基于靜力衡量法和光學(xué)法的超微容量測量方法對比分析

劉鑫行, 王思賢, 孫 斌, 張竟月, 王金濤

(1.中國計量大學(xué), 浙江 杭州 310018; 2.中國計量科學(xué)研究院, 北京 100029)

1 引 言

超微容量在生物、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛,如基因工程測序?qū)嶒灣Ｓ? μL的超微容量[1]、生化分析儀單次加液量精度也達(dá)到1 μL[2]。隨著這些領(lǐng)域的快速發(fā)展,市場對移液器等微小容量計量器具的需求越來越高[3]。基于胡克定律設(shè)計的移液器在長期使用過程中,內(nèi)部彈簧由于磨損等原因,移液器準(zhǔn)確率會明顯下降。計量器具的失準(zhǔn)會影響實驗的準(zhǔn)確性,尤其是在醫(yī)療領(lǐng)域,移液器的準(zhǔn)確性會直接導(dǎo)致臨床誤診[4],因此移液器必須定期校準(zhǔn)[5]。目前,超微容量測量主要有重力法和非重力法。重力法即在實驗室內(nèi)采用高精度電子天平稱量移液器轉(zhuǎn)移的液體,通過介質(zhì)的質(zhì)量和密度的關(guān)系計算出液體的體積。非重力法主要有光學(xué)法、滴定法等。滴定法可通過物質(zhì)間的化學(xué)反應(yīng)來計算轉(zhuǎn)移的容量;光學(xué)法則基于溶液吸收光強的能力與溶液濃度的關(guān)系來定量分析液體。其中,滴定法更適用于500 μL以上的容量檢測;在10 μL以下的超微容量測量中,靜力衡量法易受到溶液蒸發(fā)的影響[1],必須對稱量系統(tǒng)進(jìn)行防蒸發(fā)處理,但稱量系統(tǒng)減少蒸發(fā)帶來誤差的方式較為復(fù)雜;光學(xué)法對實驗的環(huán)境要求不高且系統(tǒng)針對蒸發(fā)處理的方式更為簡單,可作為超微容量測量的方式之一。

本文基于光學(xué)法設(shè)計了超微容量測量實驗,按照分光原理分別搭建了以時域分光和空域分光為基礎(chǔ)的2套光學(xué)測量系統(tǒng),同時將2套光學(xué)測量系統(tǒng)在同一環(huán)境中對同一樣品進(jìn)行光度吸收測試,并將計算所得的液體容量與靜力衡量法進(jìn)行比較獲得了一致的結(jié)論,證明了光學(xué)法在超微容量測量領(lǐng)域的有效性。與靜力衡量法相比,光學(xué)法對于溶液蒸發(fā)的處理方法更為簡單;而在2套光學(xué)系統(tǒng)中,時域分光測量系統(tǒng)的探測器比空域分光測量系統(tǒng)更優(yōu),更易于檢測低濃度下的超微容量。

2 靜力衡量法

JJG 646-2006《移液器檢定規(guī)程》采用的容量檢測方法是基于靜力衡量法,通過測量液體質(zhì)量與密度計算移液器轉(zhuǎn)移液體的體積。按照測量介質(zhì)不同,靜力衡量法可分為水銀稱重法、水稱重法和高氰化鉀稱重法。水銀有毒易揮發(fā),高氰化鉀需要配制多個濃度來適配多個測量范圍,而蒸餾水無毒且操作方便是目前最常用的方法[6]。

由于測量介質(zhì)的密度會隨溫度變化,因此實驗室在測量容量時對環(huán)境要求較高。在檢測移液器前,應(yīng)提前24 h將移液器放入實驗室內(nèi),檢測時要求室溫(20±5) ℃,且室溫變化每小時不大于1 ℃，測量溶液的溫度與室溫溫差不大于2 ℃[7]。

