神仙粥的研究進(jìn)展及其抗衰老的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

王 丹， 劉永琦， 張文廣， 賈春艷， 張?jiān)弃Q， 李 蕓*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

衰老是生物體組織、器官以及細(xì)胞功能隨時(shí)間而逐漸喪失的過(guò)程[1]。截至2020年11月1日，我國(guó)60歲及以上老年人口已達(dá)到2.64億人，占總?cè)丝诘?8.7%[2]。隨著人口老齡化的加劇，衰老以及相關(guān)疾病成為研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)，中藥抗衰老研究取得了一定進(jìn)展[3]。神仙粥是敦煌遺書P.3810《呼吸靜功妙訣》后附的修煉養(yǎng)生方，現(xiàn)藏于法國(guó)巴黎國(guó)家圖書館[4]，記載：“神仙粥：山藥蒸熟，去皮，一斤，雞頭實(shí)半斤，煮熟去谷，搗為末，入粳[米]半升，慢火煮成粥，空心食之。或韮(韭)子末二、三兩在內(nèi)，尤妙，食粥后，用好熱酒飲三盃(杯)妙，此粥善補(bǔ)虛勞、益氣強(qiáng)志，壯元陽(yáng)、止泄、精神妙?！盵5]現(xiàn)代研究表明，神仙粥具有抗衰老，改善老年癡呆癥，調(diào)節(jié)免疫等作用，但目前其抗衰老機(jī)制仍未闡明。本文將從神仙粥單味藥的化學(xué)成分、復(fù)方的藥理作用和臨床應(yīng)用，以及神仙粥抗衰老的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度進(jìn)行綜述，以期為神仙粥進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

1 神仙粥各單味藥的現(xiàn)代研究

神仙粥由山藥、芡實(shí)、粳米、韭菜子組成，目前尚無(wú)關(guān)于此復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)研究報(bào)道。復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)研究，應(yīng)基于單味藥的有效成分及其活性展開(kāi)研究。

山藥為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖，其成分為多糖[6]、薯蕷皂苷元[7]、尿囊素[8]、淀粉[9]、脂肪酸[10]、蛋白質(zhì)、氨基酸[11]、山藥素類化合物[12]、微量元素[13]等。Mckoy等[14]研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元可以降低膽固醇水平(P<0.05)。平靜等[15]研究發(fā)現(xiàn)，山藥總皂苷具有清除DPPH自由基和超氧陰離子的作用。山藥多糖不僅具有調(diào)節(jié)免疫[16]、抗衰老[17]、降血糖[18]的作用，還具有調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂的作用(P<0.05)[19]。樊乃境等[20]研究發(fā)現(xiàn)，山藥蛋白肽能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用(P<0.05)，進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。山藥的活性研究多以部位為主，相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)研究薄弱，有待更多的學(xué)者深入研究。

芡實(shí)，即雞頭實(shí)，來(lái)源于睡蓮科植物芡EuryaleferoxSalisb.的干燥成熟種仁，主要包括甾醇類[21]、黃酮類[22]、環(huán)肽類[23]、腦苷脂類[24]、多酚類[25]、多糖[26]、淀粉[27]、脂肪酸[28]、氨基酸[29]、微量元素[30]等成分。芡實(shí)多糖能提高小鼠的運(yùn)動(dòng)能力和心肌的抗氧化能力(P<0.05)[31]，是一種天然的抗氧化劑，可用于食品添加劑及保健食品中[32]。目前，關(guān)于芡實(shí)的研究多集中在抗氧化方面，其中發(fā)揮抗氧化作用的成分有芡實(shí)甾醇、芡實(shí)多糖、芡實(shí)黃酮等[21,33]。

韭菜子來(lái)源于百合科植物韭菜AlliumtuberosumRottl.ex Spreng的干燥成熟種子，主要有生物堿類[34]、核苷類[35]、揮發(fā)油類[36]等成分。目前，研究者多以韭菜子水提物或醇提物進(jìn)行活性研究。郭奎彩等[37]研究發(fā)現(xiàn)，韭菜子總黃酮具有抗氧化作用。何娟等[38]研究發(fā)現(xiàn)，韭菜子醇提物可增加去勢(shì)雄性小鼠包皮腺、精液囊的質(zhì)量(P<0.05)。陶永梅等[39]研究發(fā)現(xiàn)，韭菜子水提取物具有增強(qiáng)小鼠耐缺氧及抗疲勞的作用(P<0.05)。于艷[40]研究發(fā)現(xiàn)，韭菜子水煎劑能增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能(P<0.05)，同時(shí)還通過(guò)促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化，形成更多的抗體細(xì)胞。韓晶利等[41]研究發(fā)現(xiàn)，韭菜子水煎液可降低老年小鼠肝單胺氧化酶B活性(P<0.05)，其活性與年齡呈正相關(guān)，可以作為表示生物體老化程度的標(biāo)志，提示韭菜子水煎液具有抗衰老作用。韭菜子的現(xiàn)代藥理研究雖取得不小進(jìn)展，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，藥理作用機(jī)制研究較為欠缺，有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

