輻照對紅景天提取物活性成分及降血糖作用的影響

曲 孟 常艷秋 齊 欣 崔承弼,

(1. 延邊大學農學院，吉林 延吉 133002；2. 延邊大學藥學院，吉林 延吉 133002)

糖尿病已經成為了世界范圍內威脅人類健康的主要慢性病之一[1]，其中1型糖尿病多發(fā)于兒童和青少年[2]，發(fā)病原因主要是機體內胰島β細胞受損，喪失合成胰島素的功能，最終引發(fā)糖代謝紊亂，使血糖水平居高不下[3]。糖尿病患者需終身注射(服用)胰島素藥物并面對因此帶來的不良反應[4]。

紅景天(RhodiolaroseaL.)系景天科多年生草本或亞灌木植物[5]，從紅景天根部提取出的活性物質主要成分為紅景天苷、酪醇、絡塞維、槲皮素、肉桂醇、多糖等，其中紅景天苷和酪醇是紅景天質量的評價指標，而絡塞維是紅景天的特有成分[6]。紅景天的活性成分具有抗炎[7]、肝保護[8]、抗氧化[9]、抗疲勞[10]、抗衰老[11]等功效。有研究[12]表明，紅景天中的活性成分紅景天苷可通過抑制炎癥發(fā)揮保護β細胞，改善胰島素抵抗作用從而達到降低血糖的目的。還有研究[13]表明，紅景天通過調節(jié)相關抗氧化酶的活性進而改善糖尿病模型動物氧化應激狀態(tài)，從而達到抗糖尿病的作用。

食品輻照技術是一項安全、無污染對食品品質風味影響小的食品保藏技術[14]。其中60Co-γ射線輻照滅菌法近年來在中藥滅菌中得到越來越廣泛的應用[15]。有研究[16]發(fā)現(xiàn)，輻照能使提取物活性成分發(fā)生變化，如輻照處理能提升人參皂苷的含量，增加其活性，包括腫瘤抑制、抗轉移、抗癌、保肝、神經保護和免疫刺激活動。但目前尚無輻照處理紅景天提取物的降血糖方面的研究。

研究擬采用不同輻照劑量60Co-γ射線對紅景天進行輻照處理，通過HPLC分析輻照前(0 kGy)后RRE化合物并對1型糖尿病小鼠進行體內試驗，研究其降血糖作用及對相關指標的變化，以期為輻照紅景天提取物在降血糖作用上的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料和試劑

高山紅景天：由長白山科學研究院提供，并于四川省原子能研究院進行輻照處理；

無水乙醇：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

紅景天苷標準品、酪醇標準品、絡塞維標準品：色譜級(≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；

甲醇、乙腈、2-丙醇：色譜級(≥99.9%)，北京經科宏達生物技術有限公司；

鏈脲佐菌素(STZ)：純度≥98%，美國Sigma公司；

鹽酸二甲雙胍緩釋片：0.5 g/片，天方藥業(yè)有限公司；

葡萄糖：藥用級，濰坊盛泰藥業(yè)有限公司；

總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、糖化血紅蛋白(GHb)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.2 主要儀器設備

電熱恒溫水浴鍋：HWS-24型，上海百典儀器設備有限公司；

電子分析天平：JJ-BC型，生工生物工程(上海)股份有限公司；

醫(yī)用離心機：TDZ5-WS型，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；

冷凝器：CCA-1111-CE型，東京理化器械株式會社；

水浴鍋：OSB-2100-CE型，東京理化器械株式會社；

旋蒸支架：N-1110型，東京理化器械株式會社；

真空泵：DTC-22B型，日本Uluac Kiko公司；

冷凍干燥機：LyoQuest-85實驗型，西班牙Telstar集團；

高效液相色譜儀：安捷倫1290+型，美國安捷倫科技有限公司；

多功能熒光酶標儀：SP-Max3500FL型，上海閃譜生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紅景天的輻照處理 將高山紅景天根送于四川省原子能研究院，以60Co-γ射線作為輻射源，依次按照0，5，10，20，30 kGy的輻照劑量進行處理。

1.2.2 輻照紅景天提取物的制備 紅景天粉碎處理后，過60目篩，用70%乙醇按照m紅景天粉∶V乙醇=1∶10 (g/mL)的料液比在80 ℃水浴中浸提1 h后，3 000 r/min 離心20 min，匯集上清液，沉淀物按照上述條件再次提取，共提取3次，將其蒸發(fā)濃縮后放入-80 ℃冰箱中冷凍12～24 h后，冷凍干燥24 h后研磨成粉末，常溫下密封保存，以備后續(xù)試驗使用。

