自噬紊亂促進(jìn)膿毒癥免疫抑制機(jī)制的研究進(jìn)展

余澤偉 孫 健

1.紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江紹興 312000；2.紹興文理學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江紹興 312000

膿毒癥致急性器官功能障礙居重癥監(jiān)護(hù)病房患者死亡原因的首位，其起病急驟且發(fā)展迅猛，具有發(fā)病率高、治療費(fèi)用昂貴、病死率高等特點(diǎn)，顯著增加全球疾病負(fù)擔(dān)，因此，2017 年世界衛(wèi)生組織將膿毒癥列為全球衛(wèi)生優(yōu)先事項(xiàng)[1]。膿毒癥的發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前研究顯示，免疫抑制誘發(fā)的頑固性感染是導(dǎo)致膿毒癥高病死率的根本原因。此外，膿毒癥具有高度異質(zhì)性，且臨床治療變異性高，目前僅依靠抗生素、液體復(fù)蘇和器官支持治療，尚難以降低患者中遠(yuǎn)期病死率。因此，進(jìn)一步探索膿毒癥免疫抑制的機(jī)制，尋找更有效、更精準(zhǔn)的治療方法，有著極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。

細(xì)胞自噬是真核生物對自身細(xì)胞內(nèi)廢棄的細(xì)胞器、侵犯的微生物等，通過溶酶體機(jī)制進(jìn)行降解、再循環(huán)的過程，其同時參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖等多種重要的生理過程，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，常常被認(rèn)為是一種細(xì)胞保護(hù)性程序[2]。自噬還具有恢復(fù)免疫細(xì)胞功能的潛力[3]。研究顯示，膿毒癥晚期自噬功能紊亂可能是導(dǎo)致膿毒癥引發(fā)免疫抑制的主要原因[4]。因此，進(jìn)一步探索自噬在膿毒癥晚期免疫抑制中的作用機(jī)制，可能成為治療膿毒癥的新靶點(diǎn)之一。

1 膿毒癥與宿主免疫

新的膿毒癥指南定義，膿毒癥是因感染引發(fā)的宿主本身免疫功能失調(diào)而導(dǎo)致多器官功能衰竭，該定義將感染、免疫功能失調(diào)、多器官功能衰竭聯(lián)系在一起，強(qiáng)調(diào)三者之間的遞進(jìn)關(guān)系，其中膿毒癥的主要環(huán)節(jié)為宿主免疫反應(yīng)失調(diào)[5]。

1.1 膿毒癥的病程與機(jī)體免疫狀態(tài)的關(guān)系

當(dāng)機(jī)體處于各種內(nèi)源性或外源性應(yīng)激時，會觸發(fā)一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)[6]。研究表明，宿主可通過模式識別受體（pattern–recognition receptor，PRR）識別各種有害抗原，啟動一系列下游信號分子，刺激免疫細(xì)胞釋放大量白細(xì)胞介素（interleukin，IL）–1β、腫瘤壞死因子–α（tumor necrosis factor–alpha，TNF–α）等炎癥介質(zhì)。同時，抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）通過PRR 識別外源性抗原，與APC 表面表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（major histocompatibility complex Ⅱ，MHCⅡ）結(jié)合形成抗原肽–MHCⅡ復(fù)合體，協(xié)同共刺激分子一起呈遞給CD4+T 淋巴細(xì)胞，使其活化并釋放更多細(xì)胞因子形成“炎癥細(xì)胞因子風(fēng)暴”，致使炎癥擴(kuò)散及組織損傷，并最終引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）；隨后，促炎反應(yīng)激活調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Tr 細(xì)胞），釋放轉(zhuǎn)化生長因子–β（transforming growth factor–beta，TGF–β）、IL–10，及髓系來源抑制細(xì)胞（myeloid–derived suppressor cell，MDSC）[7]、兒茶酚胺[8]等抑制CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞功能。隨即細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路被激活，淋巴細(xì)胞群相繼凋亡，且可降低單核細(xì)胞表面人類白細(xì)胞抗原–DR（human leukocyte antigen–DR，HLA–DR）的表達(dá)[9]，誘發(fā)免疫麻痹[10]，引發(fā)代償性抗炎反應(yīng)綜合征（compensatory anti–inflammatory response syndrome,CARS）。

