小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)元周圍網(wǎng)絡(luò)降解促進(jìn)疼痛

一、主要研究背景

周圍神經(jīng)損傷導(dǎo)致疼痛敏化現(xiàn)象。受損的初級傳入神經(jīng)釋放趨化因子、信號分子和蛋白酶激活脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而增強脊髓傷害性感受通路的興奮性。小膠質(zhì)細(xì)胞釋放一系列與細(xì)胞表面受體結(jié)合的生物活性物質(zhì)，通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)過程來增加神經(jīng)元活動。這些物質(zhì)如何在不影響其他感覺形式的情況下特異性地敏化疼痛信號通路目前尚不清楚。既往對小膠質(zhì)細(xì)胞影響脊髓神經(jīng)元功能的研究主要集中在細(xì)胞內(nèi)作用機制。中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 細(xì)胞外基質(zhì)成分為神經(jīng)元提供結(jié)構(gòu)支持，調(diào)控神經(jīng)元的興奮性和突觸可塑性，但其在調(diào)節(jié)脊髓傷害性感受通路中的作用尚不明確。神經(jīng)元周圍網(wǎng)絡(luò)(PNNs)是CNS 中最重要的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)，由硫酸軟骨素糖鏈修飾的蛋白聚糖核心蛋白組成。在新皮質(zhì)中，PNNs選擇性地包裹快放電的小清蛋白陽性的抑制性中間神經(jīng)元的胞體和近端樹突，通過調(diào)節(jié)突觸輸入和內(nèi)在興奮性來調(diào)節(jié)它們的神經(jīng)可塑性。該研究探討了PNNs 在脊髓的分布以及在調(diào)節(jié)傷害性信息的脊髓神經(jīng)元活動中的作用。

二、主要研究結(jié)果

1. 脊髓I 層中的PNNs 圍繞投射神經(jīng)元

紫藤凝集素 (WFA) 可特異性結(jié)合PNN 糖蛋白的糖胺聚糖 (GAG) 側(cè)糖鏈，因此WFA 染色可以識別PNNs。此外，PNNs 也可以通過標(biāo)記其核心蛋白成分聚集蛋白聚糖來顯示。對脊髓切片的聚集蛋白聚糖進(jìn)行免疫染色顯示，PNNs 圍繞背角I 層大直徑神經(jīng)元的胞體，呈現(xiàn)出內(nèi)-外側(cè)方向。高分辨率共聚焦Airyscan 成像顯示，抑制性突觸前末端結(jié)構(gòu)位于PNNs 孔內(nèi)。將熒光金 (FG) 注入臂旁外側(cè)核 (LPb)的逆行追蹤顯示，脊髓I 層中的PNNs 選擇性地存在于脊髓-臂旁核投射神經(jīng)元附近，而在其他細(xì)胞類型周圍未發(fā)現(xiàn)。脊髓I 層中PNN 陽性 (PNN+) 投射神經(jīng)元的胞體明顯大于PNN 陰性 (PNN) 投射神經(jīng)元或其他神經(jīng)元細(xì)胞類型。PNNs 稀疏分布在脊髓III 層，幾乎不存在于脊髓II 層中。在脊髓IV 和V層中，在抑制性 (Pax2+) 和興奮性 (Pax2', NeuN+) 神經(jīng)元周圍都發(fā)現(xiàn)了PNNs。將小鼠后爪暴露于機械（25 g 活頁夾夾30 秒）或熱（55℃水浴30 秒）傷害性刺激下，可誘導(dǎo)Fos 在脊髓I 層PNN+投射神經(jīng)元中的表達(dá)，表明這類神經(jīng)元參與編碼疼痛相關(guān)的信息。

2.周圍神經(jīng)損傷后PNNs 的變化

為了研究脊髓中的PNNs 是否在周圍神經(jīng)損傷后發(fā)生改變，研究團隊利用小鼠構(gòu)建坐骨神經(jīng)損傷模型 (SNI) ，該模型的特征是在神經(jīng)損傷2～3 天后，小鼠的疼痛行為最為明顯。SNI 造模后第3 天，WFA 標(biāo)記PNNs 上的GAGs 在脊髓I 層投射神經(jīng)元周圍的豐度顯著降低（降低76.3%），在損傷后1周和2 周仍維持低水平；而聚集蛋白聚糖的豐度未受影響。在脊髓深層的PNNs 未顯示出明顯的WFA染色變化。

