可吸收抗菌膽道支架的制備及其生物相容性研究

傅俊輝 ,黃 靜 ,徐 銳 ,戴晨怡 ,劉燁磊 ,李張輝 ,駱 陽,竺亞斌,陸才德*

（1.寧波大學 醫(yī)學院,浙江 寧波 315211;2 寧波大學附屬李惠利醫(yī)院,浙江 寧波 315048）

隨著組織工程的發(fā)展,生物降解可吸收支架已成為醫(yī)學與材料科學交叉領域的研究熱點[1-3].可降解支架主要由聚L-丙交酯(Poly (L-lactide),PLLA)、聚二氧六酮(Polydioxanone,PDO)、聚氨酯(Polyurethane,PU)和可降解鎂合金等材料制成,這些可生物降解的支架由于其良好的生物相容性、物理性能、可降解性和可修飾性,在膽道狹窄的治療和組織修復中發(fā)揮了重要作用[4-7].膽道支架的材料從最初的橡膠到現(xiàn)在常用的塑料或自膨脹金屬,仍然存在許多缺點[8].例如,塑料支架易堵塞、移位,需要頻繁更換;鈦合金支架類的金屬不僅價格昂貴,更重要的是患者需經(jīng)二次手術將其取出,增加了患者痛苦和經(jīng)濟負擔.生物可降解膽道支架(Biodegradable Biliary Stent,BDBS)安全有效且無需更換,提供了治療膽道疾病的新方向與新方法,具有廣闊的應用前景.

理想的BDBS 應具備以下特性[9]: (1)降解性.降解產物可排放或吸收,不會在人體中積累.(2)良好的生物相容性.支架及其降解產物必須無毒、不致畸,不會引起凝血、溶血、免疫排斥.(3)支架必須具有良好的物理特性,具有與金屬支架相同的膨脹率和徑向力.(4)可修飾性.可以將藥物分子或細胞裝載在支架表面或者內部,以達到治療的目的.Siiki 等[10]在豬模型中比較了金屬和PLLA 膽道支架治療膽道狹窄的蛋白表達水平,結果是蛋白表達有很大的不同,提示了不同愈合機制的膽道組織.Tannimoto 等[11]也評估了在豬膽總管端吻合模型中由聚乳酸-ε 己內酯共聚物制備的BDBS,期間未發(fā)生不良事件,術后6 個月,支架自然降解.然而,PLLA 由于較為僵硬,強度大,且韌性有限,短時間植入后,脆性較大.

膽道支架植入術后再狹窄是另一個重要問題.主要是因為細菌感染和微生物膜的形成[12],容易產生膽泥淤積,造成支架堵塞.如何減少膽道感染,提高支架的通暢度甚至患者生存率[13],都是困擾人們的難題.迄今為止,臨床上具有良好生物降解性的抗菌膽道支架還很少[12].

本文基于上述研究背景,設計了一種新型生物可降解支架,由不同質量比的聚(L-丙交酯-coε-己內酯)(poly(L-lactide-co-ε-caprolactone),PLCL)和聚L-丙交酯(Poly (L-lactide),PLLA)混合物制成,并在支架表面涂上聚六亞甲基胍鹽酸鹽(PHMG),使其具有抗菌和抗再狹窄功能.同時,對它們的理化性質、抗菌活性、生物相容性和通暢性進行體內外研究.

1 材料和方法

1.1 材料及支架準備

文中所需PLCL 購自濟南岱罡生物材料有限公司,質量進料比為80:20(丙交酯:己內酯),黏度系數(shù)為3.4.PLLA 是由中國科學院寧波材料技術與工程研究所提供,相對分子質量為200 000 D.

支架基材料的制備過程: 將PLCL 與PLLA 按不同質量比例混合(PLCL:PLLA=100:0、75:25、50:50、25:75、0:100),分別命名為P100-0、P75-25、P50-50、P25-75和P0-100.然后將不同質量比例的材料(共2 g)溶于1,4-二氧六烷(20 mL)中,60 ℃下持續(xù)溶解24 h.稍冷卻后,將溶液均勻倒入在直徑為100 mm的玻璃培養(yǎng)皿上,于室溫下自然揮發(fā)溶劑24 h,最后得到約0.5 mm 厚的薄膜.

