甲基蓮心堿對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-Rb1細(xì)胞增殖和侵襲的影響

潘學(xué)良，洪薇薇，趙海雁，鄭茜，王麗茹，張旭

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma，RB）約占兒童癌癥的3%，是嬰兒和兒童期最常見的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤，RB的典型癥狀是斜視或白斑。在發(fā)展中國家，RB 的死亡率約為70%[1-2]。迄今為止，RB 治療的困難在于其對化學(xué)療法的抵抗以及由于隱性的病理變化而導(dǎo)致的診斷延誤[3]。因此，迫切需要進(jìn)一步了解RB 發(fā)病的分子機(jī)制并研發(fā)新藥以改善臨床治療效果。甲基蓮心堿（neferine，Nef）是從蓮成熟種子中提取得到的一種雙芐基異喹啉生物堿。研究[4]表明，Nef 可以通過調(diào)控鋅指轉(zhuǎn)錄因子信號傳導(dǎo)發(fā)揮對肝癌細(xì)胞侵襲和奧美沙利鉑敏感性的影響。WANG L 等[5]報道，Nef 通過誘導(dǎo)線粒體功能障礙，抑制RB 增殖和侵襲能力。但Nef 對RB 的相關(guān)作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討Nef 對RB 細(xì)胞WERI-Rb1 增殖和侵襲能力的影響，以期為Nef臨床治療RB提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級4 周齡雌性無胸腺裸鼠20 只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK（京）2019-0071，用于異種移植模型。飼養(yǎng)光照/黑暗周期為12 h，維持（24±2）℃恒溫，濕度為55%～60%。所有裸鼠均可自由獲得水和食物。本研究實驗動物及實驗所用條件符合國家科學(xué)技術(shù)委員會的《實驗動物管理條例》相關(guān)規(guī)定。

1.2 試劑與儀器

RB細(xì)胞系WERI-Rb1細(xì)胞（美國典型培養(yǎng)物保藏中心）；Nef（四川省維克奇生物科技有限公司，wkq-00297）；胎牛血清（美國Sigma-Aldrich 公司，R8758、F8687）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（北京威格斯生物技術(shù)有限公司，T002）；細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67 抗原（Ki67）、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metallopeptidase-9，MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶-14（matrix metallopeptidase-14，MMP-14）、肌動蛋白（β-actin）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠免疫球蛋白G 二抗（英國Abcam 公司，ab254123、ab18197、ab38898、ab53712、ab5694、ab6721）。

奧林巴斯熒光顯微鏡（日本奧林巴斯，BX43）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Proteinsimple 公司，F(xiàn)luorChem HD2）；電泳槽、電轉(zhuǎn)儀（北京六一公司，DYCP-31C、DYCP-31CN）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)WERI-Rb1細(xì)胞，在37℃含5%CO2和95%濕空氣中孵育。

1.4 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤體外成瘤實驗

在小鼠右腋下區(qū)域皮下注射1×106個/mL 的WERI-RB1細(xì)胞0.3 mL，將其與高濃度人工基質(zhì)膠、培養(yǎng)基、20%胎牛血清混合。皮下注射WERI-Rb1細(xì)胞7 d 后，評估小鼠是否成功生成了移植腫瘤。將小鼠分為2組，每3 d腹腔注射2 mg/kg的Nef或等體積溶劑二甲基亞砜（20 mg/mL），持續(xù)30 d[6]。不知情的操作員每3 d 測量1 次腫瘤體積和體重。異種移植后30 d，收獲腫瘤以測量腫瘤重量并進(jìn)行免疫組織化學(xué)評估。

1.5 CCK-8法檢測WERI-Rb1細(xì)胞活力

將WERI-Rb1 細(xì)胞以1×105個/孔左右的密度接種于96 孔板中，每組3 個復(fù)孔，體積100 μL，培養(yǎng)24 h，分別用終濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μM 的Nef溶液處理細(xì)胞。在5%CO2和37℃條件下培養(yǎng)24 h后，每孔加入10μL的細(xì)胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）的試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后在酶聯(lián)免疫檢測儀中以490 nm測量各孔的吸光值。