3.小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)PNNs 的降解

CD68 的免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)，SNI 第3 天，大多數(shù)小膠質(zhì)細(xì)胞（有67.1%）的溶酶體中出現(xiàn)WFA標(biāo)記的PNNs。在損傷后第1 周和第2 周，吞噬PNNs 的小膠質(zhì)細(xì)胞比例明顯減少。為了研究小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)損傷后PNNs 降解中的作用，該研究團隊使用在小膠質(zhì)細(xì)胞中選擇性表達(dá)白喉毒素受體(DTR) 的Cre 誘導(dǎo)型小鼠 (iDTR; TMEM119CreERT2)耗竭小膠質(zhì)細(xì)胞。在這些小鼠，周圍神經(jīng)損傷未引起機械痛敏，且在SNI 造模后第3 天，脊髓I 層投射神經(jīng)元周圍的PNNs 沒有出現(xiàn)明顯減少，說明未引起PNNs 的降解。為了進(jìn)一步證實小膠質(zhì)細(xì)胞在PNNs 降解中的作用，使用缺乏CX3CR1 的小鼠，該受體介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和吞噬活性。免疫熒光實驗結(jié)果表明，周圍神經(jīng)損傷后，Cx3crr′～型小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞的增生與對照小鼠相似，但其小膠質(zhì)細(xì)胞溶酶體數(shù)量顯著減少，提示小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性減弱。同時，該基因型小鼠沒有表現(xiàn)出疼痛過敏反應(yīng)，這與既往的實驗報道一致。在神經(jīng)損傷后，Cx3crr′～型小鼠未出現(xiàn)脊髓背角I 層投射神經(jīng)元周圍的PNNs 的大量降解，并且在SNI 造模后第3 天檢測到小膠質(zhì)細(xì)胞中的WFA 表達(dá)顯著減少。這些結(jié)果表明小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)周圍神經(jīng)損傷后的PNNs降解。

4.投射神經(jīng)元周圍PNNs 的降解介導(dǎo)疼痛相關(guān)行為

為了研究去除投射神經(jīng)元周圍的PNNs 是否會引起疼痛，研究團隊通過將rAAV2-Cre 注射到Acan 小鼠的LPb 核中來敲除投射神經(jīng)元中的聚集蛋白聚糖。rAAV2-Cre 逆向投射到LPb 核的神經(jīng)元并表達(dá)Cre 重組酶，這些神經(jīng)元包括脊髓I 層的投射神經(jīng)元。驗證發(fā)現(xiàn)，注射rAAV2-Cre 的Acari 小鼠脊髓I 層投射神經(jīng)元周圍的PNNs 被破壞。正常小鼠在熱板實驗中會出現(xiàn)舔爪、跳躍等反應(yīng)，而注射AAV2-Cre 的Acania小鼠在熱板實驗中舔爪/跳躍的潛伏期顯著縮短，特異性敲除脊髓I 層投射神經(jīng)元周圍PNNs 后引起了熱過敏反應(yīng)。同時，小鼠面部疼痛表情量表評估顯示，去除PNNs 引起自發(fā)性疼痛。由于周圍神經(jīng)損傷減少PNNs 上的GAG而不影響聚集蛋白聚糖，并且既往方法靶向所有投射到LPb 核的神經(jīng)元，研究團隊利用表達(dá)硫酸軟骨素酶(chABC)的AAV 選擇性去除腰脊髓投射神經(jīng)元周圍的GAG。ChABC 特異性消化PNNs 上的GAG，已廣泛用于研究PNNs 在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用。通過共同注射兩種病毒載體：rAAV2-Cre 注射到LPb 核，Cre 依賴性方式表達(dá)chABC 的AAV(AAV9-DIOchABC)注射到腰脊髓，以實現(xiàn)腰段脊髓投射神經(jīng)元表達(dá)chABC。這種方法導(dǎo)致脊髓I 層上的PNNs 中的GAGs 被去除而不影響聚集蛋白聚糖的表達(dá)，也不影響深層PNNs 的結(jié)構(gòu)亦或是小膠質(zhì)細(xì)胞激活。行為結(jié)果顯示，腰脊髓投射神經(jīng)元中去除GAG 的小鼠在熱板實驗中產(chǎn)生熱過敏反應(yīng)，并誘發(fā)自發(fā)性疼痛。

5.去除GAG 抑制脊髓I 層投射神經(jīng)元

既往對皮質(zhì)和海馬的研究表明，PNNs 調(diào)節(jié)突觸傳遞并影響神經(jīng)元內(nèi)在興奮性。該研究團隊發(fā)現(xiàn)PNNs 降解促進(jìn)疼痛行為，促使他們研究去除PNNs的GAG 是否會增加脊髓背角I 層投射神經(jīng)元的活動。

首先，研究通過量化抑制性 (VGAT+) 和興奮性(VGLUT2+) 突觸前的puncta 來評估PNN+投射神經(jīng)元上的興奮性和抑制性突觸輸入的數(shù)量。在PNN+投射神經(jīng)元的胞體上，VGAT+顯著多于VGLUT2+（多60%）。通過將AAV-chABC 注射到腰椎脊髓來消除PNNs 中的GAG 并沒有改變PNN+投射神經(jīng)元上興奮性和抑制性突觸前末端的數(shù)量。SNI 造模后第3 天，興奮性和抑制性突觸前末端的數(shù)量也保持不變。

