基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討桂藥生精膠囊治療不育癥的作用機(jī)制

梁景輝， 胡恩宜， 朱 閩， 買鵬宇， 張澤朝， 葉 斌， 時(shí) 雪， 彭 杰，葉沛仁

(1.欽州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 欽州 535000；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011)

不育癥是指育齡夫婦同居1年以上，性生活規(guī)律，沒(méi)有采取任何避孕措施，由于男方原因?qū)е屡轿茨苁茉衃1]。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)育齡夫婦中不孕不育占比為15%，其中約有50%是因男性因素造成的[2]。相關(guān)研究表明少精子癥及弱精子癥是導(dǎo)致不育癥的常見(jiàn)致病因素，兩者可單獨(dú)或者合并出現(xiàn)[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)不育癥的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，臨床治療沒(méi)有特異性的藥物，主要以絨毛膜促性腺激素、抗氧化制劑、抗生素等治療為主，雖然取得一定的臨床療效，但長(zhǎng)期使用會(huì)伴隨諸多不良反應(yīng)發(fā)生[4]。

男性不育屬于中醫(yī)學(xué)“無(wú)子”“艱嗣”等范疇，中醫(yī)認(rèn)為該病以本虛標(biāo)實(shí)為病證特點(diǎn)，既有臟腑虛損之本，又有濕熱瘀滯為標(biāo)，治療上以補(bǔ)腎益精為基礎(chǔ)[5]。桂藥生精膠囊是廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院院內(nèi)制劑，由淫羊藿、菟絲子、覆盆子、金櫻子、車前子、天冬、麥冬、女貞子、枸杞子、桑椹子、黃芪、黨參、紅參、紅花、甘草15味中藥組成，具有溫腎益氣、滋腎生精的功效。臨床研究表明，桂藥生精膠囊治療不育癥的總有效率為87.50%，能有效提高精子活力、活率及頂體酶活性等[6-7]，但對(duì)其具體的作用機(jī)理尚需要進(jìn)一步的探討。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過(guò)研究藥物活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)，并在系統(tǒng)生物學(xué)理論的基礎(chǔ)上，探討藥物-作用靶點(diǎn)、疾病-治療靶點(diǎn)之間聯(lián)系的方法[8]。本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法首次對(duì)桂藥生精膠囊治療不育癥的分子機(jī)制進(jìn)行全面的解析，并根據(jù)結(jié)論采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，旨為后續(xù)不育癥的臨床治療及實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1.1 有效成分及靶點(diǎn)篩選 采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)，以口服利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，檢索桂藥生精膠囊組方藥材(淫羊藿、菟絲子、覆盆子、金櫻子、車前子、天冬、麥冬、女貞子、枸杞子、桑椹子、黃芪、黨參、紅參、紅花、甘草)有效成分，并在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取有效成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)對(duì)靶點(diǎn)信息進(jìn)行人源基因轉(zhuǎn)換。

1.1.2 疾病靶點(diǎn)篩選 以“male infertility”為關(guān)鍵詞，檢索Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)OMIM(https://omim.org/search/advanced/geneMap)中不育癥靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)基因，將所有靶點(diǎn)基因?qū)險(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)進(jìn)行人源基因轉(zhuǎn)換。

1.1.3 藥物疾病共同靶點(diǎn)基因的篩選及韋恩圖構(gòu)建 將藥物、疾病靶點(diǎn)基因?qū)隫enny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，篩選出藥物、疾病共同含有的靶點(diǎn)取交集，繪制韋恩圖。

1.1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心靶點(diǎn)篩選 將藥物-疾病的共同靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入String(https://string-db.org)在線數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定物種為“Homosapiens”，篩選置信度>0.90，獲取所有蛋白-蛋白相互作用(PPI)關(guān)系構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)可視化，并導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過(guò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析得出核心的藥物靶點(diǎn)，篩選度值(Degree)、介數(shù)中心性(Betweenness centrality)、節(jié)點(diǎn)緊密度(Closeness)同時(shí)大于中位數(shù)。

