涼粉草多糖提取、結(jié)構(gòu)特征和生物活性研究

董 偉 馬生健 郭俊先 羅 皓 陶美華

(1. 嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048；2. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)機電工程學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

涼粉草(MesonachinensisBenth.，MCB)又名仙草、仙人草、草馃、鮮草等[1]，系唇形科涼粉草屬一年生草本宿根型植物[2]。涼粉草具有清暑解渴、解毒利尿的功效，民間常用作夏天清涼飲料，富含多糖、酚類、黃酮等活性成分[3-7]。

涼粉草多糖(Mesonachinensispolysaccharide，MCP)具有抗氧化、抗糖尿病、免疫調(diào)節(jié)等功效，還有良好的熱穩(wěn)性和促凝性，在食品和制藥工業(yè)中常被用作增稠劑、穩(wěn)定劑、凝膠劑[8-9]。目前，提取多糖的方法主要有水提法、堿提法、微波提取和酶提取法等，但操作時間長、成本高、投入大。堿提醇沉法具有提取時間短、成本低、易操作等優(yōu)點，常被用來提取植物多糖。研究擬以新鮮涼粉草為材料，采用響應(yīng)面優(yōu)化堿提醇沉法提取多糖，并探究多糖的結(jié)構(gòu)特征及生物活性，為涼粉草多糖的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

涼粉草：匍匐型，經(jīng)嶺南師范學(xué)院陳燕教授鑒定，其種苗繁殖技術(shù)由廣東省熱帶植物工程技術(shù)開發(fā)中心建立，種植于嶺南師范學(xué)院科研試驗基地；

鐵氰化鉀、碳酸氫鈉：分析純，天津科密歐試劑有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、牛血清蛋白：分析純，福州飛凈生物科技有限公司；

考馬斯亮藍(lán)G-250、苯酚、三氯化鐵：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

抗壞血酸(VC)：分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；

氯化鈉、無水乙醇、濃硫酸、三氯乙酸等：分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

電磁爐：GLMS9300A型，廣州紅三角電器實業(yè)有限公司；

電子分析天平：FA2204型，寧波市鄞州華豐電子儀器廠；

多功能商用豆?jié){機：FY-1055，中山市巴博莎電器有限公司；

高速冷凍離心機：SORVALL RC6 plus型，德國赫默公司；

電熱恒溫干燥箱：DHG-9037A型，上海躍進醫(yī)療器械廠；

同步熱分析儀：STA 6000型，美國PerkinElmer公司；

紫外可見分光光度計：UV-8453型，美國Agilent公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：Nicolet 6700型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

掃描電子顯微鏡：VEGA3 SBH型；荷蘭PHILIPS公司；

X射線衍射儀：X’pert Pro MPD型，荷蘭PANalytical公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 涼粉草多糖提取流程

新鮮涼粉草樣品→洗凈備用→熱水堿提→離心→醇沉→離心→干燥→涼粉草粗多糖

1.3.2 多糖提取率測定 采用苯酚—硫酸法，并按式(1)計算多糖提取率。

R=(c×V)/m×100%，

(1)

式中：

c——涼粉草多糖溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——多糖溶液體積，mL；

m——涼粉草樣品的質(zhì)量，mg。

1.3.3 涼粉草多糖提取單因素試驗

(1) 碳酸氫鈉添加量：稱取新鮮涼粉草100 g，熱浸時間10 min，料液比1∶5 (g/mL)，考察碳酸氫鈉添加量(0.0%，0.4%，0.8%，1.2%，1.6%，2%，2.4%)對多糖提取率的影響。

(2) 熱浸時間：稱取新鮮涼粉草100 g，料液比1∶5 (g/mL)，碳酸氫鈉添加量1.6%，考察熱浸時間(0，5，10，15，20 min)對多糖提取率的影響。

(3) 料液比：稱取新鮮涼粉草100 g，熱浸時間10 min，碳酸氫鈉添加量1.6%，考察料液比[1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7 (g/mL)]對多糖提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗 根據(jù)響應(yīng)面中心復(fù)合設(shè)計原則，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用Box-Benhnken中心組合設(shè)計，進行三因素三水平試驗，考察料液比、熱浸時間和碳酸氫鈉添加量對多糖提取的影響，優(yōu)化提取工藝。

1.3.5 涼粉草多糖分離純化 將最優(yōu)條件獲得的粗多糖溶液加入等體積三氯乙酸去除蛋白質(zhì)，透析去除小分子雜質(zhì)，蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥備用。

