)需求，解凍紅細(xì)胞內(nèi)的游離血紅蛋白含量需＜1 g/L。用全自動細(xì)菌培養(yǎng)儀（碧迪公司，型號：BACTEC FX，批準(zhǔn)文號：20162223234） 做無菌試驗(yàn)。甘油殘留量：按GPO-PAP 法測定甘油三酯的標(biāo)準(zhǔn)，用三磷酸腺苷（ATP）、甘油激酶對甘油進(jìn)行磷酸化，顯色劑選用4-氯酚、4-氨基安替比林，以顯色情況評估甘油含量（兩者之間為正比關(guān)系）。實(shí)際測量方式如下：按照1:1 的比例將三氯醋酸放入洗滌完畢的紅細(xì)胞懸液，之后于室溫環(huán)境下放置10 min，以2 000 r/min 的速率離心處理10 min，取上清液進(jìn)行測定；之后在空白管、標(biāo)準(zhǔn)管與測定管中放進(jìn)蒸餾水、待測樣本與標(biāo)準(zhǔn)甘油（均為0.02 ml），在各管中均放入2 ml 酶工作液，全部溶解后在37℃水浴中顯色（8 min），以分光光度計(jì)、比色杯和紅星管收集 OD 值。（2）記錄 RH（D）陰性冰凍紅細(xì)胞臨床應(yīng)用情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用%表示，行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用（）表示，行t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)控抽檢檢測結(jié)果 RH（D）陰性冰凍紅細(xì)胞解凍之后，血紅蛋白含量、游離血紅蛋白含量、白細(xì)胞殘留量、甘油殘留量、無菌試驗(yàn)檢測均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。見表1。

表1 質(zhì)控抽檢檢測結(jié)果

2.2 臨床應(yīng)用情況 2020 年5 月至2022 年5 月，經(jīng)確證的RH（D）陰性血液1 822 U，除1 461.5 U 急用發(fā)出，共冷凍保存360.5 U，已供臨床使用的冷凍解凍去甘油洗滌紅細(xì)胞共290 U，保存時(shí)間為11～910 d。RH（D）陰性冰凍紅細(xì)胞解凍之后通常用于手術(shù)、外傷、不同的血液疾病中，使用患者數(shù)共計(jì)80 例，少數(shù)患者用血量為4～6 U，大部分患者用血量為2～3 U；輸注過后絕大多數(shù)患者血液中的血紅蛋白水平明顯升高，貧血狀態(tài)得到有效改善；輸血后均無輸血反應(yīng)，血壓、呼吸、脈搏正常，無血紅蛋白尿發(fā)生，臨床應(yīng)用效果確切。

3 討論

輸血治療是臨床搶救危重患者的重要手段。RH（D）陰性全血或懸浮紅細(xì)胞常規(guī)2～6℃環(huán)境下可保存35～42 d，但RH（D）陰性血人群分布少，臨床用血不穩(wěn)定，經(jīng)常出現(xiàn)該類血型供不應(yīng)求、實(shí)際應(yīng)用率低等局面[7～9]。因此，臨床需探尋更為有效的方法保存RH（D）陰性紅細(xì)胞，為病情危重的RH（D）陰性患者輸血治療提供良好的保障。

甘油存在無毒、中性等優(yōu)勢，可滲透到細(xì)胞內(nèi)，與水的結(jié)合能力較強(qiáng)，且對細(xì)胞膜具有良好的保護(hù)效果，故臨床可將甘油作為保護(hù)劑，長時(shí)間保留紅細(xì)胞[10～12]。冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞是冰凍紅細(xì)胞在溶解過后，洗滌清理大部分的甘油，同時(shí)將紅細(xì)胞懸浮于相對量生理鹽水內(nèi)的紅細(xì)胞成分血。冰凍紅細(xì)胞是將從收集日至6 d 內(nèi)的紅細(xì)胞，同一定濃度和含量的甘油相互混合到40%濃度后，放于-80℃環(huán)境下冰凍制作完備，保存期間可長達(dá)10 年，多用于自身輸血和稀有血型紅細(xì)胞的保留，如ABO 型、孟買血型等，在該類稀有血型儲存中意義重大，可有效解決稀有血型患者搶救性輸血問題，及時(shí)挽救患者生命[13]。洗滌過后的紅細(xì)胞雖然存有輕微的形態(tài)變化，然而不干擾其攜氧、變形等能力。另外，該制品還適用于血漿蛋白過敏等患者中。