1.1.5 基因功能和生物通路富集分析 采用R語(yǔ)言軟件包，應(yīng)用Bioconductor(www.bioconductor.org/)對(duì)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，設(shè)定閾值P<0.05。GO分析包括生物過(guò)程(biological process，BP)、細(xì)胞組成(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)，KEGG分析側(cè)重于桂藥生精膠囊干預(yù)不育癥的信號(hào)通路。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 動(dòng)物 SPF級(jí)8周齡雄性SD大鼠42只，體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(桂)2019-0004。大鼠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯醫(yī)藥學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度50%～60%，分籠架式喂養(yǎng)，清潔飲水，自由攝食，1周更換2次墊料。

1.2.2 試劑、藥物與儀器 桂藥生精膠囊(批號(hào)Z01060147，廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院)。注射用環(huán)磷酰胺(批號(hào)H32020857)購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；纈沙坦膠囊(批號(hào)H20040217)購(gòu)自北京諾華制藥有限公司。兔抗人Bcl-2(批號(hào)26593-1-AP)、Bax(批號(hào)50599-2-Ig)、caspase-9(批號(hào)10380-1-AP)、caspase-3多克隆抗體(批號(hào)19677-1-AP)購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物(批號(hào)PV-6000)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。自動(dòng)組織脫水機(jī)(型號(hào)ASP300S)、一體式石蠟包埋機(jī)(型號(hào)EG1160)、轉(zhuǎn)輪切片機(jī)(型號(hào)RM2235)購(gòu)自德國(guó)Leica公司；光學(xué)顯微鏡(型號(hào)BX53F)購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2.3 分組與模型制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)抽取7只作為空白組，其余35只作為造模組，空白組腹腔注射生理鹽水，造模組腹腔注射環(huán)磷酰胺(40 mg/kg)，連續(xù)5 d[9-10]。造模成功后，將造模大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性組及桂藥生精膠囊低、中、高劑量組，每組7只。

1.2.4 干預(yù)治療 大鼠造模結(jié)束后第1天開始干預(yù)給藥，陽(yáng)性組給予纈沙坦膠囊灌胃，劑量為1.44 mg/mL(相當(dāng)于人臨床用藥劑量)；桂藥生精膠囊各劑量組給予桂藥生精膠囊灌胃，低、中、高劑量分別為28.5、57、114 mg/mL(分別相當(dāng)于人臨床每天推薦用量的0.5、1、2倍)，每天1次，每次1 mL，連續(xù)4周，每周對(duì)大鼠體質(zhì)量進(jìn)行復(fù)測(cè)，以此調(diào)整藥物劑量；空白組、模型組灌胃給予等量生理鹽水。

1.2.5 精子參數(shù)檢測(cè) 末次給藥24 h后處死大鼠，采用擴(kuò)散法對(duì)附睪內(nèi)精子進(jìn)行檢測(cè)[11]，無(wú)菌條件下摘取左側(cè)附睪，置于5 mL(37 ℃預(yù)熱)PBS緩沖液中，剪碎后在37 ℃恒溫水浴箱中孵育2 min讓精子充分游離出來(lái)，滴加到血球計(jì)數(shù)板上，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。參照世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第五版)[12]，從精子密度、運(yùn)動(dòng)精子百分率(PR+NP)、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率(PR)3個(gè)方面進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄。

1.2.6 睪丸組織病理檢測(cè) 大鼠睪丸組織于中性甲醛固定24 h后脫水，石蠟包埋、切片，脫蠟水洗，蘇木精-伊紅(HE)染色，分化，脫水透明，封片，在光鏡下觀察，每組隨機(jī)選取10個(gè)視野拍照(×200)。

