miR-367-3p靶向ZEB2抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲生物學(xué)功能研究

蘇延軍 張華

肺癌是臨床上最為常見的惡性腫瘤，而非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占整體肺癌發(fā)病率的80%左右[1]。流行病學(xué)研究[2,3]顯示，肺癌在男性發(fā)病率為第一位，女性為第二位。在所有腫瘤導(dǎo)致的死亡原因中，無論男性和女性，肺癌均為第一位的腫瘤相關(guān)死亡原因[2]。然而，NSCLC的確切發(fā)病原因、侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為及其分子機(jī)制并未完全闡明。然而，越來越多的研究[4-6]顯示微小RNA（microRNA）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移和表觀遺傳領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。

miR-367-3p的前體為hsa-miR-367，定位于人4號(hào)染色體chr4:112647874-112647941[7]。近年來研究[8,9]顯示miR-367-3p在人多種腫瘤中存在差異表達(dá)，并參與腫瘤細(xì)胞的惡性表型。然而，miR-367-3p在NSCLC中的研究報(bào)道較少，其生物學(xué)功能及相關(guān)分子機(jī)制不明。

1 資料與方法

1.1肺癌患者及健康查體者選取22例NSCLC患者的組織樣本和配對正常肺組織為研究對象。同時(shí)選取22例健康查體者，留取外周靜脈血。NSCLC患者納入標(biāo)準(zhǔn)：NSCLC明確病理學(xué)診斷且接受手術(shù)治療者。相關(guān)影像學(xué)檢查除外遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。排除標(biāo)準(zhǔn)：小細(xì)胞肺癌患者；接受新輔助放化療或免疫治療者。切除的肺癌組織均經(jīng)過天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科驗(yàn)證為NSCLC。所有肺癌組織存放在液氮中冷凍，并儲(chǔ)存于-80oC冰箱，直到RNA提取。22例NSCLC患者年齡46歲-74歲，平均年齡（59.3±16.2）歲，男性14例，女性8例；腺癌13例，鱗癌9例。

1.2Real-time PCR試驗(yàn)采用RNA提取試劑盒，提取上述組織和血液學(xué)標(biāo)本中的總RNA，采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用Real-time PCR法檢測miR-367-3p和鋅指e-box-binding同源盒2（Zinc finger E-box binding homeobox 2, ZEB2）相對表達(dá)水平，引物序列見表1。反應(yīng)體系和條件如下，按20 μL體系進(jìn)行基因表達(dá)水平檢測：SYBR premix 10 μL，GAPDH上游引物或miR-367-3p上游引物1 μL；GAPDH下游引物或miR-367-3p下游引物1 μL；cDNA 1 μL，滅菌去離子水8 μL。擴(kuò)增條件為：95oC、5 min；95oC、30 s，58oC、30 s，72oC、30 s，循環(huán)40次；72oC、10 min。以 2-ΔΔCt（Ct為循環(huán)閾值）法來表示Real-time PCR結(jié)果的相對表達(dá)量。

表 1 miR-367-3p表達(dá)水平檢測Real-time PCR引物Tab 1 Primer of miR-367-3p detected by Real-time PCR

1.3轉(zhuǎn)染外源性miR-367-3p培養(yǎng)A549細(xì)胞，應(yīng)用RMPI-1640+10%FBS完全培養(yǎng)基，置于37oC培養(yǎng)。細(xì)胞傳代兩次至生長狀態(tài)良好后，消化細(xì)胞形成細(xì)胞懸液，包含細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)，輕輕搖動(dòng)6孔板，細(xì)胞混合均勻后，繼續(xù)培養(yǎng)。待生長3 d后，開始進(jìn)行轉(zhuǎn)染。miR-367-3p模擬物及無義對照序列（miR-NC）均委托蘇州吉瑪基因股份有限公司合成。采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法按試劑盒說明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染設(shè)置4組：空白對照組（細(xì)胞未經(jīng)處理）、Mock組（細(xì)胞中僅加入轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000模擬轉(zhuǎn)染過程）、NC組（細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC無義序列，作為miR-367-3p陰性對照）、實(shí)驗(yàn)組（細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-367-3p模擬物）。

1.4MTT試驗(yàn)消化培養(yǎng)瓶中的A549細(xì)胞，吹散并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL，向96孔板中每孔加入200 μL細(xì)胞懸液，即2,000個(gè)細(xì)胞/孔。待細(xì)胞密度至70%，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染設(shè)置4組，每組設(shè)置6個(gè)副孔，分別為空白對照組、Mock、NC和實(shí)驗(yàn)組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后，更換新的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)分別于轉(zhuǎn)染0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后，棄去各孔培養(yǎng)基，PBS清洗3次，加入200 μL新鮮完全培養(yǎng)基，并加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續(xù)將培養(yǎng)板置于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，4 h后棄去上清，每孔加入150 μL DMSO，結(jié)晶物溶解后，測量OD490 nm吸光值，上機(jī)時(shí)設(shè)置調(diào)零孔。以時(shí)間梯度為橫坐標(biāo)（X軸），吸光值為縱坐標(biāo)（Y軸）繪制曲線圖。

