分枝桿菌液體培養(yǎng)和微孔板法分枝桿菌藥敏實驗在結(jié)核感染中的應(yīng)用*

劉金花 羅一鈞 彭海英 劉平慶

（江西省贛州市第五人民醫(yī)院檢驗科 贛州 341000）

作為臨床常見感染性疾病，結(jié)核分枝桿菌潛伏感染（結(jié)核感染）主要指的是機(jī)體受到結(jié)核分枝桿菌感染所致的一系列臨床綜合征，為進(jìn)一步明確是否存在結(jié)核病，需要配合細(xì)菌學(xué)、影像學(xué)檢查等[1]。臨床強(qiáng)調(diào)對于合并結(jié)核感染患者應(yīng)積極進(jìn)行藥物治療，促進(jìn)癥狀緩解。近年來隨著結(jié)核分枝桿菌耐藥的增加，為結(jié)核感染防治也增加了一定的難度[2]。痰培養(yǎng)是臨床診斷結(jié)核感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但傳統(tǒng)固體羅氏培養(yǎng)及藥敏試驗周期長，不利于早期診斷與治療，因此尋找一種快捷、有效的診斷方式尤為重要。分枝桿菌液體培養(yǎng)較傳統(tǒng)固體羅氏培養(yǎng)所用時間短，且無須進(jìn)行磨菌可直接對接藥敏試驗，具有較高的安全性[3～4]。微孔板法即微量肉湯稀釋法能夠測定藥物最低抑菌濃度（MIC），為治療藥物選擇及劑量確定提供參考[5]。為探究其在結(jié)核感染中的應(yīng)用價值，本研究收集60 例我院結(jié)核感染患者痰標(biāo)本病例進(jìn)行研究?，F(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2021 年6～8 月收治的60例肺結(jié)核門診疑似和確診后復(fù)發(fā)結(jié)核感染患者為研究對象，采集患者痰標(biāo)本，其中34 例為疑似新發(fā)患者，26 例為已經(jīng)確診后復(fù)診患者，性別分布男33例、女 27 例；年齡 18～79 歲，平均年齡 51.6 歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）18～27 kg/m2，平均 BMI（23.36±3.24）kg/m2。入組標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)核感染診斷參照《WS196-2017 結(jié)核病分類》標(biāo)準(zhǔn)[6]者；年齡≥18 歲者；均在醫(yī)院接受痰培養(yǎng)等相關(guān)檢測者；患者交流無障礙，可配合本研究者。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 痰消化緩沖液（2%NaOH，0.05 M 檸檬酸鈉）100 ml/瓶，2 瓶；N-乙酰 -L-半胱氨酸（NALC）0.5 g/管，2 管。每管 NALC 溶于一瓶痰消化緩沖液，完全溶解后使用（溶解后24～36 h 內(nèi)使用）。10 倍磷酸鹽緩沖液濃縮液pH 6.8，50 ml 10 倍磷酸鹽緩沖液濃縮液與450 ml 0.9%無菌生理鹽水混合后使用。恒溫培養(yǎng)箱；生物安全柜；高壓消毒鍋；帶濾芯滅菌洗頭；移液器；BD BACTEC MGIT960；50 ml 離心管離心機(jī)；96 孔帶蓋 U 型板；OADC；7H9肉湯；阿米卡星；利福平；異煙肼；左氧氟沙星；液體培養(yǎng)管；固體羅氏培養(yǎng)基藥敏管；酸性固體羅氏培養(yǎng)基。