早期研究認(rèn)為SIRS 與CARS 是膿毒癥序貫出現(xiàn)的兩個階段，但隨著深入研究膿毒癥相關(guān)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)SIRS 和CARS 并不是兩個獨(dú)立體，二者互相影響，或稱混合性拮抗炎癥反應(yīng)綜合征（mixed antagonist response syndrome，MARS）。Xiao 等[11]研究顯示，全身性感染免疫抑制在早期即可發(fā)生。近年來，隨著重癥醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，尤其是早期目標(biāo)指導(dǎo)性治療和早期集束化治療的提出規(guī)范了膿毒癥的治療行為[12]，使膿毒癥患者的早期病死率下降52.8%[13]。然而臨床發(fā)現(xiàn)，更多在早期炎癥反應(yīng)亢進(jìn)中幸存的膿毒癥患者出現(xiàn)病情遷延，部分患者長期滯留重癥監(jiān)護(hù)病房而大量消耗醫(yī)療資源。最近研究顯示，即使膿毒癥幸存者達(dá)到臨床治愈后出院，當(dāng)再次給予免疫系統(tǒng)激活劑刺激時，其細(xì)胞因子分泌能力大大減弱，顯示免疫系統(tǒng)受到全面損害[14]，其2～3 年內(nèi)病死率高達(dá)45%～71%[15,16]。Gentile 等[17]因此提出持續(xù)炎癥反應(yīng)–免疫抑制–分解代謝綜合征（persistent inflammatory response immunosupp–ressive catabolism syndrome,PICS）這個新概念。

1.2 PICS 炎癥–免疫–代謝多重惡性循環(huán)

PICS 是指慢性危重癥患者因受到全身嚴(yán)重感染或非感染如重癥急性胰腺炎等打擊而表現(xiàn)為持續(xù)的慢性炎癥反應(yīng)、免疫功能抑制及代謝功能紊亂，其突出的特征是持續(xù)炎癥反應(yīng)亢進(jìn)和免疫功能抑制同時并存[17]。

PICS 患者因持續(xù)的感染灶或難以愈合的損傷，通過各種炎癥細(xì)胞通路誘發(fā)促炎反應(yīng)，觸發(fā)“炎癥細(xì)胞因子風(fēng)暴”，引發(fā)急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（acute lung injury/acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS），隨著免疫細(xì)胞的大量消耗及凋亡，最終導(dǎo)致免疫麻痹，形成炎癥–免疫惡性循環(huán)。最近有研究者提出膿毒癥后死亡的三峰分布[18]：①免疫亢進(jìn)導(dǎo)致的早期死亡；②持續(xù)性器官損傷和免疫抑制導(dǎo)致的延遲死亡[9]；③持續(xù)的免疫功能障礙和慢性炎癥導(dǎo)致的遠(yuǎn)期死亡[19,20]?？梢姡筛腥?、創(chuàng)傷等原因誘導(dǎo)的宿主免疫功能抑制可能是導(dǎo)致膿毒癥中遠(yuǎn)期病死率增加的根本原因。

膿毒癥的高代謝反應(yīng)主要通過增強(qiáng)糖酵解途徑及氧化磷酸化產(chǎn)生的腺苷三磷酸（adenosine–triphosphate，ATP）供能[21]。長期高分解代謝致營養(yǎng)不良，引起能量代謝失衡，通過免疫代謝機(jī)制使免疫功能降低，誘發(fā)機(jī)會性感染；同時免疫細(xì)胞的代謝缺陷將導(dǎo)致紊亂的炎癥反應(yīng)，最終引發(fā)免疫麻痹，形成炎癥–免疫–代謝多重惡性循環(huán)[22]。

