核酸嘌呤堿鑒定實(shí)驗(yàn)改進(jìn)分析

趙雨彤，朱彩瑜，汪長東

（重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，重慶 400016）

動物組織核酸提取及成分鑒定實(shí)驗(yàn)屬于經(jīng)典性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)[1-3]。在用硝酸銀鑒定嘌呤堿的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，對照組往往不是實(shí)驗(yàn)預(yù)期中的無色液體，而帶有部分黑色顆粒狀沉淀，從而降低了對照組與實(shí)驗(yàn)組的對比效果。為此，在理論上對對照組黑色顆粒狀沉淀出現(xiàn)的原因進(jìn)行了分析，討論了在不同氨水用量下對照組可能出現(xiàn)的現(xiàn)象。

1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（左為實(shí)驗(yàn)組，右為對照組）

2 結(jié)果分析

在嘌呤堿的鑒定過程中，發(fā)現(xiàn)對照組出現(xiàn)了少許黑色顆粒狀沉淀，對出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因進(jìn)行如下分析。

實(shí)驗(yàn)中，加入H2SO420滴，AgNO310滴，濃氨水3滴。以1滴約為0.05mL進(jìn)行計(jì)算，可以估算H2SO4、AgNO3和濃氨水的體積。實(shí)驗(yàn)所用H2SO4和AgNO3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為5%，濃氨水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為20%，而濃度c與質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω滿足關(guān)系：

通過計(jì)算可以確定的試劑用量如表2所示。

表2 對照組已知試劑用量

2.1 H2SO4（1mL）與AgNO3（0.5mL）混合反應(yīng)

由此反應(yīng)方程式可得：

查閱相關(guān)文獻(xiàn)[4，5]可知Ksp（Ag2SO4）=1.2×10-5，故可得K1=8.33×104，接近105，反應(yīng)比較完全，幾乎不可逆。由表2可知，對Ag+而言過量，所以反應(yīng)之后混合溶液體系中：

H2SO4（1mL）與AgNO3（0.5mL）混合后，混合體系中出現(xiàn)白色沉淀。

2.2 向混合體系中緩慢滴加濃氨水的反應(yīng)

2.2.1 濃氨水與H+的反應(yīng)

由于酸堿反應(yīng)總是最迅速的，所以在滴加濃氨水進(jìn)入有白色沉淀的混合溶液體系時(shí)，首先考慮氨水與H+發(fā)生反應(yīng)：

查閱相關(guān)文獻(xiàn)[6-8]可知Kb(NH3·H2O) = 1.76×10-5，則K2=1.76×109＞＞105，所以實(shí)驗(yàn)過程中每一滴NH3·H2O滴入混合溶液體系均可認(rèn)為反應(yīng)完全。當(dāng)混合溶液體系中的H+完全被氨水中和時(shí)，消耗氨水n(NH3·H2O)=n(H+) = 10.4×10-4mol = 10.4×10-4mol，還 未 滴 加 的 氨 水n(NH3·H2O)剩=（16.2-10.4）×10-4mol=5.8×10-4mol。

所以，若該實(shí)驗(yàn)滴加NH3·H2O的量為0mol＜n(NH3·H2O)＜10.4×10-4mol，則滴加完氨水后不會出現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)對照組所得的黑色顆粒狀沉淀。

2.2.2 濃氨水與Ag2SO4反應(yīng)

將未滴加的氨水緩慢加入有沉淀的混合溶液體系，筆者考慮氨水與Ag2SO4的反應(yīng)以以下步驟分步進(jìn)行。

第一步，少量的氨水將Ag2SO4沉淀轉(zhuǎn)化為更難溶的AgOH，反應(yīng)方程式如下：

該實(shí)驗(yàn)加入的氨水總量n(NH3·H2O)＞(1.32+10.4)×10-4mol = 11.72×10-4mol時(shí)，對照組會出現(xiàn)黑色沉淀。

本次實(shí)驗(yàn)所加氨水總量為1.62×10-3mol＞11.72×10-4mol，故本次反應(yīng)會有黑色沉淀產(chǎn)生。那么可以推測最后對照組出現(xiàn)黑色沉淀的原因是剩下的氨水將Ag2SO4部分轉(zhuǎn)化為AgOH，AgOH分解為Ag2O，或氨水將Ag2SO4全部轉(zhuǎn)化為AgOH后未能完全溶解沉淀，剩下的AgOH分解成Ag2O。

為明確具體原因，進(jìn)一步分析剩下的氨水（5.8×10-4mol）能否將Ag2SO4完全轉(zhuǎn)化。

若完全轉(zhuǎn)化，所需n(NH3·H2O)1+n(NH3·H2O)2，其中n(NH3·H2O)1為與Ag2SO4反應(yīng)消耗的氨水，即2n(Ag2SO4)=1.6×10-4mol；n(NH3·H2O)2為使反應(yīng)達(dá)到平衡溶液至少需要剩下的氨水。

計(jì)算得［NH3·H2O］2= 0.1mol/L，n(NH3·H2O)2= 1.65×10-4mol/L，所需n(NH3·H2O) = (1.6+1.65)×10-4mo1 =3.25×10-4mol/L。而剩下的氨水共有5.8×10-4mol，足以使Ag2SO4完全轉(zhuǎn)化，且使其完全轉(zhuǎn)化后，未反應(yīng)的氨水還剩4.2×10-4mol，這些未反應(yīng)的氨水理論上一部分留在混合溶液中，一部分還未滴入。

所以此處可以基本確定對照組黑色沉淀是氨水將Ag2SO4全部轉(zhuǎn)化為AgOH后未能完全溶解沉淀造成的，對此推論做計(jì)算上的驗(yàn)證。

同時(shí)可算得實(shí)驗(yàn)所滴加的總的氨水的量（一部分中和硫酸，一部分轉(zhuǎn)化Ag2SO4沉淀，一部分溶解AgOH） 應(yīng) 大 于 (10.4+1.6+6.33)×10-4mol = 18.33×10-4mol才可避免對照組出現(xiàn)黑色沉淀。

綜上所述，在該實(shí)驗(yàn)有諸多不方便定量分析的因素時(shí)，進(jìn)行了如下假設(shè)：

（1）滴加溶液時(shí)1滴約為0.05mL。

（2）在濃氨水與Ag2SO4反應(yīng)計(jì)算過程中，混合溶液總體積均為1.65mL。

該實(shí)驗(yàn)對照組發(fā)生的反應(yīng)分別為：

故認(rèn)為該實(shí)驗(yàn)對照組出現(xiàn)黑色顆粒狀沉淀的原因可能是氨水的量不夠，若要得到更具代表性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建議增加氨水的濃度或加入的體積，以避免對照組出現(xiàn)黑色沉淀。

3 結(jié) 語

經(jīng)以上計(jì)算分析，認(rèn)為該實(shí)驗(yàn)對照組出現(xiàn)黑色顆粒狀沉淀的可能原因是氨水加入量不夠，若要得到更具代表性、對比度更明顯的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建議增加氨水的濃度或加入氨水的體積，以避免對照組出現(xiàn)少許黑色沉淀，對判斷實(shí)驗(yàn)組是否出現(xiàn)灰黑色絮狀沉淀的現(xiàn)象造成不必要的干擾。因此，該實(shí)驗(yàn)應(yīng)做出相應(yīng)改進(jìn)，以保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性、可行性。