1.6 BrdU染色檢測細(xì)胞增殖能力

運用5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxyuridinc，BrdU）試劑盒檢測WERI-Rb1 細(xì)胞的增殖能力。嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，在熒光顯微鏡下觀察BrdU陽性細(xì)胞的數(shù)量。

1.7 Transwell法檢測細(xì)胞克隆形成能力

Transwell 小室加入50μL 基質(zhì)膠并于37℃孵育3 h 凝固。將各處理組的細(xì)胞接種于Transwell 小室上室，其中上室為無血清培養(yǎng)基，下室為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，1%結(jié)晶紫染色后拍照。每組取3個隨機(jī)視野，計數(shù)視野中的染色細(xì)胞數(shù)目即為侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.8 免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織中Ki67、MMP-9陽性細(xì)胞數(shù)

腫瘤組織用4%福爾馬林固定，石蠟包埋，切成3μm厚的切片。脫蠟并水化后，用5%血清封閉1 h，分別與Ki67 一抗（鼠抗，稀釋比例1∶100）和MMP-9一抗（鼠抗，稀釋比例1∶100）共孵育過夜。切片洗滌3次，在室溫下與二抗（兔抗小鼠，稀釋比例1∶1,000）孵育30 min后，使用顯微鏡分析。

1.9 Western Blot 法檢測Ki67、PCNA、MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)水平

從WERI-Rb1 細(xì)胞和腫瘤組織勻漿中分別提取總蛋白（20 μg），經(jīng)凝膠、電泳和轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，與Ki67（稀釋比例1∶5,000）、PCNA（稀釋比例1∶1,000）、MMP-9（稀釋比例1∶1,000）、MMP-14（稀釋比 例1∶5,000）、Actin（稀釋 比例1∶1,000）一抗（均為鼠抗）在4℃下孵育過夜后，洗滌3 次，與二抗（兔抗小鼠，稀釋比例1∶10,000）孵育1 h，再次洗滌3次后進(jìn)行顯影。采用Image J分析內(nèi)參β-actin和目標(biāo)條帶的灰度值，目標(biāo)條帶蛋白水平=目標(biāo)條帶灰度值/β-actin灰度值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料，方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組變量間的相互比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗，多重性比較采用Duncan 法。當(dāng)P＜0.05 時，被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nef對WERI-Rb1細(xì)胞活力的影響

結(jié)果顯示，所有Nef劑量的細(xì)胞活力比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=110.856，P=0.000）。與Nef 0.5 μM比較，1.0、2.5μM的細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μM 的細(xì)胞活力均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t5.0=8.298，P=0.001；t10.0=11.354，t20.0=12.713，t40.0=16.228，t80.0=23.380，t160.0=23.765，均P=0.000）。根據(jù)CCK-8 實驗結(jié)果計算Nef 對RB 細(xì)胞的半抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值，IC50=10.092，選擇0、2.5、5.0、10.0μM 4個劑量進(jìn)行后續(xù)實驗（表1）。

表1 Nef對WERI-Rb1細(xì)胞生長的影響（，n=3）

表1 Nef對WERI-Rb1細(xì)胞生長的影響（，n=3）

注：*與0.5μM 組比較，P<0.05；Nef 甲基蓮心堿；WERI-RB1 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系

2.2 Nef對WERI-Rb1細(xì)胞增殖能力的影響

（1）4 組間陽性細(xì)胞數(shù)比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=39.503，P=0.000）。與0μM 組比較，2.5μM 組的陽性細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），5.0、10.0 μM 組的陽性細(xì)胞數(shù)均下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t5.0=5.857，P=0.004；t10.0=8.770，P=0.001）。與2.5μM 組比較，5.0、10.0μM 組陽性細(xì)胞數(shù)均下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t5.0=5.418，P=0.006；t10.0=8.511，P=0.001）。與5.0 μM 組比較，10.0 μM 組陽性細(xì)胞數(shù)下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.376，P=0.028）（圖1、表2）。