1.3 膿毒癥機(jī)體免疫狀態(tài)的監(jiān)測

膿毒癥早期，盡管固有免疫激活、炎癥亢進(jìn)和免疫抑制可同時存在，但仍以免疫亢進(jìn)為主，隨著病程的進(jìn)展，在持續(xù)多重惡性循環(huán)下，晚期通常以免疫抑制占主導(dǎo)地位，這提示膿毒癥患者免疫狀態(tài)存在時間轉(zhuǎn)折點(diǎn)，動態(tài)監(jiān)測其變化可能成為靶向免疫監(jiān)測及免疫調(diào)理治療的重要手段，但目前臨床上仍缺乏明確的免疫監(jiān)測指標(biāo)。

HLA–DR 是公認(rèn)的免疫抑制相關(guān)的生物標(biāo)志物。研究表明，重癥膿毒癥死亡患者外周血單核細(xì)胞HLA–DR 表達(dá)明顯下降[9]，呈典型的免疫抑制狀態(tài)，提示HLA–DR 可用于監(jiān)測機(jī)體免疫功能，且HLA–DR 表達(dá)低下與膿毒癥患者不良預(yù)后有顯著相關(guān)性[23]。Meisel 等[24]將連續(xù) 2d 表達(dá)單核細(xì)胞HLA–DR＜每細(xì)胞8000 單克隆抗體（monoclonal antibodies，mAb）設(shè)定為免疫抑制組，用免疫增強(qiáng)藥物粒細(xì)胞–巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte–macrophage colony–stimulating factor，GM–CSF）治療膿毒癥免疫抑制患者，并將單核細(xì)胞HLA–DR≥15 000mAb 作為治療指標(biāo)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，院內(nèi)金黃色葡萄球菌感染患者多合并基礎(chǔ)疾病等，宿主免疫功能已受損，此時免疫炎癥細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄悄然改變，當(dāng)機(jī)體再次受到刺激時，大量免疫抑制因子（如IL–10）釋放，相反，機(jī)體分泌促炎因子的能力降低甚至無反應(yīng)，表現(xiàn)為IL–10/TNF–α 比值升高，誘導(dǎo)并加重機(jī)體免疫抑制，該過程稱為內(nèi)毒素耐受[25]。免疫細(xì)胞的增殖狀態(tài)是另一個反映機(jī)體免疫狀態(tài)的指標(biāo)[26]，目前已有研究報道將外周血總淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)＜0.8×109/L 作為判斷免疫功能抑制的標(biāo)準(zhǔn)[15]。提示機(jī)體的免疫水平可通過動態(tài)監(jiān)測血漿細(xì)胞因子（如IL–10/TNF–α 比值）、HLA–DR 表達(dá)及免疫細(xì)胞增殖進(jìn)行評估。

2 細(xì)胞自噬在膿毒癥晚期免疫抑制中的作用

2.1 自噬對膿毒癥患者組織器官的作用

自噬能促進(jìn)生成微管運(yùn)輸相關(guān)蛋白和溶酶體相關(guān)蛋白，還能抑制IL–18、IL–1β 及氧自由基等的產(chǎn)生，經(jīng)PRR/吞噬體/溶酶體途徑實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)清除，達(dá)到減輕炎癥反應(yīng)、保護(hù)組織器官的作用[4]。Zhao 等[27]研究顯示，抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）能夠誘導(dǎo)自噬，減少炎癥細(xì)胞活化和增殖，減輕脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥ALI。Sun 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，心臟自噬相關(guān)蛋白Beclin–1 依賴性自噬，可緩解LPS誘導(dǎo)的膿毒癥相關(guān)損傷，改善心臟功能。Hsiao 等[29]通過盲腸結(jié)扎穿刺（cecal ligation and puncture，CLP）制作膿毒癥模型，發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞自噬在術(shù)后3h逐漸升高，并在9～18h 呈下降趨勢，當(dāng)應(yīng)用mTOR抑制劑刺激NRK–52E 細(xì)胞10h，發(fā)現(xiàn)其LC3Ⅱ（自噬相關(guān)蛋白）明顯升高，且細(xì)胞死亡的數(shù)目減少。但也有研究發(fā)現(xiàn)，抑制自噬反而減輕LPS 誘導(dǎo)的ALI[30]?？梢姡摱景Y引發(fā)多臟器功能衰竭的器官中細(xì)胞自噬上調(diào)，但在不同器官和疾病的不同病程，自噬可能呈現(xiàn)不同的調(diào)節(jié)作用，以維持促炎和抗炎因子間的穩(wěn)態(tài)平衡[31]。