本研究結(jié)果顯示，RH（D）陰性冰凍紅細(xì)胞在解凍之后，血紅蛋白含量、游離血紅蛋白含量、白細(xì)胞殘留量、甘油殘留量、無菌試驗(yàn)等質(zhì)控指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)；且2020 年5 月至2022 年5 月，經(jīng)確證的RH（D）陰性血液 1 822 U，除 1 461.5 U 急用發(fā)出，共冷凍保存360.5 U，已供臨床使用的冷凍解凍去甘油洗滌紅細(xì)胞共290 U，保存時(shí)間為11～910 d。RH（D）陰性冰凍紅細(xì)胞解凍之后通常用于手術(shù)、外傷、不同的血液疾病中，使用患者數(shù)共計(jì)80 例，少數(shù)患者用血量為4～6 U，大部分患者用血量為2～3 U；輸注過后絕大多數(shù)患者血液中的血紅蛋白水平明顯升高，貧血狀態(tài)得到有效改善；輸血后均無輸血反應(yīng)，血壓、呼吸、脈搏正常，無血紅蛋白尿發(fā)生，臨床應(yīng)用效果確切。表明RH（D）陰性冰凍紅細(xì)胞解凍之后可在臨床輸血搶救中獲得滿意效果。

同種異體冰凍紅細(xì)胞在制備時(shí)，白細(xì)胞、細(xì)胞外鉀離子等較多的物質(zhì)經(jīng)反復(fù)多次洗滌被吸取，減少了因輸注異體血而誘發(fā)的輸血免疫反應(yīng)發(fā)生率和與白細(xì)胞有關(guān)病毒的傳播率，從而有效保障輸血安全。同時(shí)，稀有血型血液被采集后進(jìn)行甘油化深低溫保存，使用時(shí)運(yùn)用ACP215 型血液處理機(jī)進(jìn)行RH（D）陰性冰凍解凍紅細(xì)胞的制備過程僅需1.5～2.0 h，可隨時(shí)制備，及時(shí)為臨床提供急需血液，一方面為患者爭取搶救時(shí)間，另一方面可有效緩解臨床稀有血型緊缺的壓力[14]。在具體操作中，臨床還需注意如下幾點(diǎn)：（1）血液在4℃冰箱中保存，其氧氣釋放能力會伴隨時(shí)間的推移而呈逐漸下降，進(jìn)而增加溶血的可能性，臨床需選擇6 d 以內(nèi)的血液進(jìn)行冰凍保存；（2）在血液冰凍時(shí)期，其外部需添加紙盒，避免儲存期間斷裂導(dǎo)致血液報(bào)廢[15]；（3）手工制作濃縮紅細(xì)胞時(shí)可行倒置離心處置，將其轉(zhuǎn)換至無菌血袋時(shí)可將白膜層留放于原本的血袋內(nèi)；（4）手工洗滌時(shí)，必須于無菌室百級凈化臺上進(jìn)行操作，且需嚴(yán)格按照無菌操作，保證血液的安全性；（5）洗滌紅細(xì)胞制品時(shí)經(jīng)過較多次的開放，被細(xì)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)高，加之用生理鹽水懸浮，紅細(xì)胞保存缺乏營養(yǎng)，故需于24 h 內(nèi)盡早輸注，確保輸血安全。

綜上所述，使用ACP215 型血液處理機(jī)制備的RH（D）陰性冰凍紅細(xì)胞在臨床急救時(shí)可快速解凍制備，為急診搶救患者提供珍貴的血源，臨床應(yīng)用價(jià)值較高。