水稱重法的實驗步驟為:首先將電子天平的顯示清零,操作移液器并將轉(zhuǎn)移的液體加入天平的稱量杯中,待天平穩(wěn)定后記錄液體質(zhì)量m,同時記錄蒸餾水的溫度t,連續(xù)操作6次或要求的次數(shù)。將記錄的數(shù)據(jù)用式(1)進(jìn)行計算可得20 ℃下移液器轉(zhuǎn)移的體積V20,其中β為體膨脹系數(shù),ρb為砝碼密度,ρa為空氣密度,ρw為蒸餾水密度[8]。

(1)

式(1)也可表示為式(2),根據(jù)蒸餾水溫度所對應(yīng)的K(t)值和電子天平顯示的質(zhì)量m,可計算出20 ℃下轉(zhuǎn)移的體積,其中K(t)如式(3)所示。

V20=m×K(t)

(2)

(3)

以蒸餾水為檢定介質(zhì)的靜力衡量法精度高、實驗重復(fù)性好、操作簡單,但對實驗環(huán)境的要求較高，無法實現(xiàn)在線測量,難以滿足目前微小容量檢測的市場,且小容量測量時容易受到介質(zhì)蒸發(fā)帶來的影響。通常在測量過程中,介質(zhì)會與周圍環(huán)境接觸發(fā)生蒸發(fā)現(xiàn)象,尤其是使用高分辨率的電子天平測量液體時,溶液的蒸發(fā)現(xiàn)象導(dǎo)致天平的示值不穩(wěn)定。當(dāng)天平加載液體至液體完全靜止時,電子天平有一個穩(wěn)定過程無法快速讀數(shù),此時介質(zhì)已經(jīng)發(fā)生了蒸發(fā),影響了實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性[9]。

本文采用10 mm光程的比色皿和XP205型號的電子天平在21 ℃實驗環(huán)境下進(jìn)行蒸發(fā)實驗,天平的分辨力為0.000 1 g、檢測上限為220 g,對加蓋的比色皿和敞開的比色皿進(jìn)行容量稱量,稱量數(shù)據(jù)顯示加蓋的比色皿在10 min內(nèi)容量并沒有發(fā)生變化,而將蓋子去除后,天平每隔1 min左右便有0.000 1 g的數(shù)據(jù)變化,同樣在相同時間間隔下電子天平第1次平衡時,數(shù)據(jù)顯示為1.465 9 g,10 min后再次平衡時數(shù)據(jù)已減小到1.464 9 g,說明當(dāng)溶液暴露在空氣中時,容量測量會明顯受到蒸發(fā)的影響,若采用更高分辨率的電子天平,則蒸發(fā)的現(xiàn)象會更易觀測。因此,基于靜力衡量法的超微容積檢測必須做防蒸發(fā)處理。例如微量天平XP26PC，天平內(nèi)部裝有1個防蒸發(fā)阱,阱內(nèi)一般有少量蒸餾水以保持腔內(nèi)一定的溫度和濕度,測量要求嚴(yán)格時需要實時監(jiān)測防蒸發(fā)阱內(nèi)的溫濕度。同時需要定期對防蒸發(fā)阱進(jìn)行維護(hù),比如更換腔內(nèi)的蒸餾水、用酒精清洗蒸發(fā)阱等。

當(dāng)使用靜力衡量法對微小容量進(jìn)行測量時,測量的準(zhǔn)確性和重復(fù)性好,但容易受到液體蒸發(fā)的影響,且稱量系統(tǒng)防蒸發(fā)處理的方法與溫濕度有關(guān)，較為復(fù)雜。