為了研究GAG 去除對脊髓I 層投射神經(jīng)元的活動的影響，使用全細(xì)胞膜片鉗記錄測量了離體脊髓片上這類神經(jīng)元的突觸輸入及其內(nèi)在興奮性。采用帶有LED 的傾斜紅外照明設(shè)備可識別并用膜片鉗記錄完整脊髓中被PNN 包圍的大直徑 (＞ 20 μm)且呈內(nèi)-外側(cè)方向的脊髓I 層神經(jīng)元。為了確認(rèn)這些神經(jīng)元周圍是否存在PNNs，將鉗到的細(xì)胞中注入染料Alexafluor488，然后進(jìn)行固定和蛋白聚糖免疫染色。用chABC 降解GAG 導(dǎo)致膜電位去極化(4.8±1) mV 和動作電位放電頻率增加，而不會改變PNN+神經(jīng)元的膜電位和放電率，并且這種效應(yīng)是PNN+神經(jīng)元特有的。對自發(fā)微小突觸活動的分析表明，chABC 降低了微小抑制性突觸后電流的頻率（mIPSC，減少48%），但不降低其幅度。此外，在存在突觸受體拮抗劑混合物（AP-5、DNQX、荷包牡丹堿和士的寧）以抑制興奮性和抑制性突觸活動的情況下，PNNs 的降解對投射神經(jīng)元的被動膜特性和內(nèi)在興奮性沒有影響。為了證實神經(jīng)損傷后PNNs 的破壞伴隨著抑制性輸入的減少，在SNI 造模后第3 天記錄了脊髓I 層PNN+投射神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)mIPSC 的頻率顯著降低。這種減少在小膠質(zhì)細(xì)胞耗竭的小鼠中得到抑制，但可以通過用chABC 去除PNNs 來恢復(fù)。與這些結(jié)果一致的是，神經(jīng)損傷引起的自發(fā)性疼痛通過消除小膠質(zhì)細(xì)胞得到緩解，但能通過去除脊髓I 層投射神經(jīng)元周圍的PNNs 來恢復(fù)。

三、討論

該研究表明在脊髓背角I 層存在一類投射到外側(cè)臂旁核的神經(jīng)元，可選擇性被PNNs 包裹。當(dāng)周圍神經(jīng)損傷后，以小膠質(zhì)細(xì)胞依賴性方式降解。PNNs 的降解足以通過減少抑制性突觸輸入來增強投射神經(jīng)元的活動，并促進(jìn)疼痛行為。

在皮質(zhì)和海馬中，PNNs 主要存在于小清蛋白陽性的抑制性中間神經(jīng)元周圍，而在脊髓背角中，PNNs 僅存在于脊髓I 層大直徑投射神經(jīng)元周圍，并在深層中圍繞各種神經(jīng)元類型。PNNs 在投射神經(jīng)元周圍的選擇性定位具有高度的特異性，使通過調(diào)節(jié)PNNs 來調(diào)節(jié)投射神經(jīng)元的活動具有可操作性。由于投射神經(jīng)元是脊髓疼痛環(huán)路的主要輸出，因此通過降解周圍的PNNs 來激活投射神經(jīng)元是增加脊髓傷害感受環(huán)路輸出的一種特定且有效的機制。

突觸終末包埋于PNNs 中，因此PNNs 的組成和穩(wěn)定性對突觸活動有重要影響。去除PNNs 中帶負(fù)電的硫酸鹽基團可能導(dǎo)致突觸結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定并降低突觸傳遞的有效性。小膠質(zhì)細(xì)胞通過多種機制促進(jìn)疼痛狀態(tài)。例如，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的KCC2 下調(diào)使胞內(nèi)氯增加并減少抑制性傳入，從而促進(jìn)神經(jīng)病理性疼痛。在神經(jīng)損傷后7 天，I 層和II 層多種細(xì)胞類型出現(xiàn)KCC2 的下調(diào)和氯的異常。在損傷后3天，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的PNNs 降解選擇性地增強了一部分脊髓I 層投射神經(jīng)元的活動。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞可能以不同的機制發(fā)揮作用，反映了神經(jīng)病理性疼痛機制的復(fù)雜性和魯棒性，表明有效的治療應(yīng)該針對幾個過程來逆轉(zhuǎn)過敏反應(yīng)。此外，小膠質(zhì)細(xì)胞參與介導(dǎo)慢性疼痛的性別差異已經(jīng)得到證實，但該研究發(fā)現(xiàn)PNNs 的小膠質(zhì)細(xì)胞依賴性降解及其對突觸活動和疼痛相關(guān)行為的影響在雌性和雄性中都存在。

綜上所述，該研究團隊的工作揭示了小膠質(zhì)細(xì)胞在周圍神經(jīng)損傷后去抑制投射神經(jīng)元。這些發(fā)現(xiàn)提示靶向這個新機制可能是開發(fā)神經(jīng)病理性疼痛治療的新策略。