1.2.7 免疫組織化學(xué)(IHC)染色法檢測(cè)核心靶點(diǎn)表達(dá) 大鼠睪丸組織切片脫蠟至水，阻斷修復(fù)，一抗孵育稀釋Bcl-2(1∶400)、Bax(1∶1 200)、caspase-9(1∶200)、caspase-3(1∶300)抗體，二抗孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片，光鏡下觀察，每組隨機(jī)選取10個(gè)視野拍照(×400)。鏡下可觀察到陽(yáng)性表達(dá)呈深褐色沉積，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，陽(yáng)性表達(dá)率=(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

2 結(jié)果

2.1 桂藥生精膠囊有效成分及靶點(diǎn)篩選 共得到264種有效成分，其中淫羊藿23種，菟絲子10種，覆盆子6種，金櫻子6種，車前子7種，天冬7種，麥冬20種，女貞子8種，枸杞子36種，桑椹子4種，黃芪17種，黨參17種，紅參3種，紅花17種，甘草83種，見(jiàn)表1。再搜集上述有效成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行人源基因轉(zhuǎn)換，去重合并后得到509個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 藥物-疾病共同靶點(diǎn) 經(jīng)去重合并后，得到疾病靶點(diǎn)4 171個(gè)，利用Venny 2.1對(duì)藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到交集靶點(diǎn)261個(gè)，見(jiàn)圖1。

表1 桂藥生精膠囊有效成分(OB值前20位)

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)與核心靶點(diǎn) 利用String數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)261個(gè)藥物-疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，見(jiàn)圖2，采用拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析得到核心靶點(diǎn)97個(gè)，包括AKT1、Bcl-2、IL-6、VEGFA、MAPK3、TNF、caspase-3、EGFR、ESR1、PTGS2、STAT3、Bax、Fos、MAPK1、CXCL8、MMP-9、IL-17A、IGF1、NOS3、caspase-9、IL-1B、STAT1、CRP、LEP、CYCS、CCL2、CD44、caspase-8、HIF-1ɑ、Fas等。

2.4 GO功能富集分析 將261個(gè)藥物-疾病交集靶點(diǎn)經(jīng)R語(yǔ)言處理后進(jìn)行GO功能富集分析，選取生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞組成(CC)、分子功能(MF)顯著性排名前10位者構(gòu)成GO富集條形圖，見(jiàn)圖3。由此可知，BP富集涉及細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)(cellular response to chemical stress)、氧化應(yīng)激反應(yīng)(response to oxidative stress)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)(response to nutrient levels)等；CC富集涉及膜筏(membrane raft)、膜微結(jié)構(gòu)域(membrane microdomaini)、膜區(qū)(membrane region)等；MF富集涉及四吡咯結(jié)合(tetrapyrrole binding)、黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合(flavin adenine dinucleotide binding)、血紅素結(jié)合(heme binding)等。

2.5 KEGG通路富集分析 將藥物-疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，共得到186條信號(hào)通路，選取顯著性前30位者構(gòu)成KEGG富集圖，見(jiàn)圖4，相關(guān)通路包括糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)、IL-17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、乙型肝炎(hepatitis B)、細(xì)胞衰老(cellular senescence)、FoxO信號(hào)通路(FoxO signaling pathway)、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、內(nèi)分泌抵抗(endocrine resistance)、癌癥中的蛋白多糖(proteoglycans in cancer)、腫瘤壞死因子信號(hào)通路(proteoglycans in cancer)等。

2.6 細(xì)胞凋亡通路 圖4顯示，細(xì)胞凋亡是桂藥生精膠囊治療不育癥顯著性最高的通路之一，從中獲取相關(guān)富集靶點(diǎn)作用機(jī)制圖，見(jiàn)圖5，發(fā)現(xiàn)可擊中24個(gè)靶點(diǎn)，包括Bcl-2、BIRC5、PARP1、caspase-3、RAF1、MAPK1、MCL1、Bax、FOS、caspase-9、caspase-8、TNF、FAS、CYCS、CHUK等。另外，桂藥生精膠囊對(duì)不育癥的治療作用可能是通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的，而Bcl-2、Bax、caspase-9、caspase-3也是拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析得到的核心靶點(diǎn)，故采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)該凋亡靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。