1.3.6 指標(biāo)測定

(1) 多糖含量：采用苯酚硫酸法[10]，回歸方程y=0.009 9x-0.021 4，R2=0.991 9。

(2) 蛋白質(zhì)含量：采用考馬斯亮藍(lán)法[11]，回歸方程y=0.004x-0.006 7，R2=0.993 9。

(3) 糖醛酸含量：采用硫酸—咔唑法[12]，回歸方程y=0.051 9x+0.003 2，R2=0.992 7。

1.3.7 熱特性測定 稱取6 mg干燥的涼粉草多糖，利用熱重分析儀對多糖樣品進行分析，掃描溫度30～600 ℃，加熱速率10 ℃/min。

1.3.8 光譜測定

(1) 紫外光譜測定：將多糖溶液配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL，采用紫外—分光光度計于200～600 nm進行測定。

(2) 紅外光譜測定：稱取干燥后的多糖樣品1～2 mg，與30～60 mg溴化鉀于研缽中磨碎，壓成透明薄片，測定范圍400～4 000 cm-1。

1.3.9 X射線衍射 電壓40 kV，電流40 mA，2θ范圍下8°～35°內(nèi)進行掃描，以觀察多糖顆粒的晶型結(jié)構(gòu)。

1.3.10 體外抗氧化活性測定

(1) DPPH自由基清除率:根據(jù)文獻(xiàn)[13]并修改，配制0.2 mmoL DPPH，以VC為陽性對照。取DPPH溶液2 mL 和不同質(zhì)量濃度(0.025～0.175 mg/mL)多糖樣品2 mL 為樣品組，避光放置30 min，測定517 nm處吸光度，并按式(2)計算DPPH自由基清除率。

(2)

式中：

A——自由基清除率，%；

Ai——樣品組吸光值；

Aj——樣品干擾試驗的液吸光值；

A0——對照組吸光值。

(2) ABTS自由基清除率：根據(jù)文獻(xiàn)[14]并修改，配制ABTS溶液，避光反應(yīng)8 h，以VC為陽性對照。取2 mL 不同質(zhì)量濃度(0.025～0.200 mg/mL)多糖樣品，加入4 mL ABTS溶液搖勻放置10 min，測定734 nm處吸光度，并按式(2)計算ABTS自由基清除率。

(3) 還原力：根據(jù)文獻(xiàn)[15]并修改，配制不同質(zhì)量濃度(0.25～4.00 mg/mL)多糖溶液，以VC為陽性對照，取1 mL 樣品，加入磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)和2.5 mL 0.1%鐵氰化鉀溶液，搖勻，50 ℃水浴20 min，迅速冷卻，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液、2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，測定700 nm處吸光值，并按式(3)計算還原力。

R=Ai-Aj，

(3)

式中：

R——還原力；

Ai——樣品吸光值；

Aj——多糖溶液吸光值。

1.3.11 涼粉草多糖抑菌活性

(1) 菌種活化及菌懸液的制備：將菌種接種至酵母膏蛋白胨(LB)培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)接1～2次。用細(xì)牙簽挑取少量菌種，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。測定600 nm處各菌懸液的OD值，以無菌水作對照。

(2) 抑菌圈直徑(inhibitory zone diameter，DIZ)的測定：參照Sun等[16]的方法。

(3) 提取液對菌生長變化的影響：參考范明智等[17]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin Pro 2018軟件進行數(shù)據(jù)分析和作圖，Design-Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

MCP為可溶性酸性多糖，易溶于堿性溶液。由圖1(a) 可知，當(dāng)碳酸氫鈉添加量為0.0%～1.6%時，多糖提取率隨碳酸氫鈉添加量的增大而迅速增長，當(dāng)碳酸氫鈉添加量為1.6%時達(dá)最大(7.52%)，隨著碳酸氫鈉添加量的加大，多糖提取率下降，是因為涼粉草多糖結(jié)構(gòu)被破壞，且堿濃度過高會導(dǎo)致MCP在食品中應(yīng)用時產(chǎn)生不良風(fēng)味[18]，因此選取1.6%為碳酸氫鈉的最適提取添加量。

由圖1(b)可知，當(dāng)熱浸時間為0～10 min時，多糖得率隨熱浸時間的延長而增大，10 min時達(dá)最大值。繼續(xù)延長熱浸時間，多糖得率反而下降，是因為前期涼粉草細(xì)胞受熱破碎，多糖溶出、得率增大，隨著熱浸時間的延長，高溫破壞了多糖結(jié)構(gòu)導(dǎo)致多糖被降解[19]。因此選取10 min 為最適熱浸時間。

由圖1(c)可知，當(dāng)料液比為1∶3～1∶4 (g/mL)時多糖含量較低，此時溶劑較小，多糖未能充分溶解。當(dāng)料液比為1∶5 (g/mL)時，涼粉草與溶劑反應(yīng)充分，多糖含量最高。當(dāng)料液比>1∶5 (g/mL)時，其他水溶性組分與多糖展開競爭，致使多糖溶出率下降。