1.2.3 提取物活性成分 采用高效液相色譜法(HPLC)。稱量不同輻照劑量RRE粉末50 mg，用甲醇定容，體積為5 mL，配制成10 mg/mL的溶液，裝入1.5 mL進樣瓶中前用0.45 μm濾膜過濾。以C18色譜柱為固定相，柱溫40 ℃，進樣體積10 μL，流動相恒定流量1.0 mL/min，流動相A為水，流動相B為乙腈，將A、B兩個流動相按照設定體積比梯度洗脫，開始時V流動相A∶V流動相B為95∶5，25 min時V流動相A∶V流動相B為85∶15，50 min時V流動相A∶V流動相B為78∶22，紅景天苷和酪醇在275 nm的紫外波長下進行檢測，絡塞維在254 nm的紫外波長下進行檢測[17]。

1.2.4 1型糖尿病動物模型的建立及分組 將7周齡體重為18～22 g的C57BL/6雄性小鼠50只按照每組6只的數(shù)量隨機分成8組，分別記為正常組、模型組、陽性對照組(陽性組)、0 kGy組、5 kGy組、10 kGy組、20 kGy組、30 kGy組，稱重，并于延邊大學食品研究中心動物室喂養(yǎng)，喂養(yǎng)條件為室內濕度(55±5)%，室溫(24±1) ℃，對小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，稱重，正常飲水但禁食6 h(8:00—14:00)，測定空腹血糖水平并記錄。隔天所有小鼠禁食不禁水12 h，注射STZ，劑量為50 mg/kg。注射結束1 h后對所有小鼠恢復飲食，并于20:00繼續(xù)禁食，接連5 d 腹腔注射STZ來建立1型糖尿病模型。造模的小鼠全部進行1周的正常喂養(yǎng)后，正常飲水但禁食6 h后進行空腹血糖值的測定，數(shù)值>11.1 mmol/L即認定建模成功[18]，將建模不成功的剔除。

1.2.5 動物試驗流程 成功造模后，按照表1每天對小鼠進行灌胃給藥，試驗期間每周固定時間測定空腹血糖值，灌胃6周后，最后1 d測定小鼠的空腹血糖值，以及口服葡萄糖耐量試驗，于21:00到次日9:00禁食。禁食結束后，先眼球取血后把血液放于1.5 mL EP管中，之后將其脫頸處死，解剖，取心、肝、脾、腎4個臟器，處理后稱重并記錄。在4 000 r/min 的轉速下離心5 min后取上清液，以備后續(xù)使用。

1.2.6 小鼠體重、攝食量、飲水量及臟器系數(shù)測定 小鼠適應環(huán)境喂養(yǎng)1周后，記錄體重、飲水量以及飼料使用量，造模成功后，再次測量體重并記錄，進行灌胃之后，每隔1 d測量體重并記錄，小鼠處死前最后一次稱重并記錄，解剖，將心、肝、脾、腎4個臟器取出后測量其重量并記錄、計算各臟器系數(shù)。

1.2.7 小鼠空腹血糖值測定 測定時，將小鼠尾尖剪開后擦掉第1滴血用第2滴血進行測定，測定后用75%酒精處理尾部傷口來達到消毒的目的，并將小鼠放回原籠。

表1 不同輻照劑量RRE降血糖作用動物試驗分組

1.2.8 口服葡萄糖耐量試驗 在為期6周的灌胃后，首先測定所有小鼠的空腹血糖，然后經口灌胃質量分數(shù)為40%的葡萄糖溶液，分別在灌胃葡萄糖溶液后的0.0，0.5，1.0，1.5，2.0 h時測定小鼠血糖水平。

1.2.9 小鼠血液TC、TG、GHb、MDA、CAT、SOD水平測定 將解剖后存放的血清按照試劑盒說明書進行操作。

2 結果與分析

2.1 輻照紅景天提取物得率

輻照劑量分別為0 kGy組、5 kGy組、10 kGy組、20 kGy 組和30 kGy組時輻照紅景天提取物得率分別為31.33%，31.32%，31.31%，31.31%，31.33%，各輻照劑量下用70%乙醇提取紅景天得到的提取物的得率之間無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 輻照對RRE中主要活性成分的影響

圖1和圖2分別為275 nm和254 nm紫外波長下紅景天標準品和RRE的HPLC圖譜。由圖2可知，在60Co-γ射線輻照處理后，RRE的活性成分發(fā)生了變化。由表2可知，與未輻照RRE相比，輻照處理后紅景天苷的含量顯著減少(P<0.05)；在5，10，30 kGy處理的樣品中未檢測出酪醇，在20 kGy處理的樣品中檢測出酪醇；樣品經5，10，20 kGy處理時絡塞維的含量顯著提高(P<0.05)；經20 kGy處理時紅景天苷、酪醇以及絡塞維三者含量之和顯著高于其他輻照劑量處理的(P<0.05)。推測可能因為其他化合物在20 kGy時轉化合成為酪醇，所以在20 kGy 處理的樣品中檢測到酪醇。其次紅景天苷、酪醇和絡塞維可能對20 kGy的輻照劑量較敏感，所以成分含量之和顯著高于其他輻照劑量組。

圖1 275 nm和254 nm波長下紅景天標準品的HPLC圖譜Figure 1 HPLC chromatogram of Rhodiola rosea standards at 275 nm and 254 nm

圖2 275 nm和254 nm波長下RRE的HPLC圖譜Figure 2 HPLC chromatogram of RRE at 275 nm and 254 nm

表2 輻照前后RRE中紅景天苷、酪醇和絡塞維含量的變化?