粳米來(lái)源于禾本科植物稻(粳稻)的種仁，現(xiàn)代研究表明，粳米中含有淀粉[42]、蛋白質(zhì)、脂肪[43]、氨基酸[44]、及微量元素[45]等成分。粳米既可以作為主食出現(xiàn)在餐桌上，也可以作為中藥出現(xiàn)在中醫(yī)臨床處方之中。

目前有關(guān)神仙粥中單味藥的現(xiàn)代研究較多，但是不能以單味藥化學(xué)成分的加和表示復(fù)方的化學(xué)成分，且在高溫煎煮的過(guò)程中，化學(xué)成分可能因高溫發(fā)生改變，也可能成分之間相互作用，使復(fù)方成分更加復(fù)雜。

2 藥理作用

2.1 抗衰老 丁高恒等[46]以D-半乳糖建立大鼠衰老模型，研究神仙粥抗衰老的作用，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的超氧化物歧化酶活性、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均低于各給藥組(P<0.05)，模型組大鼠的丙二醛水平均高于各給藥組(P<0.05)，提示神仙粥具有抗衰老作用，但目前其抗衰老機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步深入研究。

2.2 抗老年癡呆癥 老年癡呆癥早期最常見(jiàn)的表現(xiàn)為記憶力下降，同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)空間辨識(shí)能力障礙。吳建軍等[47]以D-半乳糖致衰大鼠為研究對(duì)象，通過(guò)Morris水迷宮系統(tǒng)檢測(cè)平均逃避潛伏期時(shí)間和空間探索時(shí)間以及海馬組織Bcl-2、Bax基因的表達(dá)，研究神仙粥抗老年癡呆的作用，發(fā)現(xiàn)給藥組平均逃避潛伏期時(shí)間和空間探索時(shí)間均降低(P<0.05)，高劑量組Bcl-2基因表達(dá)升高(P<0.05)，Bax基因表達(dá)降低(P<0.05)。提示神仙粥具有抗老年癡呆的作用，可通過(guò)調(diào)節(jié)海馬組織Bcl-2、Bax基因表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，從而改善阿爾茲海默病模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。目前關(guān)于此方改善老年癡呆癥的學(xué)習(xí)記憶能力的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，有待進(jìn)一步研究發(fā)掘。

2.3 調(diào)節(jié)免疫機(jī)制 賀戀詞[48]采用病證結(jié)合方法進(jìn)行造模，同時(shí)建立慢性疲勞綜合征疾病模型和脾腎陽(yáng)虛證大鼠模型，造模成功后給予不同劑量的神仙粥。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥膳神仙粥可降低慢性疲勞綜合征脾腎陽(yáng)虛證大鼠炎癥因子IL-1β、TNF-α水平，并通過(guò)阻滯NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

3 臨床應(yīng)用

3.1 緩解腰痛 朱海林等[49]報(bào)道神仙粥合針刺治療腎陽(yáng)虛型腰痛66例，結(jié)果治愈46例，好轉(zhuǎn)19例，無(wú)效1例，有效率為98.5%，提示神仙粥對(duì)腰痛有一定的緩解作用。但該臨床應(yīng)用評(píng)判較為主觀，未設(shè)理化指標(biāo)或?qū)φ战M，故不能確定改善腰痛的主要因素是針刺還是神仙粥，有待進(jìn)一步臨床研究。

3.2 緩解慢性疲勞 慢性疲勞綜合征的病機(jī)復(fù)雜，其治療以緩解癥狀為主，且多用中醫(yī)治療，如中醫(yī)食療和針灸等。葉艷[50]進(jìn)行補(bǔ)虛勞藥膳神仙粥對(duì)脾腎陽(yáng)虛證慢性疲勞綜合征患者的干預(yù)研究，選取了86例脾腎陽(yáng)虛證慢性疲勞綜合征患者作為研究對(duì)象，分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，并對(duì)最終完成研究的76例患者采用自測(cè)評(píng)價(jià)的方法分別對(duì)疲勞情況、伴隨癥狀、中醫(yī)臨床證候、負(fù)性情緒、生活質(zhì)量、安全性指標(biāo)等進(jìn)行測(cè)評(píng)，并評(píng)價(jià)其臨床療效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著服用藥膳粥周期的延長(zhǎng)，慢性疲勞綜合征患者的疲勞得到有效緩解且伴隨癥狀減少，患者的脾腎陽(yáng)虛證候、焦慮、抑郁癥狀、負(fù)性情緒得到改善，生活質(zhì)量越好。提示神仙粥對(duì)慢性疲勞有緩解作用，能改善患者的情緒與生活質(zhì)量，具有臨床推廣價(jià)值。