2.7 桂藥生精膠囊對(duì)大鼠睪丸組織Bcl-2、Bax、caspase-9、caspase-3表達(dá)的影響 圖6、表2顯示，與空白組比較，模型組Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率降低(P<0.05)，Bax、caspase-9、caspase-3陽(yáng)性表達(dá)率升高(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性組和桂藥生精膠囊各劑量組Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率升高(P<0.05)，Bax、caspase-9、caspase-3陽(yáng)性表達(dá)率降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性；與陽(yáng)性組比較，桂藥生精膠囊中、高劑量組Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率升高(P<0.05)，Bax、caspase-9、caspase-3陽(yáng)性表達(dá)率降低(P<0.05)。桂藥生精膠囊高劑量組Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.8 桂藥生精膠囊對(duì)大鼠睪丸組織形態(tài)的影響 圖7顯示，桂藥生精膠囊各劑量組大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)較模型組與陽(yáng)性組有明顯改善，生精小管形態(tài)趨向規(guī)則，基底膜增厚，纖維肌細(xì)胞與支持細(xì)胞數(shù)量分布均勻，精原細(xì)胞與精母細(xì)胞排列趨于整齊、層數(shù)增多，細(xì)胞外膜破損可見(jiàn)修復(fù)，精子細(xì)胞與精子數(shù)量增多，微血管供血改善，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少；桂藥生精膠囊高劑量組大鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯病理改變，改善程度最明顯，與空白組比較無(wú)明顯變化。

表2 各組大鼠睪丸組織Bcl-2、Bax、caspase-9、caspase-3陽(yáng)性表達(dá)率比較

2.9 桂藥生精膠囊對(duì)大鼠精子參數(shù)的影響 表3顯示，與空白組比較，模型組精子密度、精子活力降低(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性組和桂藥生精膠囊各劑量組精子密度、精子活力升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性；桂藥生精膠囊各劑量組精子密度及中、高劑量組精子活力高于陽(yáng)性組(P<0.05)；桂藥生精膠囊高劑量組精子密度與精子活力及桂藥生精膠囊中劑量組PR與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠精子參數(shù)水平比較

3 討論

本研究從桂藥生精膠囊中獲得異黃烷酮、酸漿苦素A、甘草醇等264種有效成分，大多為黃酮類、多糖類、生物堿類等化合物。有研究表明，黃酮類化合物能調(diào)控精子細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，提高性激素水平，改善機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)精子細(xì)胞獲能，提高精子活力[13]。多糖類化合物能增強(qiáng)體內(nèi)激素合成蛋白的水平，調(diào)節(jié)線粒體功能，改善睪丸微環(huán)境與炎癥細(xì)胞因子水平，提高精子的質(zhì)量[14-15]。拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析得到核心靶點(diǎn)97個(gè)，其中部分核心靶點(diǎn)已有研究證實(shí)對(duì)不育癥有調(diào)控作用。楊晶等[16]發(fā)現(xiàn)調(diào)治天癸方能上調(diào)不育癥大鼠生精細(xì)胞Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡。樊衛(wèi)民等[17]發(fā)現(xiàn)不育癥患者精漿中TNF-ɑ與IL-6水平升高，可引起精子形態(tài)和功能的改變。Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)麒麟丸可通過(guò)抑制caspase-9、caspase-3蛋白的表達(dá)，減少不育癥大鼠睪丸組織凋亡，從而改善大鼠精子質(zhì)量和睪丸損傷。Wu等[19]研究發(fā)現(xiàn)白樺酸可通過(guò)降低STAT3、JAK2、Bax表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)，修復(fù)T-毒素所致的睪丸氧化損傷。Xiao等[20]采用束縛應(yīng)激誘導(dǎo)不育癥小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠生精細(xì)胞Fas、FasL表達(dá)升高。