2.2 自噬影響膿毒癥晚期機(jī)體免疫狀態(tài)

膿毒癥晚期患者通常以免疫抑制為主，表現(xiàn)為HLA–DR 和協(xié)同刺激分子表達(dá)降低，MHCⅡ分子抗原呈遞能力下降，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子的能力下降，呈現(xiàn)免疫麻痹。自噬可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞、B 細(xì)胞和上皮細(xì)胞的生成，上調(diào)HLA–DR 的表達(dá)，增強(qiáng)固有免疫；LC3Ⅱ可使CD4+T 淋巴細(xì)胞表達(dá)HLA–DR 增多，增強(qiáng)機(jī)體的獲得性免疫。簡言之，自噬能增強(qiáng)MHCⅡ分子抗原呈遞并活化CD4+T 淋巴細(xì)胞[32]。Kondylis 等[33]研究提示，自噬可能是通過與內(nèi)體MHCⅡ類區(qū)室（MHC class Ⅱ compartment，MⅡC）融合來協(xié)助其發(fā)揮抗原呈遞功能。自噬還可促進(jìn)MHCⅠ類分子交叉遞呈細(xì)胞外抗原，但機(jī)制尚不明確[34]。

2.3 自噬參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞增殖并維持免疫穩(wěn)態(tài)

mTOR 是磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3–kinase，PI3K）相關(guān)激酶家族成員之一。細(xì)胞自噬受上游信號分子mTOR 的負(fù)性調(diào)控，且可通過PI3K/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/mTOR 或腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine 5’–monophosphate–activated protein kinase，AMPK）/mTOR 信號通路抑制mTOR以實(shí)現(xiàn)上調(diào)自噬[19]。同時，mTOR 也調(diào)控免疫細(xì)胞的分化和增殖，在細(xì)胞的生存中不可或缺[35]。

研究發(fā)現(xiàn)，LPS 能激活磷酸化的mTOR（phos phorylation–mTOR，p–mTOR），促進(jìn)THP–1 細(xì)胞增殖，表現(xiàn)為典型的膿毒癥早期炎癥反應(yīng)。LPS 還能刺激THP–1 細(xì)胞通過核因子–κB 抑制蛋白激酶（nuclear factor–kappa B inhibitor protein kinas，IKK）/核因子–κB（nuclear factor kappa B，NF–κB）/TNF–α途徑引發(fā)炎癥并誘導(dǎo)自噬。當(dāng)給予自噬誘導(dǎo)劑米諾環(huán)素后，能明顯抑制p–mTOR 并誘導(dǎo)自噬，抑制細(xì)胞增殖并減少細(xì)胞因子的分泌，且與mTOR 抑制劑有協(xié)同作用，提示早期給予自噬誘導(dǎo)劑能夠抑制炎癥[36]。在膿毒癥腦病中，抑制NF–κB 信號通路可推動自噬流，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)[37]；積聚的p62（自噬相關(guān)蛋白）可抑制自噬流激活NF–κB 加劇炎癥因子風(fēng)暴[38]。意味著NF–κB 和自噬這兩個應(yīng)激途徑在炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)中呈現(xiàn)密切的相互作用。

如前所述，激活mTOR 能促進(jìn)免疫細(xì)胞快速增殖，但此時自噬反而受到抑制。由于自噬對調(diào)節(jié)記憶性免疫細(xì)胞的功能至關(guān)重要，因此，靶向自噬的治療可能對維持機(jī)體免疫平衡有著重要意義[39]。