3 光學(xué)法

為克服重力法實驗環(huán)境要求高和溶液蒸發(fā)的問題,非重力法成為目前研究的趨勢。光學(xué)法是基于溶液吸光度與濃度的關(guān)系,通過稀釋溶液吸光度的變化反映加入溶液的體積,且光學(xué)法中采用比色皿來盛放溶液,加蓋的比色皿可以有效減小蒸發(fā)帶來的影響。基于光學(xué)法的光譜分析實驗可分為單波長測量和雙波長測量,雙波長測量即采用2個波長定性或定量分析溶液。與單波長測量相比,雙波長測量通過對溶液吸光度的比值計算,可有效減小比色皿加工誤差帶來的影響,成為了最常用的光譜分析方法。雙波長在測量溶液時需要2個溶液,依次對該溶液進(jìn)行2個波長的吸光度測試,由于每套系統(tǒng)測量的吸光度各有不同,故將2個溶液按稀釋比R配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。如式(4)所示,首先測量標(biāo)準(zhǔn)液在2個波長下的吸光度AS1、AS2;然后測量已知體積VD的稀釋液的吸光度AD1、AD2;最后通過移液器將體積VU的原液轉(zhuǎn)移至稀釋液中,混合后測量混合液在波長1下吸光度AU,移液器加入的溶液體積VU可由式(5)得出。光學(xué)法對實驗環(huán)境要求不高,受溶液蒸發(fā)影響小、對溶液蒸發(fā)處理方式更簡便,故實驗選用以雙波長測量為基礎(chǔ)設(shè)計超微容量測量系統(tǒng)。

(4)

(5)

式中:b1和b2為光透過溶液的光程;c1和c2分別為原液和稀釋液的濃度;K1和K2分別為標(biāo)準(zhǔn)液原液和稀釋液的摩爾吸光系數(shù)。

3.1 時域分光和空域分光

雙波長測量的微小容量測量實驗系統(tǒng),根據(jù)分光方式不同可分為時域分光和空域分光,光束在進(jìn)入樣品室前先對復(fù)色光源進(jìn)行分光處理的方式被稱為時域分光或前分光。復(fù)色光源在分光系統(tǒng)中由色散元件分光,分光后通過機械裝置控制分光元件的轉(zhuǎn)動角度將所需波長的光束入射至樣品溶液并由探測器進(jìn)行測量。時域分光方式實現(xiàn)了復(fù)色光源在時間域上的波長分離,波長可根據(jù)溶液的特性進(jìn)行調(diào)整?？沼蚍止夥ㄓ址Q為后分光,即復(fù)色光源先通過樣品室,將攜帶光強信號的光束經(jīng)分光系統(tǒng)處理后反射至探測器上進(jìn)行光譜分析?？沼蚍止庑鑼⑻綔y器與分光系統(tǒng)固定且探測器的安裝與色散元件的反射光路的方向保持一致,通過探測器對各個像元的信號采集,實現(xiàn)復(fù)色光源在空間域上全光譜分析。2種分光方式均能實現(xiàn)光譜測量,時域分光法對光源的穩(wěn)定性和波長重復(fù)性要求較高,但光電采集電路相對容易,空域分光法對于光學(xué)系統(tǒng)的要求較低,但探測器的驅(qū)動電路和信號分析電路較復(fù)雜。

3.1.1 色散元件

色散元件是光譜分析實驗中最核心的元件。當(dāng)前最常用的色散元件是光柵和棱鏡,2種分光元件的分光原理不同。棱鏡對不同波長的光具有不同的折射率,當(dāng)1束光以入射角θ1進(jìn)入三棱鏡后,不同波長的光會以不同的偏轉(zhuǎn)角θ2射出,實現(xiàn)波長分離;而光柵由于不同波長光的衍射角不同,將復(fù)色光源分離成多個單色光。光柵和棱鏡各有優(yōu)缺點,綜合比較分光元件的性能,反射光柵色散能力和波長分辨率要優(yōu)于棱鏡,且提高色散能力和波長分辨率的方法也更容易因此實驗基于光柵的色散原理結(jié)合C-T型光柵分光結(jié)構(gòu)來設(shè)計光學(xué)系統(tǒng)[10～12]。