圖1 Nef對WERI-Rb1細(xì)胞增殖能力（BrdU染色，×400）

（2）4組間Ki67、PCNA 蛋白表達(dá)水平比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（FKi67=12.409，P=0.002；FPCNA=22.000，P=0.000）。與0 μM 組比較，2.5 μM 組的Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），5.0、10.0 μM 組的Ki67、PCNA 蛋白表達(dá)水平均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Ki67：t5.0=3.286，P=0.030；t10.0=5.060，P=0.007；PCNA：t5.0=6.059，P=0.004；t10.0=8.109，P=0.001）。與2.5μM 組比較，5.0、10.0 μM 組的Ki67、PCNA 蛋白表達(dá)水平均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Ki67：t5.0=2.895，P=0.044；t10.0=5.004，P=0.008；PCNA：t5.0=3.718，P=0.021；t10.0=5.143，P=0.007）。與5.0 μM 組比較，10.0 μM 組的Ki67 蛋白表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.257，P=0.013），10.0μM 組的PCNA 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖2、表2）。

表2 Nef對WERI-Rb1細(xì)胞增殖能力的影響（，n=3）

表2 Nef對WERI-Rb1細(xì)胞增殖能力的影響（，n=3）

注：*與0μM 組比較，P<0.05；#與2.5μM 組比較，P<0.05；&與5.0μM 組比較，P<0.05；Ki67 細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67 抗原；PCNA 增殖細(xì)胞核抗原；Actin 肌動蛋白；Nef 甲基蓮心堿；WERI-Rb1 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系

圖2 Nef對WERI-Rb1細(xì)胞中Ki67和PCNA表達(dá)水平的影響

2.3 Nef對WERI-Rb1細(xì)胞侵襲能力的影響

（1）4 組間細(xì)胞侵襲數(shù)目比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=54.167，P=0.000）。與Nef 0μM 組比較，2.5μM 組的細(xì)胞侵襲數(shù)目，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），5.0、10.0μM 組的細(xì)胞侵襲數(shù)目均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t5.0=7.203，P=0.002；t10.0=10.847，P=0.000）。與2.5μM 組比較，5.0、10.0μM 組的細(xì)胞侵襲數(shù)目均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t5.0=5.320，P=0.006；t10.0=9.547，P=0.000）。與5.0μM組比較，10.0μM組的細(xì)胞侵襲數(shù)目降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.109，P=0.007）（圖3、表3）。

圖3 Nef對WERI-Rb1細(xì)胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色，×400）

（2）4 組間MMP-9、MMP-14 蛋白表達(dá)水平比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（FMMP-9=16.800，P=0.000；FMMP-14=8.071，P=0.008）。與Nef 0μM組比較，2.5μM組的MMP-9、MMP-14 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），5.0μM 組的MMP-9 蛋白表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.323，P=0.012），5.0 μM 組的MMP-14 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），10.0 μM 組的MMP-9、MMP-14 蛋白表達(dá)水平均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（tMMP-9=8.216，P=0.001；tMMP-14=5.051，P=0.007）。與Nef 2.5μM組比較，5.0 μM 組的MMP-9、MMP-14 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），10.0 μM 組的MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（tMMP-9=4.621，P=0.010；tMMP-14=3.781，P=0.019）。與5.0 μM 組比較，10.0 μM 組的MMP-9 蛋白表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.648，P=0.010），10.0μM 組的MMP-14 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖4、表3）。