從得到的薄膜上切下一個10 mm×10 mm 的矩形薄膜.將薄膜平均分為兩邊,在每邊上對稱地開3 個孔,然后在薄膜兩端用1,4-二氧六烷將其黏住,形成管狀的帶孔支架(制作過程中與空氣接觸的薄膜表面為外表面,與玻璃皿接觸的表面為內表面).最后形成的支架外徑3.0 mm,內徑2.0 mm,支架長度10 mm.

1.2 理化表征

1.2.1 拉伸試驗

在PLCL 與PLLA 不同比例制備的薄膜上截下10 mm×60 mm 的矩形長條,用夾具將各種比例的長條夾在1 kN 拉力機(Zwick Roel,德國科唯儀器)上以測試其力學性能.預載為0.01 N,拉伸模量測試速度50 mm·min-1.所有試驗重復3 次,最后記錄數(shù)據(jù),繪制曲線圖.

1.2.2 壓縮試驗

將不同比例薄膜制成的管狀有孔支架平行放置在拉力機(Instron 3366,美國)上進行壓縮測試,施加壓力為100 N,加載速率20 mm·min-1.所有試驗重復3 次,最后記錄數(shù)據(jù),繪制曲線圖.

1.2.3 掃描電鏡

在掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope,SEM)(Regulus 8230,日本日立)下觀察薄膜外表面的表面形貌.

1.2.4 降解試驗

選取力學性質與電鏡顯微形貌表觀最佳的共混物P50-50薄膜進行試驗.根據(jù)S?rensen模型[14],將96.5 mL Na2HPO4(133 mmol·L-1)與3.5 mL KH2PO4(133 mmol·L-1)混合得到100 mL 溶液,制成模擬膽汁液,pH 值為8.4,作為膽道組,PBS (pH 7.2)溶液為對照組.在2 組溶液中各放入3 種不同形狀(n=3)、相同質量的薄膜,以便于區(qū)分與計算質量.薄膜預先經(jīng)過紫外滅菌處理,降解環(huán)境溫度為37 ℃,避光,每周檢測溶液的pH 值,當pH 值低于閾值(對照組pH＜7,膽道組pH＜8)時,更換溶液.分別在7、14、21、28 d 時,取出各組薄膜樣本,烘干后稱量.計算方式:

式中:m0為樣品的初始質量;md為某天的質量.

同時,用SEM 觀察28 d 時外表面與內表面的形貌.

1.3 抗菌測試

選用力學性能和顯微形貌最佳的P50-50薄膜作為試驗樣品,P100-0作為對照.2 組薄膜制成直徑為6 mm 的小圓片,其中一組浸泡在1%的PHMG/去離子水(10 mL)中,另一組浸泡在去離子水(10 mL)中,其中PHMG 純度＞99%,相對分子質量20 000～25 000 D,購于麥克林生化有限公司.涂覆后的樣品分別命名為PP100-0和PP50-50.

以往資料顯示,膽管細菌感染相關的細菌主要有金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.pneumonia)、糞腸球菌(E.faecalis)和銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)[15-18].因此本試驗采用下列菌種的國際標準菌株: 金黃色葡萄球菌(ATCC25933)、大腸桿菌(ATCC25922)、肺炎克雷白桿菌(ATCC700603)、糞腸球菌(ATCC29212)、銅綠假單胞菌(ATCC27853).