3.1.2 光源

在光譜分析中常用的復(fù)色光源有氘燈、鎢燈和氙燈。氘燈多用于紫外光譜檢測,其波長范圍在190～400 nm。氙燈和鎢燈是可見光波段的常用光源[13,14]。由于實驗采用的雙波長測量所需的2個波長分別是520 nm和730 nm,故光源在鎢燈和氙燈之間選擇。而基于雙波長測量的超微容量測量系統(tǒng)中時域分光法需要來回調(diào)整2個波長,因此對于光源的穩(wěn)定性和波長的重復(fù)性要求較高,2種光學(xué)測量方法在經(jīng)過光柵分光處理后的復(fù)色光源能量較弱,每個波長攜帶的光譜信號不易采集,且在實驗過程中采用光纖作為連接件,將光源、分光系統(tǒng)、探測器等結(jié)構(gòu)元件串聯(lián)在一起,光信號在傳輸過程中容易發(fā)生光強損耗,因此需要對2個光源進(jìn)行性能測試,選擇合適的光源作為容量測量系統(tǒng)的實驗光源。

3.1.3 探測器

實驗需要將光信號轉(zhuǎn)化為電信號處理,常用的光電探測器有光電二極管、光電倍增管、線陣圖像傳感器等。時域分光模式的光信號是時間域上的波長分離,在光譜分析中普遍采用光電二極管和光電倍增管?？沼蚍止鈩t是將復(fù)色光在空間上分離成單色光可選用圖像傳感器作為探測器進(jìn)行吸光度實驗。

光電二極管是在光照射的情況下,光子攜帶能量進(jìn)入二極管的PN結(jié)中,把能量傳遞給共價鍵上的電子,部分電子得到能量可以掙脫共價鍵束縛形成光生載流子,光電二極管在光照下產(chǎn)生的光電流會隨光強發(fā)生變化[15]。通過檢測此電信號,可以得到入射光強的變化。光電倍增管主要基于外光電效應(yīng)[15],光陰極受到光照射時會激發(fā)出光電子,光電子經(jīng)過二次發(fā)射信號擴大,當(dāng)光強發(fā)生變化時信號也會相應(yīng)變化。

空域分光法的探測器主要有線陣、面陣圖像傳感器,如CCD、CMOS等。CCD傳感器的光電轉(zhuǎn)化主要基于光生伏特效應(yīng),即CCD受到光照時其MOS電容器內(nèi)部半導(dǎo)體或半導(dǎo)體和金屬結(jié)合的不同部位之間產(chǎn)生了電位差,在數(shù)據(jù)傳輸時每個像元將信號傳輸至底部后由放大器依次放大輸出[16]。CMOS中每個像元都有1個放大器,放大器對信號放大后進(jìn)行信號整合,這樣就可保證信號長距離傳輸時不失真。線陣圖像傳感器和面陣圖像傳感器的差異就是光敏元件排布的方式。線陣傳感器的感光元件呈線性排布;面陣傳感器內(nèi)部像元呈橫縱二維分布,橫縱像元均可讀取信號方便采集更多信息。

在光譜分析中時域分光法采集到的光信號微弱,可以采用光電倍增管進(jìn)行信號疊加,但同時增大噪聲的干擾,且與光電二極管相比,光電二極管的線性更好、壽命更長;空域分光法實現(xiàn)了全波段測量,CCD與CMOS相比,CMOS的每個像元都要搭配1個放大器,像元真正的感光區(qū)域要遠(yuǎn)小于像元本身,因而同像元尺寸的CMOS傳感器的靈敏度和分辨率普遍低于CCD傳感器,而且CMOS傳感器的放大器之間存在差異,會增大噪聲、影響圖像信號的完整性。實驗基于分光方法的特點和探測器的特性,分別選用光電二極管和線陣CCD作為時域和空域分光法光譜分析的傳感器。