圖4 Nef對WERI-Rb1細(xì)胞中MMP-9和MMP-14的表達(dá)水平的影響

表3 Nef對WERI-Rb1細(xì)胞侵襲能力的影響（，n=3）

表3 Nef對WERI-Rb1細(xì)胞侵襲能力的影響（，n=3）

注：*與0μM 組比較，P<0.05；#與2.5μM 組比較，P<0.05；&與5.0μM組比較，P<0.05；MMP-9 基質(zhì)金屬蛋白酶-9；MMP-14 基質(zhì)金屬蛋白酶-14；Nef 甲基蓮心堿；WERI-Rb1 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系

2.4 Nef 對裸鼠移植瘤重量、體積和Ki67、MMP-9陽性細(xì)胞數(shù)的影響

4組間第30d的腫瘤重量、體積比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F重量=68.933，F(xiàn)體積=135.739，均P=0.000）。與Nef 0 mg/kg 組比較，0.5 mg/kg 組的腫瘤重量、體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），1.0、2.0 mg/kg 組的腫瘤重量、體積均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（重量：t1.0=6.261，t2.0=12.969，均P=0.000；體積：t1.0=10.023，t2.0=18.952，均P=0.000）。與Nef 0.5 mg/kg組比較，1.0、2.0 mg/kg組的腫瘤重量、體積均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（重量：t1.0=4.919，P=0.001；t2.0=11.628，P=0.000。體 積：t1.0=7.871，t2.0=16.129，均P=0.000）。與Nef1.0mg/kg組比較，2.0mg/kg組的腫瘤重量、體積均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（重量：t=7.906，體積：t=11.207，均P=0.000）（圖5、表4）。

表4 Nef對裸鼠移植瘤裸鼠腫瘤體積的影響（，n=5）

表4 Nef對裸鼠移植瘤裸鼠腫瘤體積的影響（，n=5）

注：*與0 mg/kg組比較，P<0.05；#與0.5 mg/kg組比較，P<0.05；&與1.0 mg/kg組比較，P<0.05；Nef 甲基蓮心堿

圖5 Nef對裸鼠移植瘤重量、體積的影響

4 組間Ki67、MMP-9 陽性細(xì)胞數(shù)比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（FKi67=26.988，F(xiàn)MMP-9=57.780，均P=0.000）。與Nef 0 mg/kg組比較，0.5 mg/kg組的Ki67、MMP-9 陽性細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），1.0、2.0 mg/kg 組的Ki67、MMP-9 陽性細(xì)胞數(shù)均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Ki67：t1.0=5.599，P=0.001；t2.0=8.188，P=0.000。MMP-9：t1.0=13.461，t2.0=19.931，均P=0.000）。與Nef 0.5 mg/kg 組比較，1.0、2.0 mg/kg 組的Ki67、MMP-9 陽性細(xì)胞數(shù)均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Ki67：t1.0=3.603，P=0.007；t2.0=6.305，P=0.000。MMP-9：t1.0=4.254，P=0.003；t2.0=7.106，P=0.000）。與Nef 1.0 mg/kg組比較，2.0 mg/kg組的Ki67、MMP-9陽性細(xì)胞數(shù)均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（tKi67=2.525，P=0.036；tMMP-9=9.060，P=0.000）（圖6、圖7、表5）。

表5 Nef 對裸鼠移植瘤腫瘤重量和Ki67、MMP-9 陽性細(xì)胞數(shù)的影響（，n=5）

表5 Nef 對裸鼠移植瘤腫瘤重量和Ki67、MMP-9 陽性細(xì)胞數(shù)的影響（，n=5）

注：*與0 mg/kg 組比較，P<0.05；#與0.5 mg/kg 組比較，P<0.05；&與1.0 mg/kg 組比較，P<0.05；Ki67 細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67 抗原；MMP-9 基質(zhì)金屬蛋白酶-9；Nef 甲基蓮心堿

