細(xì)胞鐵死亡與胎膜早破的相關(guān)性研究

肖文霞，宋佳蔭

（北京市東城區(qū)婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心，北京 100007）

胎膜早破是指宮縮前胎膜自然破裂[1]，是產(chǎn)科常見的并發(fā)癥，其發(fā)病率在國內(nèi)為2.7% ～17%，在國外為5% ～15%[2]。胎膜早破可引起臍帶受壓和脫垂、羊水過少、胎盤早剝、新生兒呼吸窘迫綜合征、胎兒死亡、母體宮內(nèi)感染及產(chǎn)后感染等[3]，嚴(yán)重危害母嬰的健康和生命安全。因此，積極探索胎膜早破的發(fā)生原因及發(fā)病機(jī)制，并給予相應(yīng)的干預(yù)措施，對(duì)于減少胎膜早破的發(fā)生、改善母嬰結(jié)局具有重要的意義。然而，胎膜早破的確切病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，近年來人們主要從宮腔感染、營養(yǎng)、創(chuàng)傷、空氣污染、社會(huì)心理、基因及內(nèi)分泌等方面對(duì)胎膜早破的病因、病機(jī)進(jìn)行研究。本研究旨在探討細(xì)胞鐵死亡與胎膜早破的相關(guān)性，以探索胎膜早破的發(fā)生原因及發(fā)病機(jī)制，為臨床預(yù)防、治療胎膜早破提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 基線資料

于2019 年1 月1 日至2020 年12 月31 日之間，選取我院產(chǎn)科病房收治的孕婦60 例作為研究對(duì)象。將其分為兩組，其中胎膜早破孕婦30 例為病例組，正常足月妊娠孕婦30 例為對(duì)照組。兩組均為單胎妊娠，無感染及其他臨床發(fā)熱征象，無內(nèi)外科合并癥及妊娠并發(fā)癥；兩組血、尿常規(guī)及肝、腎功能均正常。胎膜早破診斷標(biāo)準(zhǔn)：孕婦自訴陰道流液或外陰濕潤等；窺陰器檢查：見液體自宮頸口內(nèi)流出或陰道后穹窿有液池形成；陰道液PH測(cè)定：PH ≥6.5 ；陰道液涂片檢查：陰道后穹窿積液涂片見羊齒植物狀結(jié)晶（《婦產(chǎn)科學(xué)》第9 版）。病例組年齡為22 ～40 歲，平均年齡為（29.2±0.4）歲，孕周為34+1～41 周，平均孕周為（38.2±1.3）周；對(duì)照組年齡為21 ～42 歲， 平均年齡為（30.3±0.3）歲，孕周為37 ～41 周，平均孕周為（39.1±0.3）周。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本制備 1）抽取兩組孕婦的清晨空腹靜脈血2 ～3 mL，置于含有枸櫞酸的抗凝管內(nèi)，在室溫下充分凝血，以2000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，分離出血清，置于冰箱內(nèi)保存待測(cè)。2）于剖宮產(chǎn)或陰道分娩后，取胎膜組織約1.5 ～3.0 g，以冷生理鹽水漂洗至血塊洗凈，吸干，稱重，置于冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實(shí)驗(yàn)步驟 1）在已稱重的胎膜組織中加9 倍的生理鹽水，倒入放置于冰塊的玻璃管內(nèi)，充分研磨，然后以2000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心20 min，取上清液分裝待測(cè)。2）用硫代巴比妥法測(cè)定血清和胎膜組織中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測(cè)定血清和胎膜組織中的谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPx4）含量；用比色法測(cè)定血清和胎膜組織中的還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）含量，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組孕婦血清及胎膜組織中的MDA 、GPx4、GSH 含量。分析胎膜早破孕婦血清與胎膜組織中MDA 、GPx4、GSH 含量的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本研究中的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，檢驗(yàn)方法采用方差齊性檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以% 表示，采用χ2 檢驗(yàn)；對(duì)胎膜早破孕婦血清與胎膜組織中MDA、GPx4、GSH 含量的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組胎膜組織中MDA 、GPx4、GSH 含量的比較

病例組胎膜組織中MDA 、GPx4、GSH 的平均含量分別為（13.74±9.14）μmol/L、（4.63±11.49）ng/mL、（24.67±4.38）μg/mL， 對(duì) 照 組 胎 膜 組 織 中MDA 、GPx4、GSH 的平均含量分別為（8.76±7.54）μmol/L、（5.58±8.223）ng/mL、（38.22±7.46）μg/mL。 與 對(duì)照組相比，病例組胎膜組織中的MDA 含量明顯升高，GPx4 和GSH 含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。詳見表1。