4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

4.1 活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索并提取神仙粥各單味藥(山藥、芡實(shí)、韭菜子、粳米)的活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)信息，以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18作為篩選條件，確定山藥、芡實(shí)、韭菜子的活性成分共22種，其中山藥16種，芡實(shí)2種，韭菜子4種。同時(shí)收集活性成分相關(guān)作用靶點(diǎn)，其中山藥145個(gè)，芡實(shí)23個(gè)，韭菜子48個(gè)。對(duì)于TCMSP中檢索不到的單味藥物粳米，通過(guò)PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索，并通過(guò)ChemDraw軟件繪制活性成分結(jié)構(gòu)圖。在SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swissadme.ch/)中預(yù)測(cè)相應(yīng)結(jié)構(gòu)的ADME參數(shù)，以藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)胃腸吸收度為“high”和DL滿足3項(xiàng)“Yes”為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出1種活性成分，使之與上述TCMSP的篩選條件統(tǒng)一，再利用SwissTargetPrediction查找，得到15個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)將得到的所有靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)化為正式基因名稱。合并所有活性成分及靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)后，神仙粥活性成分可能作用的靶點(diǎn)為103個(gè)。神仙粥潛在活性成分見(jiàn)表1。

4.2 衰老靶點(diǎn)的獲取及藥物-疾病交集靶點(diǎn)分析 在Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)，以“aging”為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)靶點(diǎn)。將檢索結(jié)果按Score值大于等于平均數(shù)的原則進(jìn)行篩選，得到衰老的相關(guān)靶點(diǎn)856個(gè)。運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將得到的疾病靶點(diǎn)名稱標(biāo)準(zhǔn)化。將上述預(yù)測(cè)的神仙粥作用靶點(diǎn)103個(gè)與疾病靶點(diǎn)856個(gè)取交集，得到神仙粥抗衰老的潛在作用靶點(diǎn)共45個(gè)，使用Venny 2.1在線工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)繪制韋恩圖，見(jiàn)圖1。

表1 神仙粥活性成分

4.3 蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將神仙粥抗衰老的45個(gè)靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.7.0軟件處理數(shù)據(jù)，再利用內(nèi)置Network Analysis分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，根據(jù)度值調(diào)整節(jié)點(diǎn)顏色、大小，圖形越大、顏色越深，則degree值越大。從蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中可以發(fā)現(xiàn)Akt-1、CASP3、JUN、TP53等節(jié)點(diǎn)度值較高，將排名前十的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。核心靶點(diǎn)的基本信息見(jiàn)表2。

4.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析 通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)神仙粥抗衰老的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論(gene ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，設(shè)置物種為人，實(shí)現(xiàn)GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

GO分析結(jié)果均保留P<0.05的結(jié)果，得到GO條目244條，包括生物過(guò)程(biological process，BP)168條，細(xì)胞組成(cellular component，CC)22條，分子功能(molecular function，MF)54條，生物過(guò)程中排名靠前的有雌二醇反應(yīng)、藥物反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、老化、神經(jīng)元凋亡過(guò)程的正調(diào)控等；細(xì)胞組成分析中靠前的主要是細(xì)胞溶質(zhì)、空泡、蛋白質(zhì)復(fù)合體、細(xì)胞外空隙、核質(zhì)等；分子功能分析靠前的主要是酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚活性、類固醇激素受體活性、類固醇結(jié)合等。利用微生信網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn/)根據(jù)P值分別列出排名前10的條目，見(jiàn)圖3。

表2 藥物-疾病核心靶點(diǎn)基因

KEGG富集分析得到58條通路(P<0.05)，利用微生信網(wǎng)站對(duì)前30條通路進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖4。KEGG通路富集分析比較靠前的主要是癌癥通路、大腸癌、甲狀腺激素信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、HIF-1信號(hào)通路、癌癥中的蛋白多糖、PI3K-Akt信號(hào)通路、小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、乙型肝炎等。