圖1 各因素對涼粉草多糖提取率的影響Figure 1 Effect of various factors on the exlraction yield of MCP

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計表

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化涼粉草多糖提取工藝

2.2.1 模型建立及顯著性檢驗 采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進行多元二次回歸分析及方差分析，響應(yīng)面試驗因素水平見表1，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析見表3。多糖提取率的二次多項回歸方程為：

Y=7.49+0.36A+0.31B+0.17C-0.13AB-0.23AC+0.10BC-1.06A2-1.22B2-0.17C2。

(4)

由F值可知，影響涼粉草多糖提取率的主次因素為A(碳酸氫鈉添加量)>B(熱浸時間)>C(料液比)。

2.2.2 各因素交互影響 由圖2(a)和圖2(b)可知，碳酸氫鈉添加量方向曲面波動幅度較大，表明該因素對多糖提取率的影響較熱浸時間影響顯著。由圖2(c)和圖2(d)可知，料液比與熱浸時間的交互作用對多糖提取率的影響呈馬鞍狀分布，當(dāng)料液比一定時，隨著熱浸時間的增加多糖提取率先增加后小幅減??；當(dāng)熱浸時間不變時，隨著料液比的增加，多糖提取率也先增加后小幅減小，但從等高線分布來看，BC的交互作用最弱。由圖2(e)和圖2(f)可知，多糖提取率隨著碳酸氫鈉添加量和料液比的增加先增加后減小，且在碳酸氫鈉添加量方向影響較大，說明碳酸氫鈉添加量是涼粉草多糖提取率的敏感影響因子。

2.2.3 提取工藝的驗證 通過Design-Expert 8.0.6軟件得出模型最優(yōu)提取條件為碳酸氫鈉添加量1.64%，熱浸時間10.71 min，料液比1∶5.47 (g/mL)，預(yù)測涼粉草多糖最大提取率為(7.57±0.63)%。為檢驗結(jié)果的可靠性，進行3次平行實驗，實測涼粉草多糖提取率為(7.73±0.17)%，與預(yù)測值接近，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化多糖提取工藝具有一定的可行性。

表2 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果

2.3 涼粉草多糖成分分析

經(jīng)測定，涼粉草多糖總糖含量為109.51 μg/mL，蛋白質(zhì)含量為85.521 μg/mL，糖醛酸含量為176.33 μg/mL。

2.4 熱特性分析

由圖3可知，MCP熱分解的第一階段主要集中在27～167 ℃，此階段質(zhì)量損失0.87 mg，是多糖中的游離水、結(jié)合水和受熱易分解的化合物造成的。第二階段集中在176～600 ℃，多糖在167 ℃處出現(xiàn)分解，該階段的質(zhì)量損失為2.87 mg，最終殘留質(zhì)量為1.26 mg,此階段多糖因高溫導(dǎo)致化學(xué)鍵被破壞而分解[20]。該結(jié)果與肖月歡[21]測得的兩種MCP的試驗結(jié)果一致。在所選溫度范圍內(nèi)，MCP并未因高溫被完全分解，其最終殘留質(zhì)量為1.26 mg，表明MCP具有較好的熱穩(wěn)定性。

表3 響應(yīng)面方差分析表?

圖2 各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Figure 2 Response surface diagram and contour diagram of the interaction of various factors

2.5 光譜特性分析

2.5.1 紫外光譜分析 由圖4可知，206～280 nm處有吸收峰，證明有多糖大分子存在，280 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，說明得到的涼粉草多糖存在蛋白質(zhì)、肽等化合物，可能為糖蛋白，與2.3測定的蛋白質(zhì)結(jié)果吻合。

圖3 多糖的殘留質(zhì)量變化曲線以及DTG曲線Figure 3 The residual mass change curves and DTG curves of MCP

圖4 涼粉草多糖的紫外掃描圖譜Figure 4 Ultraviolet scanning spectrum of MCP

2.5.2 傅里葉紅外變換光譜分析 由圖5可知，多糖紅外光譜共性特征明顯，3 401.80 cm-1處出現(xiàn)O—H伸縮振動吸收峰，2 037.10 cm-1處有一個較弱的C—H伸縮振動峰，通過這兩個特征吸收峰，可判斷受試物為糖類化合物[22]。1 619.93 cm-1處出現(xiàn)一個吸收峰，對應(yīng)為羧基的非對稱伸縮振動引起的吸收峰，表明多糖含有糖醛酸[23]。1 508.15 cm-1處吸收峰歸屬多糖苯環(huán)骨架的伸縮振動，1 095.90～1 018.00 cm-1處特征吸收峰為C—O和C—O—C的伸縮振動，為吡喃糖的特征吸收峰[18]。1 415.51，1 268.74 cm-1處吸收峰由醇類物質(zhì)引起，為C—H的變角振動。887.00 cm-1處吸收峰說明其可能含有β-糖苷鍵，632.29 cm-1處吸收峰應(yīng)為醇類含羥基和苯環(huán)變形角振動與變形振動[24]。綜上，涼粉草多糖是一種具有β-糖苷鍵的吡喃糖型結(jié)構(gòu)的酸性多糖。