3.2 光學(xué)系統(tǒng)性能分析

時域分光法對光源的穩(wěn)定性要求較高,需要對2種光源分別通過光纖與整個系統(tǒng)串聯(lián)進(jìn)行性能測試,選取20 W鎢燈和5 W氙燈接入系統(tǒng),通過光電傳感器檢測光強變化,在相同時間間隔內(nèi)采集光強信號數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)顯示鎢燈光源的穩(wěn)定性要高于氙燈,氙燈雖然在有限時間內(nèi)穩(wěn)定性在0.25%,但長時間測量發(fā)現(xiàn)氙燈波動范圍大。對比兩者數(shù)據(jù),探測器檢測到的氙燈光源數(shù)據(jù)偏小,增大了數(shù)據(jù)引入的不確定性;而20 W的鎢燈不僅穩(wěn)定性好、且經(jīng)過分光系統(tǒng)分光后的數(shù)據(jù)均在1 V左右,因此選擇鎢燈光源作為實驗光源能夠滿足實驗要求。同時將鎢燈光源經(jīng)過光柵分光后對系統(tǒng)的波長重復(fù)性進(jìn)行實驗,通過機械結(jié)構(gòu)旋轉(zhuǎn)光柵角度來控制2個光束的波長,實驗數(shù)據(jù)表明系統(tǒng)的波長重復(fù)性較好。

4 實驗與數(shù)據(jù)分析

本文采用蒸餾水為介質(zhì)的靜力衡量法和以時域分光和空域分光為原理的光學(xué)法進(jìn)行實驗,靜力衡量法使用的天平為XP26PC,在光學(xué)法中將光源、分光系統(tǒng)、樣品室、探測器分別按照時域分光和空域分光模式搭建系統(tǒng),系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖見圖1所示。

圖1 時域和空域分光測量系統(tǒng)Fig.1 Time domain optical and spatial spectral measurement system

將2套光學(xué)系統(tǒng)在同一環(huán)境中對標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行吸光度測試,測試數(shù)據(jù)如表1所示,數(shù)據(jù)顯示比色皿取放前后吸光度略有差異導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)液吸光度的比值也有所不同,空域分光測量系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)液比值穩(wěn)定性要差于時域分光測量系統(tǒng)。吸光度數(shù)據(jù)發(fā)生變化的主要原因和系統(tǒng)的穩(wěn)定性有關(guān),2套光學(xué)系統(tǒng)的穩(wěn)定性會受到光源本身、光電檢測系統(tǒng)噪聲以及樣品液的影響,已知光源通過時域分光測量系統(tǒng)測量的電壓數(shù)據(jù)在10 min內(nèi)并不會明顯發(fā)生波動,樣品液本身也沒有變質(zhì),因此綜上分析系統(tǒng)吸光度的變化主要來自于光電探測器的噪聲干擾。

表1 取放比色皿前后標(biāo)準(zhǔn)液吸光度比值A(chǔ)S1/AS2Tab.1 Absorbance ratio AS1/AS2 of standard solution before and after taking and placing the cuvette

探測器的噪聲可以通過采集多組數(shù)據(jù)并做均值化處理來減小干擾。因此將同一標(biāo)準(zhǔn)液放置在樣品室內(nèi)連續(xù)采集10次數(shù)據(jù)后做平均值,然后取出比色皿再放回重新記錄吸光度數(shù)據(jù),往復(fù)10次后標(biāo)準(zhǔn)液吸光度的比值如圖2所示,空域分光測量系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)液比值在均值化前后穩(wěn)定性有了較大改善。

均值化處理后,對時域分光、空域分光和靜力衡量3種測量法進(jìn)行微小容量測量,其中1 μL和10 μL的實驗測量數(shù)據(jù)如圖3和圖4所示,通過公式計算容量相對誤差和重復(fù)性,計算結(jié)果如表2所示。數(shù)據(jù)顯示靜力衡量法和光學(xué)法能獲得一致的結(jié)論,2套光學(xué)系統(tǒng)均能實現(xiàn)微小容量測量。

表2 光學(xué)法和靜力衡量法的相對誤差和重復(fù)性Tab.2 Relative error and repeatability of optical method and gravity method (%)