GO功能富集涉及的生物學(xué)過(guò)程均體現(xiàn)在藥物有效成分的發(fā)揮及靶點(diǎn)所涉及的通路中，而KEGG富集得到信號(hào)通路186條，主要涉及糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、IL-17信號(hào)通路等。AGE-RAGE信號(hào)通路可引起大量促炎細(xì)胞因子、黏附分子、生長(zhǎng)因子的表達(dá)和釋放，降低細(xì)胞增殖活性與血管通透性，最終引起慢性細(xì)胞活化和微血管病變，這可能是造成睪丸組織損傷的重要原因之一[21]。細(xì)胞凋亡是由多因子或蛋白參與的復(fù)雜的生理性死亡過(guò)程，其過(guò)度凋亡可導(dǎo)致線粒體外膜通透性改變，最終影響精子的發(fā)育與成熟[22]。IL-17信號(hào)通路可誘導(dǎo)多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，募集、活化中性粒細(xì)胞，從而造成精子DNA損傷及斷裂，影響男性的生育能力[23]。

研究表明，細(xì)胞凋亡程序在不育癥發(fā)生和進(jìn)展中起重要作用，其中Bcl-2家族與caspase家族是細(xì)胞凋亡最重要的基因家族[24-25]。Bcl-2家族中Bcl-2蛋白具有抑制多種凋亡蛋白激活、阻斷氧化破壞、抑制細(xì)胞色素表達(dá)等作用，Bax蛋白具有激活凋亡蛋白、促進(jìn)線粒體裂解等作用[26]。caspase-3蛋白是caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最終執(zhí)行因子，caspase-9蛋白可激活caspase-3引起細(xì)胞核酸斷裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[27]。在病理狀態(tài)下，Bcl-2和Bax的失衡會(huì)激活caspase-9及caspase-3蛋白，最終導(dǎo)致過(guò)度凋亡，睪丸組織毒性增強(qiáng)，導(dǎo)致精子數(shù)量減少、精子活動(dòng)力下降[28]。Salama等[29]發(fā)現(xiàn)纈沙坦能介導(dǎo)不育癥大鼠睪丸組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低對(duì)線粒體膜電位的破壞，有效改善大鼠的精子質(zhì)量、性激素水平，提高Bcl-2表達(dá)，降低Bax、caspase-3表達(dá)，通過(guò)抑制凋亡信號(hào)通路減少睪丸組織凋亡，逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺造成的睪丸毒性。纈沙坦屬于血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，對(duì)男性生育能力有正面影響[30]，因此本實(shí)驗(yàn)中采用纈沙坦膠囊作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果證實(shí)桂藥生精膠囊可參與細(xì)胞凋亡通路，上調(diào)不育癥大鼠睪丸組織Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax、caspase-9、caspase-3表達(dá)，改善睪丸病理?yè)p傷，提高大鼠精子密度與活力，結(jié)果優(yōu)于陽(yáng)性組，并且具有明顯的量效關(guān)系，這可能是桂藥生精膠囊治療不育癥的作用機(jī)制之一。

綜上所述，桂藥生精膠囊是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路共同調(diào)控來(lái)達(dá)到治療不育癥的目的。但本實(shí)驗(yàn)僅從細(xì)胞凋亡通路中核心靶點(diǎn)Bcl-2、Bax、caspase-9、caspase-3表達(dá)來(lái)驗(yàn)證桂藥生精膠囊治療不育癥的作用機(jī)制，未對(duì)細(xì)胞凋亡的其他相關(guān)靶點(diǎn)及其他信號(hào)通路進(jìn)行研究探討，因此完整的調(diào)控機(jī)制仍需今后進(jìn)一步的研究來(lái)驗(yàn)證說(shuō)明。