2.6 X射線衍射

由圖6可知，在2θ為8°～35°時，該衍射峰無明顯吸收峰，表明涼粉草多糖以非晶形式存在，且X衍射曲線呈光束狀[21]。

圖6 多糖X射線衍射圖Figure 6 X-ray diffraction spectra of MCP

2.7 SEM分析

由圖7可知，涼粉草多糖表面疏松且有很多密集氣孔，呈雪花狀，層層疊起，還有很多細(xì)小顆粒附在片狀物質(zhì)表面，使多糖呈現(xiàn)較為蓬松質(zhì)輕的形態(tài)。

圖7 多糖的SEM圖Figure 7 SEM image of MCP

2.8 抗氧化試驗

由圖8(a)可知，涼粉草多糖對DPPH自由基清除率隨質(zhì)量濃度的升高而升高，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0.175 mg/mL時，其對DPPH自由基清除率達(dá)66.35%。林麗華[18]研究發(fā)現(xiàn)，1.6 mg/mL的涼粉草多糖對DPPH自由基清除率為55.59%；宋曉娟等[25]發(fā)現(xiàn)涼粉草多糖對DPPH自由基清除率的IC50值為19.13 μg/mL。綜上，新鮮涼粉草多糖具有良好的DPPH自由基清除能力。

由圖8(b)可知，隨著質(zhì)量濃度的升高，涼粉草多糖對ABTS自由基的清除率升高，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0.175 mg/mL 時，其對ABTS自由基的清除率高達(dá)79.63%。曹媛媛等[26]研究發(fā)現(xiàn)，添加4%涼粉草提取物時，其對ABTS自由基清除率為67%；宋曉娟等[25]研究發(fā)現(xiàn)，涼粉草提取物在所選濃度范圍內(nèi)，對ABTS自由基清除率的IC50值為18.20 μg/mL。因此，新鮮涼粉草多糖具有良好的ABTS自由基清除能力。

由圖8(c)可知，在0～4 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，吸光度變大，還原能力增大,當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為4 mg/mL時,其吸光度可達(dá)1.431，高于林大成等[27]的結(jié)果，說明涼粉草多糖的還原能力接近VC，具有一定的還原能力。

圖8 涼粉草多糖的體外抗氧化活性Figure 8 In vitro antioxidant results of MCP

2.9 抑菌活性

2.9.1 涼粉草多糖提取液抑菌活性及DIZ分析 抑菌圈直徑可以反映菌種對多糖的敏感性，直徑>20 mm為高度敏感，14～20 mm為中度敏感，<8 mm為不敏感[28]。由圖9可知，1，2 g/mL提取物對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為(8.93±0.01)，(10.24±0.02) mm，對大腸桿菌的抑菌圈直徑為(7.84±0.02) mm，表明提取物對枯草芽孢桿菌的抑制作用最強。

圖9 涼粉草多糖的抗菌圖譜Figure 9 Antibacterial spectrum of MCP

2.9.2 涼粉草多糖對枯草芽孢桿菌生長的影響 由圖10可知，以蒸餾水為對照，枯草芽孢桿菌的生長速率在選定范圍內(nèi)呈線性增加，而添加MCP后，枯草芽孢桿菌生長速率明顯被抑制，與多糖對枯草芽孢桿菌敏感性試驗結(jié)果一致，說明MCP具有一定的抑菌作用。

圖10 涼粉草多糖對枯草芽孢桿菌生長的影響Figure 10 Effects of MCP on the growth of bacillus subtilis

3 結(jié)論

采用堿提醇沉法，結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化了新鮮涼粉草的提取工藝。結(jié)果表明，涼粉草多糖最優(yōu)提取條件為碳酸氫鈉添加量1.64%，熱浸時間10.71 min，料液比1∶5.47 (g/mL)，此時涼粉草多糖提取率為(7.73±0.17)%。光譜分析結(jié)果顯示，涼粉草多糖為酸性多糖，且具有β-糖苷鍵的吡喃糖型結(jié)構(gòu)；X衍射圖譜顯示多糖曲線呈光束狀，以非晶體形式存在；SEM結(jié)果顯示，多糖表面形貌為淺蓬松狀。體外抗氧化活性結(jié)果表明，多糖對DPPH自由基、ABTS自由基清除率分別高達(dá)66.35%，79.63%，具有較強的抗氧化活性。抑菌試驗表明，涼粉草多糖能有效抑制枯草芽孢桿菌的生長，但抑菌機理還有待探究。