2.4 自噬與膿毒癥免疫抑制期T 淋巴細(xì)胞的關(guān)系

T 淋巴細(xì)胞是機(jī)體獲得性免疫的關(guān)鍵成員，廣泛參與機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，T 淋巴細(xì)胞亞群通常反映機(jī)體的免疫水平，其中輔助T 細(xì)胞（helper T cell，Th 細(xì)胞）是介導(dǎo)細(xì)胞免疫的重要成員，包括Thl 細(xì)胞和Th2 細(xì)胞。Thl 細(xì)胞分泌的γ 干擾素（interferon–gamma，IFN–γ）、TNF–α 具有刺激自噬的作用，Th2細(xì)胞分泌的IL–4 和IL–13 能抑制自噬[40]。

隨著膿毒癥病程進(jìn)展，單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞凋亡增加。此外，T 淋巴細(xì)胞長期暴露于持久性刺激中可能會致其表面抑制受體的表達(dá)增加[41]，CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生減少，誘導(dǎo)Th1 細(xì)胞向Th2 細(xì)胞極化，分泌IFN–γ、TNF–α等細(xì)胞因子的能力減弱，細(xì)胞增殖能力受損，HLA–DR 表達(dá)下降，Tr 細(xì)胞及TGF–β 增加，巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等還會分泌大量IL–10、IL–4，一同誘發(fā)免疫抑制[42]。

免疫功能障礙的關(guān)鍵因素是T 淋巴細(xì)胞耗竭，而T 淋巴細(xì)胞耗竭的主要原因?yàn)榧?xì)胞凋亡。自噬與凋亡存在廣泛串?dāng)_，如B 細(xì)胞淋巴瘤2 家族蛋白可通過與Beclin–1 直接結(jié)合來限制其功能[43]。

Lin 等[44]研究發(fā)現(xiàn)，在T 淋巴細(xì)胞特異性自噬相關(guān)基因7（autophagy associated gene7，Atg7）敲除小鼠中建立CLP 誘發(fā)膿毒癥，會使CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞中自噬蛋白減少，同時增加CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞凋亡及小鼠病死率。Oami 等[4]研究顯示，當(dāng)自噬流受到抑制時，能增加程序性死亡蛋白–1（programmed death，PD–1）的基因表達(dá)，加速T淋巴細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致T 淋巴細(xì)胞活力和功能下降，從而增加病死率。Ge 等[45]研究顯示，在通過CLP 和內(nèi)毒素刺激方法誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型中，IL–36 通過激活自噬降低CD4+、CD25+Tr 細(xì)胞的免疫抑制活性。Wang 等[46]研究揭示mTOR 基因敲除的CLP 小鼠表達(dá)更高的LC3Ⅱ/Ⅰ、更低的p62 并減少CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡，這表明mTOR 的缺失通過改善自噬流來緩解CD4+T 淋巴細(xì)胞凋亡。膿毒癥免疫抑制期機(jī)體上調(diào)自噬的能力是有限的[28]，當(dāng)外源性有害因素持續(xù)存在時，將導(dǎo)致自噬活性降低并引發(fā)細(xì)胞自噬性死亡[47,48]。綜上所述，自噬的缺乏或受抑制與免疫細(xì)胞凋亡及其功能障礙的發(fā)生有著密不可分的聯(lián)系，上調(diào)自噬能減輕免疫抑制，提示膿毒癥晚期免疫抑制時誘導(dǎo)自噬有可能恢復(fù)免疫功能。

3 展望

膿毒癥的疾病進(jìn)程復(fù)雜，異質(zhì)性強(qiáng)，但治療針對性差，預(yù)后常不佳。PICS 的提出讓越來越多的研究者意識到，單純的抗炎或免疫治療可能并不適宜。自噬影響膿毒癥患者的免疫狀態(tài)，在膿毒癥晚期誘導(dǎo)自噬可能恢復(fù)免疫細(xì)胞功能。因此，推測在免疫監(jiān)測下進(jìn)行個體化自噬調(diào)節(jié)聯(lián)合免疫調(diào)理，較傳統(tǒng)的治療方式更有利于對膿毒癥晚期患者開展精準(zhǔn)治療。