1.2.2 標(biāo)本處理與檢測 指導(dǎo)患者分別于清晨、晚間以及即時接受痰標(biāo)本采集，將3 次獲得的痰標(biāo)本進(jìn)行涂片染色處理，根據(jù)痰標(biāo)本的黏稠程度，加不同體積的2%NALC-NaOH 消化液入前處理管中，膿痰、渾濁的痰需加3 倍體積的消化液，稀薄痰則加等量消化液。旋緊容器螺旋蓋。接通渦旋振蕩器電源，在生物安全柜內(nèi)，將處理管在渦旋振蕩器上振蕩50 s 左右，直至標(biāo)本充分液化。將前處理管置于試管架內(nèi)，室溫靜置15 min，偶爾用手輕輕地?fù)u動，加入pH 6.8 的 PBS（0.067 mol/L）緩沖液至 40 ml 標(biāo)記的刻度,混勻。設(shè)定制冷溫度，3 000×g離心15 min，將上清液倒入防噴濺的、含有消毒劑的容器中，用20 ml注射器向每一個處理試管中的沉淀物加入磷酸緩沖液1.0 ml，形成混懸液。

1.2.3 傳統(tǒng)固體羅氏培養(yǎng) 吸取處理后的標(biāo)本混懸液接種時，第一滴液體接種至固體培養(yǎng)基斜面中部，第二滴接種到培養(yǎng)基上部，每支培養(yǎng)基接種0.10～0.15 ml（約2 滴），輕輕轉(zhuǎn)動并放低培養(yǎng)管底部，使菌液均勻鋪于斜面，斜面水平向上放36±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每一標(biāo)本同時接種2 支。接種后第3、7 天各觀察1 次菌落生長情況。發(fā)現(xiàn)菌落生長者，經(jīng)抗酸染色證實后，可報告快速生長分枝桿菌陽性。此后每周觀察1 次，記錄菌落生長及污染情況。陽性生長物經(jīng)抗酸染色證實后，可報告分枝桿菌生長。滿8 周后未見菌落生長者方可報告培養(yǎng)陰性結(jié)果，必要時可延長。

1.2.4 分枝桿菌液體培養(yǎng) 采用MGITBD960 全自動儀器法，將0.5 ml 消化離心后沉淀物加入分枝桿菌液體培養(yǎng)專用管中，并加入0.8 ml 雜菌抑菌劑，放入BD960 全自動培養(yǎng)儀，儀器根據(jù)熒光值自動判讀結(jié)果，儀器報陽后，進(jìn)行手工抗酸染色涂片顯微鏡檢查，抗酸桿菌顯紅色，背景顯藍(lán)色。

1.2.5 微孔板法液體培養(yǎng) 菌株準(zhǔn)備：液體培養(yǎng)陽性物（要求經(jīng)抗酸染色確定為抗酸陽性桿菌同時無雜菌合并，且經(jīng)抗原檢測為MPT64 抗原陽性的培養(yǎng)物），于37℃環(huán)境下培養(yǎng)1～7 d 增菌（菌量足夠藥敏檢測即可不可超過7 d，超過7 d 仍然達(dá)不到要求菌量，則應(yīng)轉(zhuǎn)種新的液體培養(yǎng)管）。接種液的制備：使用一次性無菌滴管從液體培養(yǎng)管底部吸取0.5 ml 含菌量較大的菌液，置于含有1.5 ml 鹽水的磨菌管中，擰緊螺口，用玻璃珠進(jìn)行旋渦震蕩磨菌分散（磨成均勻的細(xì)沙狀）。根據(jù)比濁儀給出菌懸液濁度及參考加入生理鹽水量將菌液調(diào)整至0.5 McFarland。接種：吸取100 μl 菌懸液至自配或者商品化的含有OADC的7H9 藥敏接種培養(yǎng)液中，渦旋振蕩混勻30 s。得到約1×105 CFU/ml 的接種液。采用適合的多通道移液器，向96 孔U 型版板的每個孔中添加100 μl接種液。務(wù)必在30 min 內(nèi)將接種液接種至96 孔U型板中。藥物濃度準(zhǔn)備：將四種藥敏分別調(diào)至原始濃度的8 倍，在進(jìn)行倍比稀釋8 個梯度，MIC 依次為16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125。再將調(diào)配好的對應(yīng)的藥敏濃度10 μl 添加至微孔板中，最后一孔第12 排第12 孔不添加任何藥敏，只添加菌懸液，作為對照孔。一株菌做四種藥物8 個濃度，由此得出一塊96 孔板可做3 株菌。最后使用密封膜和通明膠帶以正確的方式覆蓋96 孔板，避免褶皺或者歪斜，確保所有孔完全被覆蓋，隨后采用刮板或者滾輪壓實密封膜，以保證足夠的密封性，防止?jié)B漏或者蒸發(fā)導(dǎo)致實驗失敗或者實驗室污染。孵育：接種好的藥敏板置于35～37℃有氧環(huán)境下孵育10 d。在7～10 d 檢查對照孔生長情況，如果10 d 后生長情況不好，再放入孵箱，繼續(xù)孵育11 d。生長表現(xiàn)：U 型孔底部出現(xiàn)混濁或者菌落沉積?？刹捎孟到y(tǒng)判讀或者肉眼觀察讀取結(jié)果。首先觀察陽性生長對照孔是否有菌生長表現(xiàn)，如未見生長，則結(jié)果無效。當(dāng)陽性生長對照孔菌生長良好時，讀取每種藥物的MIC值，MIC 值為生長明顯抑制的最低抗生素濃度。當(dāng)受試菌株對某種藥物的MIC 值大于臨界濃度，則判斷為該受試菌株對該藥物耐藥；當(dāng)受試菌株對某種藥物的MIC 值小于臨界濃度，則判斷為該受試菌株對該藥物敏感。各抗結(jié)核藥物可接受的MIC 范圍見表1。