首先進行抑菌圈試驗.取直徑100 mm 的無菌培養(yǎng)皿,傾入經(jīng)高壓滅菌后的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基20 mL,冷凝后制成平板.取700μL 稀釋后的菌液于培養(yǎng)基表面,使菌液均勻展開,至菌液完全覆蓋于培養(yǎng)基表面,制成含菌平板.將對照組(P100-0、PP100-0)與試驗組(P50-50、PP50-50)圓片分別貼放在含菌平板的4 個方位.放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后取出觀察,用游標卡尺精確測量每個圓片周圍抑菌環(huán)直徑的大小(mm),測3 次取平均值.根據(jù)文獻[19]標準,將抑菌環(huán)直徑＞7 mm 的樣本認作有抑菌作用,整個操作在超凈臺中進行,防止雜菌污染.所有試驗重復3 次.

本研究還測試了包覆樣品PHMG 的釋放特性.首先將1 mg·mL-1的PHMG/PBS溶液在紫外分光光度計(U3010,日本日立)下測出最適吸光度(波長為203 nm).之后以1 mg·mL-1為起始質量濃度,依次對半稀釋,用紫外分光光度計測定波長在203 nm處的吸光度值,繪制PHMG 標準曲線.

將上述包覆PHMG 的小圓片PP50-50置于PBS(10 mL)中,環(huán)境溫度37 ℃,測定吸光度與時間的關系,根據(jù)標準曲線得到相應的PHMG濃度,并繪制濃度隨時間的釋放曲線.所有試驗重復3 次.

1.4 體內試驗

ICR 小鼠(6 周齡)和SD 大鼠(2 月齡)由寧波大學醫(yī)學院實驗動物中心提供.所有動物試驗均遵循寧波大學倫理委員會的指導原則進行.

將ICR 小鼠隨機分為4 組,每組9 只(n=3).所有小鼠采用異氟烷吸入麻醉.以P100-0和PP100-0為對照的P50-50和PP50-50樣品(5 mm×8 mm)植入動物背部皮下.分別在7、14、28 d 后,對動物進行過量麻醉處死,收集標本進行進一步評估.

由于缺乏可行原位試驗的大型動物,本研究設計了十二指腸置管的動物模型,研究支架的通暢性,為支架在動物體內的通暢性、移位性和生物相容性提供一些有價值的參考.在SD 大鼠十二指腸內植入聚合物支架(包覆聚PHMG 和不包覆PHMG).每組9 只大鼠分別在7、14、28 d 時過量麻醉后處死,觀察各組大鼠十二指腸狀態(tài).然后收集十二指腸和支架進行以下試驗.

1.5 組織學和免疫熒光分析

標本用PBS 進行沖洗,4%多聚甲醛固定,OCT(Sakura,美國)包埋,-20 ℃下用切片機(Leica CM1950,德國)切成4～6 μm 的組織切片,采用HE染色,觀察標本形態(tài)特征.另一方面,用抗CD11b作為一抗進行免疫熒光染色(CD11b 常用于標記分化后的單核細胞、巨噬細胞、NK 細胞等免疫細胞).最后用Image J 軟件對結果進行處理.

1.6 統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標準差(SD)”表示.采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學分析,采用單因素方差分析或t檢驗(n≥3),P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 材料力學性能

拉伸和壓縮測試的結果如圖1 所示.由圖可見,在這些共混物中,P50-50在拉伸和壓縮試驗中具有最高的強度和應變能力,而聚合物P0-100(PLLA)和P100-0(PLCL)表現(xiàn)較差.P0-100雖然具有較好的應變能力,但其強度卻較弱.同樣,P100-0的強度和應變能力都較低,抗壓性能也是最差的.

圖1 不同比例的拉伸—應變(a)及壓縮—應變(b)曲線

電子顯微鏡下觀察與空氣接觸的表面(外表面)形貌(圖2).由圖可見,P100-0的表面結構比較平坦光滑,而P50-50和P0-100的表面結構比較不均勻,突出部分較多,在高倍下顯示較多孔隙.表面粗糙的材料預計更有利于細胞附著和生長.由此可見,P50-50具有優(yōu)良的力學性能和形貌粗糙度,因此選擇其作為接下來的研究主體.