圖2 均值化處前后標(biāo)準(zhǔn)液的比值Fig.2 Ratio of standard solution before and after mean treatment

對比圖3和圖4兩種光學(xué)法在1 μL和10 μL測量數(shù)據(jù),空域分光測量系統(tǒng)的數(shù)據(jù)小于時域分光測量系統(tǒng)。同樣地,測試1支100 μL定點移液器,時域分光法測量的數(shù)據(jù)為101.39 μL,空域分光測量的數(shù)據(jù)為100.90 μL,時域分光測量數(shù)據(jù)依然大于空域分光測量數(shù)據(jù),其主要原因可能是空域分光系統(tǒng)的CCD探測器的靈敏度低于時域分光系統(tǒng)的探測器。為了進(jìn)行驗證,配制濃度為1.85 g/L的溶液并做0.5 μL超微容量測量實驗,測試1支經(jīng)過校準(zhǔn)的0.5 μL的移液器,實驗發(fā)現(xiàn)稀釋液在520 nm處的吸光度與加入0.5 μL原液后的混合液在520 nm處的吸光度相比,時域分光測量系統(tǒng)的吸光度響應(yīng)大于空域分光測量系統(tǒng),從同一溶液的容量數(shù)據(jù)看,時域分光測量的容量為0.42 μL,而空域分光測量的容量為0.26 μL,兩者數(shù)據(jù)差距較大且空域分光系統(tǒng)測量的數(shù)據(jù)超出了規(guī)程的容量允許誤差。因此,當(dāng)原液濃度較低并且做超微容量測量時,光電二極管和CCD相比,光電二極管的靈敏度更高,能夠采集更多的光強變化信息。

圖3 1 μL測量點測量數(shù)據(jù)Fig.3 Experiment data of 1 μL measuring point

圖4 10 μL測量點測量數(shù)據(jù)Fig.4 Experiment data of 10 μL measuring point

從表2的數(shù)據(jù)分析,2套光學(xué)測量系統(tǒng)的重復(fù)性差別較小,主要原因是對空域分光系統(tǒng)的測量數(shù)據(jù)進(jìn)行均值化處理。

圖5為200 μL測量點數(shù)據(jù),均值化處理前容量數(shù)據(jù)為197.819 μL,重復(fù)性為0.73%;均值化處理后容量數(shù)據(jù)為197.546 μL,重復(fù)性為0.41%,均值化的處理改善了系統(tǒng)的穩(wěn)定性,縮小了2套光學(xué)系統(tǒng)的重復(fù)性差距。

圖5 200 μL測量點數(shù)據(jù)Fig.5 200 μLmeasurement point data

5 總 結(jié)

通過實驗數(shù)據(jù)可得出以下結(jié)論:1)通過光學(xué)法對微小溶液進(jìn)行測量能夠計算出待測溶液的體積,在1 μL和10 μL測量實驗中,時域分光法測得數(shù)據(jù)為0.959 μL和9.976 μL,重復(fù)性為3.21%和2.54%;空域分光法測得數(shù)據(jù)為0.926 μL和9.729 μL,重復(fù)性為3.60%和2.02%;靜力衡量法測量數(shù)據(jù)為0.958 μL和10.005 μL,重復(fù)性為1.99%和0.98%。3種系統(tǒng)所得的相對誤差和重復(fù)性均滿足規(guī)程要求且結(jié)論一致,因此光學(xué)法和靜力衡量法均能測量超微溶液的容量;2)時域分光法測量的容量數(shù)據(jù)要大于空域分光法,但兩者的重復(fù)性并沒有明顯差距。主要是因為探測器的靈敏度更高,在低濃度下的超微容量測量能夠檢測更多信息;3)基于光學(xué)法的容量測量方法對環(huán)境的要求不高,在實驗操作中可有效減少容量蒸發(fā)帶來的影響,并與靜力衡量法相比,系統(tǒng)對溶液蒸發(fā)的處理方式更加簡單。