4.5 構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò) 將核心靶點(diǎn)及關(guān)鍵化合物(核心靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的化合物為關(guān)鍵化合物)，并結(jié)合“4.4”項(xiàng)下KEGG通路富集分析結(jié)果，選取排名30的條目，通過(guò)Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建神仙粥“關(guān)鍵化合物-核心靶點(diǎn)-重要通路”網(wǎng)絡(luò)，呈現(xiàn)神仙粥抗衰老的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，見(jiàn)圖5。圖中紅色為關(guān)鍵化合物，綠色為核心靶點(diǎn)，藍(lán)色為重要通路。

5 討論

本文對(duì)神仙粥的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，發(fā)現(xiàn)神仙粥的藥理研究和臨床應(yīng)用多集中于調(diào)節(jié)免疫、緩解慢性疲勞等方面，同時(shí)具有抗衰老作用，但抗衰老機(jī)制尚不明確。因此，本研究進(jìn)一步運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究其抗衰老的作用機(jī)制。

研究結(jié)果顯示，蓽茇明寧堿、薯蕷皂苷元等5種化學(xué)成分匹配到較多的抗衰老靶點(diǎn)，是神仙粥抗衰老的核心成分，這與目前有關(guān)研究結(jié)果一致。蓽茇明寧堿具有抗衰老作用，可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)殺死衰老細(xì)胞，還可以通過(guò)氧化應(yīng)激殺死癌細(xì)胞[51]。薯蕷皂苷元水平與其增強(qiáng)記憶作用有關(guān)[52]，薯蕷皂苷元還通過(guò)升高TP53、Bax、CASP3蛋白表達(dá)，降低Bcl-2蛋白表達(dá)起到抗癌活性[53]。

在作用機(jī)制分析過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，NOS3、PTGS2、ESR1、Akt-1、VEGFA、TP53、CASP3、CTNNB1、MYC等10個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮核心作用，主要與癌癥相關(guān)，而衰老往往伴隨著免疫功能的生理性衰退，當(dāng)免疫功能的生理性衰退變?yōu)椴±硇运ネ?，容易產(chǎn)生病原微生物感染、自身免疫性疾病以及惡性腫瘤的發(fā)生[54-55]，提示衰老與腫瘤密切相關(guān)。NOS3可以催化生成一氧化氮[56]，而一氧化氮的減少可能導(dǎo)致中風(fēng)癡呆[57]，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。PTGS有2種同工酶，分別為組成型PTGS1和誘導(dǎo)型PTGS2，PTGS2通常會(huì)產(chǎn)生前列腺素，介導(dǎo)對(duì)生理壓力(如感染、炎癥)的反應(yīng)，PTGS2可能通過(guò)參與花生四烯酸代謝而進(jìn)一步影響阿爾茲海默病的發(fā)病機(jī)制[58-59]，但目前仍未證實(shí)。癌蛋白c-Myc是一種主轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)大量參與細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞代謝的基因表達(dá)[60]。ESR1可作為關(guān)鍵因子進(jìn)一步導(dǎo)致致癌基因c-Myc的表達(dá)，生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子或激素通過(guò)此通路，介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化[61]。Akt-1調(diào)控細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，參與包括細(xì)胞凋亡和葡萄糖代謝在內(nèi)的細(xì)胞過(guò)程，有研究發(fā)現(xiàn)在人類乳腺癌[62]、前列腺癌[63]和卵巢癌[64]中均有Akt-1的突變，故將Akt-1與癌癥的發(fā)生關(guān)聯(lián)起來(lái)。靶向VEGFA通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)MAPK/ERK與PI3K/Akt信號(hào)通路抑制結(jié)直腸癌中的血管生成[65]。TP53基因是人體內(nèi)重要的抑癌基因，其編碼的p53蛋白的表達(dá)可以促進(jìn)DNA修復(fù)、細(xì)胞周期停頓或凋亡，從而防止細(xì)胞癌變。TP53基因突變或野生型p53蛋白的失活往往導(dǎo)致癌癥發(fā)生[66-67]。不同的染色質(zhì)狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控與TP53和CTNNB1的突變狀態(tài)有關(guān)，表明這些基因可能在癌變過(guò)程中誘導(dǎo)不同的細(xì)胞通路，涉及不同的染色質(zhì)環(huán)境[68]。Jun蛋白對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、蛋白合成、細(xì)胞代謝至關(guān)重要，在抗細(xì)胞凋亡中起調(diào)節(jié)作用[69]。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度闡釋了神仙粥是通過(guò)多成分-多通路-多靶點(diǎn)的協(xié)同作用以達(dá)到抗衰老的機(jī)制，為后續(xù)神仙粥抗衰老的物質(zhì)基礎(chǔ)以及作用機(jī)制研究提供了線索與思路。