圖2 在掃描電鏡下薄膜外表面的形貌

2.2 降解特性

在28 d 的過程中,樣品P50-50在模擬膽汁中表現(xiàn)出較大的質量損失(19.6%±0.67%),而在PBS 中幾乎沒有損失(圖3).其原因可能與膽汁的堿性環(huán)境有關,并且粗糙的表面結構也加速了液體的浸潤,從而促進了聚合物的降解.電鏡結果也同樣顯示(圖4),2組與空氣接觸的表面(T.A)幾乎沒有變化,但膽道組出現(xiàn)少量孔隙.并且膽道組在接觸玻璃皿的表面(T.G)腐蝕較嚴重,而對照組仍較為平整.2 組均無斷裂或分離.因此,在整個試驗中,P50-50的質量雖然有所降低,但仍能很好地保持原來的狀態(tài)和功能.

圖3 樣品質量損失隨時間的變化

圖4 第28 天掃描電鏡觀察薄膜的表面形貌(P50-50)

2.3 抗菌活性

抑菌圈結果顯示,PP50-50和PP100-0抑菌活性均優(yōu)于未覆蓋聚六亞甲基胍鹽酸鹽的材料(圖5),并且抑菌圈直徑均在7.0 mm 以上,表明PP50-50和PP100-0對上述5 種細菌均有較好的抗菌效果.從統(tǒng)計學分析來看,PP50-50對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌效果顯著優(yōu)于PP100-0(P＜0.05,圖6).

圖5 各菌種的抑菌圈示意圖

圖6 各組抑制圈直徑對比

從PHMG 釋放量和抗菌活性連續(xù)性兩個方面考察材料的釋放特性(圖7).結果表明,P50-50釋放出的PHMG 濃度在24 h 時達到峰值,之后出現(xiàn)顯著下降,并在336 h 基本保持不變(圖8).這些結果表明,PHMG 在開始階段是持續(xù)釋放.24 h 后,P50-50在PHMG 中的釋放和再吸附達到平衡,最終釋放濃度達到穩(wěn)定狀態(tài).

圖7 PHMG 標準曲線

圖8 P50-50 上PHMG 的釋放曲線

2.4 生物相容性研究

將2 對P100-0和PP100-0、P50-50和PP50-50分別植入小鼠背部皮下,探究其生物相容性.結果如圖9 所示,在7～28 d 中,各組創(chuàng)面逐漸修復.28 d 時的皮膚幾乎完全痊愈,只有在剃完毛后觀察到有輕微的疤痕痕跡.整個恢復期未見潰瘍或膿腫發(fā)生,小鼠均未發(fā)生死亡.PHMG 涂覆組與未涂覆組間無明顯差異.說明本試驗所用的材料安全無毒.

圖9 小鼠皮下實驗結果(由上至下分別為創(chuàng)面概覽、組織觀察及組織切片HE 染色結果)

取下標本后,植入材料與組織無黏連,材料無破損及裂解,仍呈透明狀.與正常組織相比,植入材料周圍的皮膚組織在7 d 時稍模糊,暴露的結締組織較多,血管略不清.14、28 d 時,各組材料與組織的接觸面變?yōu)榍逦?材料周圍結締組織減少,變?yōu)槌吻?可見明顯的血管紋路,并且無異物反應.

HE 染色結果顯示,與正常組織相比,各標本7 d 時炎癥細胞浸潤明顯,但無水腫及壞死的表現(xiàn).14 d 時炎癥減輕,28 d 時炎癥明顯減輕,并趨于正常.P100-0組和P50-50組在7～28 d 時的結果與PP100-0組和PP50-50組的結果相似.但相對而言,PP100-0和PP50-50植入的組織在28 d 時比P100-0和P50-50植入的組織更清晰,血管紋路更明顯.