表1 各抗結(jié)核藥物可接受的MIC 范圍（μg/ml）

1.2.6 比例濃度法固體培養(yǎng) 準(zhǔn)備廢棄物容器及消毒液。將一次性使用的含0.5%有效氯或75.0%酒精的消毒紙墊鋪在生物安全柜的臺面上，臨床分離分枝桿菌的新鮮培養(yǎng)物無須傳代即可做藥敏試驗。取上述培養(yǎng)物放無菌玻璃磨菌器底部，震蕩磨菌，加入少量0.9%生理鹽水，靜置15 min，用比濁儀比濁配成1 mg/ml 的菌懸液。在無菌痰瓶中加入生理鹽水, 用接種槍取500 μl 1 mg/ml 的菌懸液稀釋至10～2 mg/ml，接種培養(yǎng)用接種槍分別取100 μl 10～2 mg/ml 菌液，分別接種至含藥和對照培養(yǎng)基的表面，置于37℃環(huán)境下孵育4 周觀察結(jié)果。采用接種環(huán)提取新鮮菌落，保存于磨菌瓶，與麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行比濁處理，將其制作為濃度為1 mg/ml 的菌懸液，經(jīng)過稀釋處理（100 倍），獲得濃度為10～2 mg/ml 的菌液，并進(jìn)行稀釋，使其成為10～4 mg/ml 溶液，得到兩種不同濃度的工作菌液，然后在對應(yīng)的含藥培養(yǎng)基斜面接種。

1.3 觀察指標(biāo) 所有標(biāo)本分別予以分枝桿菌液體培養(yǎng)與傳統(tǒng)固體羅氏培養(yǎng)法，并采用微孔板法進(jìn)行分枝桿菌藥敏實驗，對比分枝桿菌培養(yǎng)報陽時間、陽性符合率，并分析微孔板法藥敏結(jié)果檢測效能。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 將研究獲得的計數(shù)資料、計量資料應(yīng)用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，表示方法分別為%、（），同一批患者標(biāo)本用不同方法處理，采用配對設(shè)計方法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)方法對分枝桿菌培養(yǎng)報陽時間比較在34 例疑似新發(fā)患者中，采用液體培養(yǎng)法報陽時間為 4～21 d，平均（13.26±5.23）d；傳統(tǒng)固體羅氏培養(yǎng)法報陽時間為 15～36 d，平均（22.73±7.42）d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.083，P＜0.05）。26 例已經(jīng)確診后復(fù)診患者，液體培養(yǎng)法報陽時間為10～31 d，平均（21.35±5.17）d，傳統(tǒng)固體羅氏培養(yǎng)法報陽時間為15～41 d，平均（28.72±8.42）d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.803，P＜0.05）。