2.3 輻照處理RRE對模型小鼠體重、攝食量、飲水量和食物效價的影響

由圖3可以看出，造模成功的小鼠體重低于正常組，并存在顯著性差異(P<0.05)，用RRE和鹽酸二甲雙胍灌胃后，隨灌胃次數(shù)增加，各給藥組小鼠體重都有所增加，但仍顯著低于正常組(P<0.05)，第9周時，20 kGy組的小鼠體重顯著高于其他輻照劑量組的(P<0.05)。表明RRE可以改善1型糖尿病小鼠體重減輕的癥狀，并且在20 kGy時對1型糖尿病小鼠體重改善效果較好。張露等[18]對輻照處理后的樺褐孔菌多糖的降血糖作用進行研究時，也發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌多糖能夠改善糖尿病小鼠的糖尿病癥狀，使小鼠體重減輕的癥狀得到改善。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 RRE對小鼠體重的影響Figure 3 Effects of RRE on body weight of mice

從圖4可以看出，注射STZ的各組小鼠的體重增量低于正常組，且存在顯著性差異(P<0.05)，注射STZ的各組小鼠攝食量和飲水量均顯著高于正常組的(P<0.05)，但食物效價低于正常組并存在顯著性差異(P<0.05)，灌胃RRE的各組小鼠的攝食量和飲水量顯著低于模型組(P<0.05)而食物效價顯著高于模型組(P<0.05)，灌胃20 kGy RRE的小鼠的食物效價顯著高于灌胃其他輻照劑量的(P<0.05)，與劉素欣等[19]發(fā)現(xiàn)RRE能夠改善1型糖尿病小鼠的飲食狀態(tài)，提高1型糖尿病小鼠的食物利用率的試驗結果一致，并且20 kGy的RRE對于小鼠飲食狀態(tài)的改善效果較好。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 RRE對小鼠攝食量、飲水量和食物效價的影響Figure 4 Effects of RRE on food intake, water intake and food titer in mice

在試驗過程中1型糖尿病小鼠表現(xiàn)出了飲食量、飲水量以及排尿量過多而體重下降的現(xiàn)象，并且其對食物的利用率要低于正常組小鼠。試驗期間，注射STZ的1型糖尿病小鼠有時會表現(xiàn)出萎靡不振，毛色干燥，灌胃給藥后，小鼠的精神狀態(tài)好轉，隨著灌胃給藥，毛色由干燥轉變?yōu)楹诠庥土?；模型組小鼠的墊料明顯潮濕，灌胃給藥后，給藥組小鼠的墊料潮濕情況有所改善，所以說明RRE能夠改善小鼠的身體、精神狀態(tài)和墊料潮濕情況，并且20 kGy 的RRE效果最好。

2.4 輻照處理前后的RRE對小鼠空腹血糖值的影響

由圖5可知，建模后，與正常組相比，模型組空腹血糖水平顯著上升(P<0.05)，經不同輻照劑量RRE灌胃后，各組小鼠空腹血糖水平均有所改善，且20 kGy組水平顯著低于模型組(P<0.05)，同時顯著低于其他各輻照劑量組(P<0.05)。表明RRE能夠降低1型糖尿病小鼠空腹血糖水平，并且20 kGy的RRE降血糖效果優(yōu)于其他輻照劑量的。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 RRE對小鼠空腹血糖值的影響Figure 5 Effects of RRE on fasting blood glucose in mice

2.5 RRE對小鼠口服葡萄糖耐量的影響

由圖6(a)可知，經口灌胃葡萄糖溶液后，正常組小鼠血糖水平緩慢上升，其余組別小鼠血糖水平急劇上升，在0.5 h時達到最大，0.5 h以后所有組別小鼠血糖水平逐漸下降，在2 h時20 kGy組的小鼠血糖水平接近灌胃葡萄糖之前的水平，與0.5 h時的血糖水平相比，2 h時20 kGy組的小鼠血糖水平下降了41.24%，下降幅度僅次于陽性組且高于其他輻照劑量組，所有給藥組小鼠的血糖值均顯著低于模型組(P<0.05)。由圖6(b)可知，與模型組相比灌胃RRE的小鼠糖耐量顯著提高(P<0.05)，并且20 kGy 組的糖耐量顯著高于其他輻照劑量組的(P<0.05)。因此RRE能夠改善由STZ導致的小鼠的糖耐量損傷，并且20 kGy的RRE對小鼠糖耐量的改善效果較好，表明其具有提高STZ誘導的1型糖尿病小鼠抗高血糖的潛力。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖6 RRE對小鼠口服葡萄糖耐量的影響Figure 6 Effects of RRE on oral glucose tolerance in mice