2.5 大鼠腸道通暢性試驗

選用PP50-50制成的支架置入大鼠十二指腸內,如圖10 所示,以P50-50制成的支架為對照,測試其通暢性、支撐性及是否會發(fā)生移位.在試驗過程中,沒有老鼠死亡.大鼠進食正常,表明大鼠未發(fā)生腸梗阻.各組腸壁均未發(fā)生潰破及穿孔,置管處腸段略寬于正常腸段,取下置管處腸段時,觀察到管子未發(fā)生形變(圖中箭頭所指),未斷裂及裂解.由此可見管子在腸內也具有一定支撐性,且強度足夠,能較好地維持之前狀態(tài),且不易突破腸壁組織.游離完周邊結締組織后,可觀察到相對于7 d 和14 d時的腸壁組織恢復較好,已具有較完整的形態(tài),無潰瘍,只有少量充血.并且,PP50-50置入后的組織比P50-50置入后的組織更正常,充血更少.

圖10 大鼠十二指腸內置入支架

收集組織進行切片并HE 染色,P50-50和PP50-50標本腸壁周圍黏膜組織在7 d 時均表現(xiàn)出明顯的炎癥浸潤,且出現(xiàn)少數(shù)異形巨細胞.但在14 d 時較正常組織炎癥有所減少,并且未發(fā)現(xiàn)異形巨細胞.以上試驗也同樣證明了材料具有良好的生物相容性.7 d 與14 d 時,均可以看見明顯的支架輪廓,證明支架可以在腸內具有良好支撐性.然而,支架在術后28 d 消失.由于降解試驗中的P50-50在28 d 內不可能完全降解或只發(fā)生部分裂解,因此我們猜測可能是由于十二指腸的強酸性環(huán)境可能會加速固定的縫線裂解,還有一種可能是因為大鼠腸道蠕動較為劇烈而發(fā)生移位.

各標本進行免疫熒光染色,觀察組織恢復情況.28 d 時雖未找到材料,但仍取十二指腸腸段進行免疫熒光測試.標本用CD11b抗體標記,反映炎癥浸潤情況.熒光強度在7 d 最高,14 d 減弱,28 d未檢測到(圖11),熒光強度的半定量分析也證實此結果(圖12),但各天數(shù)時P50-50與PP50-50的熒光強度并沒有統(tǒng)計學上的差異(P＞0.05).這證實了研究材料作為體內支架具有良好的生物相容性.

圖11 以抗cd11b 為一抗進行免疫熒光染色

圖12 免疫熒光平均熒光強度的半定量結果

3 討論

本研究將PLCL 和PLLA 按不同質量比例混合,對其理化性質進行測試.材料的拉力測試與支架的壓縮測試的結果顯示,P50-50薄膜及其制備成的支架力學性能均是最好的,相比于P100-0和P0-100,強度和延展性都得到了提升.并且研究中的支架采用了開孔處理,相信這些小孔能有利于組織與支架的黏附,可增加支架的通暢性,阻止再狹窄的情況發(fā)生.本研究中的力學性能檢測原因有以下三點:(1)PLCL 作為一種非晶態(tài)聚合物,其結構中仍然含有少量PLLA 晶區(qū),與結晶聚合物PLLA 混合后形成較均相體系,強度高于單純PLCL;(2)PLLA完整的晶區(qū)對非晶聚合物PLCL 有增強作用;(3)非晶聚合物破壞了結晶聚合物PLLA 完整的晶區(qū),對其有增韌作用,加強了其延展性.因此,本研究中得到了一種力學性能更為出色的生物可降解材料.電鏡下的形貌與PLLA 相似,表面結構并沒有較大改變,因此也有理由相信該材料適合于細胞的黏附與增殖,具有良好的生物相容性.

降解性能一直是考察生物可降解膽道支架的重點.日本之前的2 項研究中,在豬膽管內放置的PLCL支架均在6個月后降解消失[11,20];Girard等[14]制作的PLA-PEG-PLA 支架在體外模擬膽汁中降解,1 個月?lián)p失了20%的質量,3 個月時損失了85%的質量.文中樣品P50-50在模擬膽汁中28 d 時損失了19.6%±0.67%的質量,但是試驗結束后材料并沒有裂解,表面甚至只有較小細紋.因此,在整個試驗中,P50-50質量雖然有所降低,但仍能很好地保持原來的狀態(tài)和功能,使動物在膽道完全修復之前能維持其通暢性.