表1 兩組胎膜組織中MDA 、GPx4、GSH 含量的比較（± s）

表1 兩組胎膜組織中MDA 、GPx4、GSH 含量的比較（± s）

注：* 與對(duì)照組比較，P ＜0.05。

GPx4（ng/mL）組別 MDA（μmol/L）GSH（μg/mL）病例組（n=30） 13.74±9.14* 4.63±11.49* 24.67±4.38*對(duì)照組（n=30） 8.76±7.54 5.58±8.223 38.22±7.46

2.2 兩組血清中MDA 、GPx4、GSH 含量的比較

病例組血清中MDA 、GPx4、GSH 的平均含量分別 為（12.11±10.42）μmol/L、（4.05±5.32）ng/mL、（20.32±5.73）μg/mL，對(duì)照組血清中MDA 、GPx4、GSH 的 平 均 含 量 分 別 為（7.86±6.87）μmol/L、（5.26±7.81）ng/mL、（32.16±8.97）μg/mL。 與 對(duì) 照組相比，病例組血清中的MDA 含量明顯升高，GPx4 和GSH 含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。詳見表2。

表2 兩組血清中MDA 、GPx4、GSH 含量的比較（± s）

表2 兩組血清中MDA 、GPx4、GSH 含量的比較（± s）

注：* 與對(duì)照組比較，P ＜0.05。

GSH（μg/mL）病例組（n=30） 12.11±10.42* 4.05±5.32* 20.32±5.73*對(duì)照組（n=30） 7.86±6.87 5.26±7.81 32.16±8.97組別 MDA（μmol/L）GPx4（ng/mL）

2.3 胎膜早破孕婦血清與胎膜組織中MDA 、GPx4、GSH 含量的相關(guān)性

胎膜早破孕婦血清與胎膜組織中的MDA、GPx4、GSH 含量均呈正相關(guān)（r=0.467，r=0.517，r=0.543，P均＜0.01）。

3 討論

3.1 細(xì)胞鐵死亡

細(xì)胞鐵死亡（ferroptosis）是一種鐵依賴的非凋亡性細(xì)胞死亡形式，以脂質(zhì)活性氧堆積為特征[4]?！拌F死亡”這一概念最早由Dixon 在2012 年首次提出[5]，ferroptosis 一詞來源于拉丁語“ferrum”，意思是“鐵”，以及希臘語“ptosis”，意思是“衰落”[6]。形態(tài)學(xué)上，鐵死亡不同于壞死、凋亡和自噬，它既沒有與壞死相關(guān)的形態(tài)學(xué)特征，例如細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的腫脹，也沒有與凋亡相關(guān)的表現(xiàn)，包括染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞收縮、凋亡小體形成及細(xì)胞骨架崩解，同時(shí)也沒有形成典型的與自噬相關(guān)的雙側(cè)膜結(jié)構(gòu)的自噬泡，其特征為明顯的線粒體萎縮伴膜密度增加及線粒體嵴的減弱或消失[7]。生物化學(xué)上，鐵死亡以產(chǎn)生有害的鐵依賴性的脂質(zhì)過氧化物為特征[8]。鐵死亡是細(xì)胞死亡的一種形式，可由細(xì)胞的氧化系統(tǒng)尤其是Xc-（胱氨酸/ 谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）-GSHGPx4 依賴的抗氧化防御系統(tǒng)失活引起[8]。Xc-系統(tǒng)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能將細(xì)胞外的胱氨酸轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)并以1:1 的比例把細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸轉(zhuǎn)出細(xì)胞外[9]。胱氨酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，半胱氨酸是合成GSH 的重要前體。GSH 是小分子水溶性抗氧化劑，是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的線性三肽[10]，在細(xì)胞內(nèi)外都可以清除自由基以維持氧化還原平衡；GSH 也是GPx4 的輔助因子和底物，是GPx4 發(fā)揮作用所必需的物質(zhì)。GPx4 是一種硒蛋白酶，屬于GPx家族，是目前已知的GPx 家族中唯一能夠?qū)⒍拘灾|(zhì)過氧化物（L-OOH）轉(zhuǎn)化為非毒性脂質(zhì)乙醇（L-OH）的酶[11]。細(xì)胞內(nèi)的GSH 直接決定GPx4 的功能，GSH 缺乏可導(dǎo)致GPx4 失活，而GPx4 失活可引起脂質(zhì)過氧化氫產(chǎn)物堆積，這是鐵死亡的一個(gè)重要標(biāo)志[4]。因此，GSH 和GPx4 是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[12]。