2.6 RRE對小鼠血液TC、TG、GHb、MDA、CAT和SOD的影響

糖尿病病人機體胰島素本身不足會導致脂蛋白脂肪酶活性下降，從而引起其對TG的水解能力減弱，致使與TG相關的脂蛋白出現(xiàn)代謝障礙，使TG含量升高而高密度脂蛋白(HDL)含量減少，進而使HDL從周圍組織中將膽固醇轉運至肝臟的能力減弱，導致體內膽固醇因不能轉化和排泄而使TC含量升高[20]。由圖7(a)和圖7(b)可知，注射STZ的小鼠其血清中TC和TG含量顯著高于正常組(P<0.05)，灌胃RRE后，灌胃的各組小鼠其血清中TC和TG含量顯著低于模型組的(P<0.05)，并且20 kGy組血清中的TC和TG含量顯著低于其他輻照劑量組的(P<0.05)。表明RRE能夠降低STZ誘導的1型糖尿病小鼠血清中TC和TG的含量，并且20 kGy的RRE降低TC和TG含量的效果較好。

由圖7(c)可知，注射STZ的1型糖尿病小鼠GHb含量顯著高于正常組(P<0.05)，灌胃RRE的各組小鼠血清中GHb含量低于模型組并存在顯著性(P<0.05)，其中20 kGy組小鼠GHb含量顯著低于灌胃其他輻照劑量的(P<0.05)，表明RRE能夠降低由STZ誘導的1型糖尿病小鼠糖化血紅蛋白的含量，并且20 kGy的RRE降低糖化血紅蛋白含量的效果較好。

MDA、CAT與SOD在機體中具有較強的抗氧化能力，壓制氧自由基的生成，可降低其對細胞的傷害，并且可以降低MDA的生成量[21]。由圖7(d)～圖7(f)可知，注射STZ的小鼠血清中MDA含量高于正常組并存在顯著性差異(P<0.05)，CAT和SOD活力顯著低于正常組(P<0.05)，與模型組相比灌胃RRE的各組小鼠血清中MDA含量顯著降低(P<0.05)而CAT和SOD活力顯著提高(P<0.05)，20 kGy組小鼠血清中MDA含量顯著低于其他輻照劑量的(P<0.05)，CAT和SOD活力顯著高于其他輻照劑量的(P<0.05)。因此RRE能夠降低STZ誘導的1型糖尿病小鼠血清內MDA含量，并提高CAT和SOD活力，表明RRE能夠提高1型糖尿病小鼠的抗氧化能力，具有降血糖的效果。20 kGy輻照處理的RRE的抗氧化效果較好。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖7 RRE對小鼠血液TC、TG、GHb、MDA、CAT和SOD的影響Figure 7 Effects of RRE on blood TC, TG, GHb, MDA, CAT and SOD in mice

2.7 RRE對小鼠臟器系數(shù)的影響

由表3可知，注射STZ建模后，模型組小鼠脾臟臟器系數(shù)與正常組相比不存在顯著性差異(P>0.05)，表明STZ未造成小鼠脾臟的腫大，并且灌胃RRE的小鼠脾臟與正常組相比也無顯著性差異(P>0.05)，說明RRE不會對小鼠脾臟造成傷害。但在建模后，注射STZ的小鼠心、肝、腎的臟器系數(shù)高于正常組并存在顯著性差異(P<0.05)，經口灌胃RRE的小鼠其心、肝、腎的臟器系數(shù)顯著小于模型組(P<0.05)，表明RRE能夠緩解1型糖尿病小鼠臟器腫大的現(xiàn)象。在灌胃RRE的組別中，20 kGy組的臟器系數(shù)顯著低于其他輻照劑量的(P<0.05)，說明20 kGy 輻照處理的RRE緩解1型糖尿病小鼠臟器腫大的效果較好。

表3 RRE對小鼠臟器系數(shù)的影響?

3 結論

不同輻照劑量的60Co-γ射線處理會影響紅景天提取物活性成分，改善其對1型糖尿病小鼠相關指標的水平，降血糖作用顯著，且20 kGy時效果最佳。但該試驗僅研究了輻照劑量對降血糖效果的影響，后續(xù)將進一步研究最佳輻照劑量下的降血糖作用，并通過體內外試驗探討其降血糖機制。