目前普遍認為細菌黏附、生物膜形成和膽泥淤積是支架發(fā)生再阻塞的主要原因.一項回顧性研究表明,接受膽道支架植入術的患者在術后3 周到31 個月內發(fā)生膽道感染的概率高達25.5%,膽道感染使患者發(fā)生膽道再狹窄的概率從2.3%增加到了13.1%[21].所以開發(fā)理想的抗菌型膽道支架具有重要意義.PHMG 是一種帶正電荷的胍類聚合物,可以與細菌細胞膜上帶負電荷的羧酸鹽、磷酸鹽和其他物質發(fā)生靜電作用,增加細胞膜的通透性,從而導致細菌死亡[22].我們試驗中的PHMG 有著出色的抗菌效果,但是過度的抗菌能力不可避免地會導致PHMG對正常組織細胞的毒性,但我們設計的支架表面PHMG量極少,所以在皮下及腸內對正常組織細胞毒性較少.出于安全考慮,之后我們可以進一步對PMHG涂層進行修飾,如泊洛沙姆及透明質酸[23],以減少PHMG 的細胞毒性.PHMG 的釋放試驗也證實,雖然PHMG 只是簡單涂覆在材料表面,但抗菌效果依然十分理想.并且后續(xù)可以加入納米緩釋的載藥載體來達到想要的釋放可控效果.

采用小鼠皮下植入的方法測試了材料的生物相容性.植入28 d內,2對材料(P100-0、PP100-0和P50-50、PP50-50)只表現(xiàn)出輕微的炎癥反應,傷口沒有化膿及潰爛,皮下組織也沒有其他異常反應.并且PP100-0和PP50-50在28 d時與組織接觸面的恢復情況要好于P100-0和P50-50,這也證明涂覆PHMG 的材料具有良好抗菌性能,且生物相容性也十分良好.

膽道支架時常也被應用于膽腸吻合術中,以防止吻合口狹窄,此時支架的一部分會暴露在十二指腸管腔內,與十二指腸黏膜接觸;此外,與十二指腸內的食糜長期接觸易造成支架阻塞,導致膽汁的引流不暢.因此可將P50-50和PP50-50制備成的支架置入大鼠十二指腸內,來檢測該環(huán)境下支架的通暢性及與十二指腸黏膜的生物相容性.從HE染色結果來看,低倍與高倍鏡下觀察到的結果一致,炎癥也只發(fā)生在初期,之后便消退.免疫熒光染色的結果也證實了此點.圖10 箭頭所指為支架所在位置,切片時由于支架與組織的力學性能相差懸殊,在染色操作時用流水沖洗處理組織切片,易使支架殘片與組織分離,而被水流沖走,導致脫片.但即便如此,依舊可以清晰地看見支架輪廓,說明支架的力學性能足以支撐腸管使其擴張.遺憾的是在28 d 時未找到支架,我們猜測是由于試驗所用縫線太過脆弱,在腸內酸性環(huán)境中發(fā)生腐蝕,而使支架脫落;又或許因為腸道本身的蠕動較為劇烈,導致支架脫落.參考自膨脹金屬膽道支架與自膨脹生物可降解支架[24],支架可以引入自膨脹體系,一定程度上減少發(fā)生移位的可能性.總之,該支架在大鼠十二指腸內具備良好的通暢性,并具有良好的生物相容性.

本研究首次將PLCL 與PLLA 混合用于膽管支架的制作,經(jīng)最大拉伸性、橫向支撐力、表面形貌、體外降解性等基本表征,得到性能優(yōu)良的PP50-50抗菌性可降解的膽道支架.同時,開展了支架在體內生物相容性及十二指腸內通暢性的研究.在力學性能、降解性、組織相容性及通暢性等方面,該支架均展現(xiàn)出了優(yōu)異性能,是比較理想的膽道替代支架.