圖6 Nef對裸鼠移植瘤Ki67陽性細(xì)胞數(shù)的影響（免疫組織化學(xué)染色，×400）

圖7 Nef對裸鼠移植瘤MMP-9陽性細(xì)胞數(shù)的影響（免疫組織化學(xué)染色，×400）

3 討論

RB 腫瘤的形成通常始于RB 抑癌基因RB1 的2 個等位基因的突變，然后是與臨床階段和病理結(jié)果相關(guān)的一系列其他遺傳改變[6]。由于化學(xué)療法的強(qiáng)副作用，天然產(chǎn)物療法已成為輔助治療癌癥和其他疾病的新策略。最近，大量研究[7-9]表明，中藥不僅可以預(yù)防和減少化學(xué)療法的毒性和副作用，而且可以提高各種癌癥患者的抗病能力，并有助于殺死癌細(xì)胞。以往研究[10-12]表明，Nef 具有抗心律失常，抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)和抗癌等藥理作用，近年來其對腫瘤的潛在防治作用越來越被人們關(guān)注。本研究結(jié)果顯示，Nef在體外實驗可以抑制WERI-Rb-1 增殖和侵襲；在體內(nèi)實驗Nef 可以抑制腫瘤生長，抑制Ki67和MMP-9表達(dá)。因此推測Nef抑制RB 在體外和體內(nèi)的增殖和侵襲。

腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲是導(dǎo)致腫瘤快速增長和蔓延的主要原因，因此，控制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲是控制腫瘤發(fā)展和蔓延的重要手段。XUE F 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Nef 可以通過上調(diào)miR-449a 抑制胃腸道間質(zhì)瘤GIST-T1細(xì)胞系的增殖和遷移。在本研究中首先篩選了Nef 處理WERI-Rb-1 細(xì)胞的最佳濃度，選擇2.5、5.0、10.0 μM 4 個劑量進(jìn)行后續(xù)實驗。通過BrdU 染色和Transwell 實驗，經(jīng)不同濃度Nef 處理后，WERI-Rb-1細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞侵襲數(shù)目均降低，提示Nef 可抑制WERI-Rb-1 細(xì)胞增殖和侵襲。

Ki67 與PCNA 均為細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白，與多種惡性腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)。彭斌等[14]研究發(fā)現(xiàn)Ki67與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的臨床分期呈正相關(guān)，且Ki67增殖指數(shù)與腫瘤大小呈正相關(guān)，是評估細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)。YANG L 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Nef 通過下調(diào)Ki67、PCNA 表達(dá)對2,2-二羥甲基丁酸誘導(dǎo)乳腺癌具有抗增殖特性。基質(zhì)金屬蛋白酶參與細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解，在惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。MMP-9 與MMP-14 在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中異常高表達(dá)，通過藥物或基因工程的方法抑制MMP-9 表達(dá)可減少視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤遷移及侵襲水平[16-17]。萬朋等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Nef 通過下調(diào)MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。為了進(jìn)一步探究Nef處理對WERIRb-1細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用，本研究檢測了增殖和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)，通過Western Blot 實驗，經(jīng)不同濃度Nef處理后，WERI-Rb-1細(xì)胞Ki67、PCNA、MMP-9與MMP-14 蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，提示Nef 可抑制增殖和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)。隨后進(jìn)一步研究了體內(nèi)Nef 對RB 腫瘤形成的影響，結(jié)果表明，Nef 處理可抑制體內(nèi)腫瘤的生長，降低腫瘤重量，減小腫瘤體積。這些結(jié)果表明，在體內(nèi)實驗中Nef可抑制RB細(xì)胞WERI-Rb1生長。

綜上所述，在體外實驗中Nef 可抑制WERIRb1 細(xì)胞的增殖和侵襲，并下調(diào)Ki67、PCNA、MMP-9 與MMP-14 蛋白表達(dá)；在體內(nèi)實驗中Nef可抑制腫瘤的形成，并下調(diào)Ki67 和MMP-9 蛋白的表達(dá)，這些研究結(jié)果可以為RB 的治療提供新的思路和理論依據(jù)。