2.2 不同培養(yǎng)法對分枝桿菌陽性檢出率比較 采集60 例患者痰標(biāo)本，分別進(jìn)行不同培養(yǎng)法檢測，結(jié)果顯示液體培養(yǎng)法陽性檢出率為31.67%（19/60）；傳統(tǒng)固體羅氏培養(yǎng)法檢測陽性率為15.00%（9/60）。不同培養(yǎng)法總陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.658，P＜0.05）。見表 2。

表2 不同培養(yǎng)法對分枝桿菌陽性檢出率比較[%（例/ 例）]

2.3 微孔板法藥敏法對抗結(jié)核藥物耐藥性檢測結(jié)果 微孔板法藥敏法結(jié)果顯示，利福平耐藥16 個，異煙肼耐藥14 個，阿米卡星耐藥1 個，左氧沙星耐藥2 個。傳統(tǒng)比例法藥敏法利福平耐藥12 個，異煙肼耐藥12 個，阿米卡星耐藥1 個，左氧氟沙星耐藥1 個。微孔板法藥敏法對阿米卡星耐藥檢測特異性高于傳統(tǒng)比例法藥敏法，差異顯著（P＜0.05），其他檢測效能比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3～表5。

表3 微孔板法藥敏法對抗結(jié)核藥物耐藥性檢測結(jié)果（個）

表4 傳統(tǒng)比例法藥敏法對抗結(jié)核藥品耐藥性檢測結(jié)果（個）

表5 微孔板法藥敏法、傳統(tǒng)比例法藥敏法對抗結(jié)核藥品耐藥性檢測效能分析[%（例/ 例）]

3 討論

作為臨床常見病，結(jié)核感染常見致病菌為結(jié)核分枝桿菌，發(fā)病率、死亡率高，目前仍是威脅人類健康的公共衛(wèi)生疾病。現(xiàn)有資料顯示全球在結(jié)核感染控制方面仍存在諸多問題，疾病預(yù)防與控制措施相關(guān)資料較缺乏[7～9]。以往研究報道，機(jī)體感染結(jié)核桿菌后是否發(fā)病很大程度上取決于患者抵抗力、結(jié)核桿菌數(shù)量及毒力等[10～11]。隨著卡介苗的接種普及，各種有效抗結(jié)核藥的問世、結(jié)核病的嚴(yán)格管理和隔離，很大程度上控制了結(jié)核的傳染，控制了結(jié)核病的傳染率。及時發(fā)現(xiàn)、及時隔離處理、并進(jìn)行有效抗結(jié)核治療，是抗結(jié)核防治工作的重中之重[12～14]。