最近的研究表明，鐵死亡的最終執(zhí)行者是脂質(zhì)過氧化物[13]。脂質(zhì)過氧化物是活性氧（ROS）家族中的一員。ROS 是氧分子部分還原形成的一類重要的氧化劑，包括超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、脂質(zhì)過氧化物（LOOH）和羥自由基（ROO-）等[14]。并非所有的ROS在鐵死亡中都發(fā)揮作用，在鐵死亡中發(fā)揮作用的主要是脂質(zhì)過氧化物。脂質(zhì)過氧化物主要在鐵離子的催化下形成，鐵是生物體內(nèi)重要的微量元素，也是體內(nèi)多種代謝酶的輔助因子，鐵離子（主要是二價(jià)鐵，F(xiàn)e2+）可通過非酶性的芬頓化學(xué)反應(yīng)和酶性反應(yīng)促進(jìn)脂質(zhì)過氧化物的形成[15]。脂質(zhì)過氧化物作為一種ROS，能通過多種途徑誘導(dǎo)鐵死亡：可以改變細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)、破壞離子梯度、降低膜的流動(dòng)性、減慢擴(kuò)散并增加膜的通透性而引起細(xì)胞鐵死亡；可以引起細(xì)胞膜變薄、彎曲度增加及膠?；斐赡p傷而引起細(xì)胞鐵死亡；也可以通過其降解產(chǎn)物的毒性造成損傷：脂質(zhì)過氧化物可進(jìn)一步降解為醛，包括MDA 和4- 羥基壬烯酸（4-HNE），MDA 能與氨基酸或DNA 作用形成交聯(lián)，4-HNE 也能與氨基酸形成共價(jià)產(chǎn)物，這些共價(jià)產(chǎn)物能改變蛋白和核酸的結(jié)構(gòu)與功能，并對(duì)這些分子產(chǎn)生毒性作用[16]，從而導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡。目前MDA、GSH 和GPx4 是常用的測(cè)定鐵死亡的指標(biāo)[17]。

3.2 細(xì)胞鐵死亡與胎膜早破

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，病例組胎膜組織中的MDA 含量明顯升高，GPx4 和GSH 含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。這說明胎膜組織中存在著細(xì)胞鐵死亡現(xiàn)象。已知胎膜是胎兒與母體之間的免疫和生理屏障，由羊膜和絨毛膜組成，并由細(xì)胞外基質(zhì)連接在一起，而細(xì)胞外基質(zhì)主要由膠原蛋白和蛋白多糖組成[18]。因此，胎膜從結(jié)構(gòu)上可分為胎膜細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)。胎膜破裂可能是由胎膜細(xì)胞死亡而引起，也可能由于細(xì)胞外基質(zhì)變性、破壞而引起，還可能由二者共同作用引起。因此本研究推測(cè)胎膜早破可能是由于細(xì)胞受到內(nèi)外刺激從而使細(xì)胞內(nèi)二價(jià)鐵離子濃度增加，通過芬頓化學(xué)反應(yīng)和（或）酶性反應(yīng)產(chǎn)生過量的脂質(zhì)過氧化物，同時(shí)GSH 和（或）GPx4 降低，不能及時(shí)清除過量的脂質(zhì)過氧化物，這些產(chǎn)物可能通過多種途徑破壞細(xì)胞膜，引起胎膜細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致胎膜破裂；也可能由于過量脂質(zhì)過氧化物的分解產(chǎn)物醛類與細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白發(fā)生交聯(lián)或形成共價(jià)產(chǎn)物，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)變性、破壞及降解而引起，還可能是上述因素共同作用的結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，胎膜早破孕婦血清與胎膜組織中的MDA、GPx4、GSH 含量均呈正相關(guān)，說明胎膜早破孕婦血清和胎膜組織中的鐵死亡具有一致性，這更進(jìn)一步說明胎膜早破孕婦體內(nèi)存在著細(xì)胞鐵死亡。

綜上所述，細(xì)胞鐵死亡與胎膜早破具有相關(guān)性。細(xì)胞鐵死亡是一種調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式。近年來，人們對(duì)其分子機(jī)制及調(diào)控因素的研究越來越深入，并且發(fā)現(xiàn)鐵螯合劑和親脂性抗氧化劑可抑制鐵死亡。因此，研究鐵死亡的調(diào)控機(jī)制，尋找調(diào)控靶點(diǎn)，有望成為預(yù)防與治療胎膜早破的新途徑。關(guān)于細(xì)胞鐵死亡與胎膜早破的關(guān)系仍待進(jìn)一步深入研究。