目前，多數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)未具備開展結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的條件，無法進(jìn)行藥敏試驗，部分甚至不能夠滿足結(jié)核分枝桿菌的抗酸染色檢查，在對結(jié)核感染患者予以治療時多依賴臨床表現(xiàn)、影像學(xué)特點等，常用藥物包括利福平、異煙肼、阿米卡星等，基于當(dāng)前嚴(yán)峻的結(jié)核耐藥形勢，依據(jù)經(jīng)驗性治療方案已經(jīng)無法滿足結(jié)核感染的治療需要[15]。且多數(shù)患者由于初治失敗或再次復(fù)發(fā)導(dǎo)致耐藥增加，因此尋找一種準(zhǔn)確、快速的藥敏試驗迫在眉睫[16]。傳統(tǒng)固體羅氏培養(yǎng)法在培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌時耗時長，由于細(xì)菌生長速度慢，往往需要1 個月左右才能夠判斷是否存在細(xì)菌集落，且陽性率低，考慮是因為結(jié)核分枝桿菌多在低氧環(huán)境下產(chǎn)生，肉芽組織細(xì)菌量少，部分手術(shù)患者術(shù)前需行強(qiáng)化抗結(jié)核治療，導(dǎo)致細(xì)菌量減少[17]。比例濃度法是目前應(yīng)用最為廣泛且受臨床信賴的方法，但等待時間長。近年來分枝桿菌液體培養(yǎng)法在臨床得以應(yīng)用，其主要原理如下：MGIT 底部包埋了熒光物質(zhì)，當(dāng)管內(nèi)氧含量變化后，熒光物質(zhì)也會隨之發(fā)生反應(yīng)，分枝桿菌在MGIT 內(nèi)生長過程中會對氧有一定的消耗，導(dǎo)致管內(nèi)熒光物質(zhì)被激活，從而釋放熒光，經(jīng)過MGIT 熒光讀數(shù)儀能夠直接對結(jié)果進(jìn)行判讀，具有操作簡單、可行性強(qiáng)等優(yōu)勢[18～20]。本研究分枝桿菌液體培養(yǎng)法對疑似新發(fā)病例、復(fù)診患者報陽天數(shù)均短于傳統(tǒng)固體羅氏培養(yǎng)法，且對分枝桿菌總陽性檢出率高于傳統(tǒng)固體羅氏培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），體現(xiàn)了液體培養(yǎng)法的優(yōu)勢。不僅如此，液體培養(yǎng)法利用MIC 能夠?qū)λ幬锏臍⒕?、抑菌作用進(jìn)行評估，MIC 值越小提示藥效越強(qiáng)。

作為藥敏試驗的有效檢測方法，微孔板法在早期耐藥篩查中有著一定的應(yīng)用，其在96 孔板中提前加入被檢測藥物，在板中接種定量菌懸液，不僅操作簡單，而且降低了污染風(fēng)險，能夠?qū)崿F(xiàn)對包含4 種一線、12 種二線在內(nèi)的抗結(jié)核藥物進(jìn)行藥敏檢測，為結(jié)核感染患者早期耐藥篩查提供可靠的參考[21～22]。本研究將比例法固體培養(yǎng)藥敏結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，可以發(fā)現(xiàn)微孔板法藥敏法對阿米卡星耐藥檢測特異性高于傳統(tǒng)比例法藥敏法，差異顯著（P＜0.05），體現(xiàn)了微孔板法在藥敏實驗中的應(yīng)用優(yōu)勢。以往研究發(fā)現(xiàn)，微孔板法能夠檢出低濃度耐藥情況，可為藥物使用劑量的確定提供依據(jù)[23～24]。在檢查過程中存在檢測結(jié)果不一致的情況，考慮與菌株活性有關(guān)。較弱的菌株活性會減慢代謝速度，細(xì)菌生長不充分，對判斷結(jié)果準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響[25]。分枝桿菌藥敏閱讀儀的應(yīng)用則能夠促進(jìn)分辨率的提升。

本研究就分枝桿菌液體培養(yǎng)和微孔板法在藥敏實驗中的價值進(jìn)行了匯報，但病例少、隨訪時間有限，可能有所偏倚，且對于不符合標(biāo)準(zhǔn)未能進(jìn)一步進(jìn)行基因測序，后續(xù)仍需大樣本研究，挖掘其臨床價值，更好地服務(wù)于臨床。綜上所述，分枝桿菌液體培養(yǎng)對結(jié)核感染患者分枝桿菌檢測時間短，陽性檢出率高，利用微孔板法能夠提升分枝桿菌藥敏試驗靈敏度、特異性，且可檢測到最小抑菌濃度，為藥物療效監(jiān)測以及精準(zhǔn)治療提供可靠的參考依據(jù)。