1.5Transwell試驗(yàn)消化培養(yǎng)瓶中的A549細(xì)胞，吹散并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL，向24孔Transwell板中上室每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，即5×104個(gè)細(xì)胞/孔，下室加入600 μL完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞密度至70%，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后，更換新的完全培養(yǎng)基，置于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，棄去上室培養(yǎng)基，刮去上室膜上貼壁細(xì)胞，PBS清洗3次，甲醇固定30 min，將小室晾干后，用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS清洗3次，顯微鏡下隨機(jī)觀察9個(gè)視野細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。

1.6Western blot試驗(yàn) 提取細(xì)胞中的總蛋白，分別進(jìn)行制膠、垂直電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等操作。然后進(jìn)行一抗孵育：配制一抗溶液各4 mL并加入孵育盒中，4oC過夜。二抗孵育：回收一抗溶液，配制辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠的二抗溶液，注入孵育盒中，于常溫慢搖1 h。孵育結(jié)束后漂洗NC膜3次，曝光及蛋白條帶分析。

1.7生物信息分析microRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫Targetscan（http://www.targetscan.org/vert_72/）和StarBase（http://starbase.sysu.edu.cn/starbase2/）對miR-367-3p下游靶基因進(jìn)行預(yù)測。癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）數(shù)據(jù)庫中（https://www.cancer.gov/），根據(jù)ZEB2中位表達(dá)水平，將NSCLC患者分為ZEB2高表達(dá)組（腫瘤組織中ZEB2表達(dá)≥中位表達(dá)水平）和低表達(dá)組，采用Log-rank檢驗(yàn)比較高低標(biāo)的組NSCLC患者無疾病進(jìn)展生存（disease free survival, DFS）和總生存（overall survival, OS）有無差異。TIMER數(shù)據(jù)庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析ZEB2基于表達(dá)與NSCLC免疫細(xì)胞浸潤情況。

2 結(jié)果

2.1miR-367-3p在NSCLC患者及健康者中的表達(dá)水平比較應(yīng)用RT-PCR方法檢測22例患者癌組織和正常組織中的miR-367-3p表達(dá)水平，結(jié)果表明癌組織中miR-367-3p表達(dá)水平是明顯低于正常組織（圖1A），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明肺組織中miR-367-3p的低表達(dá)可能與肺癌發(fā)生具有一定的相關(guān)性。22例肺癌患者血清和22例健康人血清中的miR-367-3p表達(dá)水平表明肺癌患者血清中miR-367-3p表達(dá)水平明顯低于健康人（圖1B），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明外周血清中miR-367-3p的低表達(dá)與肺癌發(fā)生具有一定的相關(guān)性。

2.2miR-367-3p診斷NSCLC的臨床價(jià)值分別以組織和血清中miR-367-3p的相對表達(dá)水平為參考，診斷NSCLC受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線下面積分別為0.95（95%CI: 0.89-1.00）和0.85（95%CI: 0.74-0.97），見圖2。

2.3miR-367-3p在細(xì)胞系中的表達(dá)水平分析miR-367-3p在A549細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著低于正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B（P＜0.05）（圖3A）；轉(zhuǎn)染外源性miR-367-3p后，實(shí)驗(yàn)組miR-367-3p mRNA表達(dá)水平明顯高于空白對照組、Mock組和NC組（圖3B）（P＜0.05）。

2.4上調(diào)miR-367-3p表達(dá)后肺癌細(xì)胞增殖能力減低MTT結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力明顯低于空白對照組、Mock組和NC組（圖4），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明miR-367-3p模擬物可明顯抑制A549肺癌細(xì)胞的增殖能力，其抑制能力與時(shí)間梯度呈正相關(guān)。

2.5上調(diào)miR-367-3p后肺癌細(xì)胞侵襲能力減低Transwell結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞遷移數(shù)量明顯低于空白對照組、Mock組和NC組（圖5），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明轉(zhuǎn)染miR-367-3p模擬物可明顯抑制A549細(xì)胞的遷移能力。

2.6miR-367-3p靶基因預(yù)測及表達(dá)水平分析microRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫Targetscan和StarBase對miR-367-3p下游靶基因進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示ZEB2基因于miR-367-3p的3’UTR特異性結(jié)合，提示ZEB2可能為miR-367-3p的靶基因。實(shí)驗(yàn)組ZEB2蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對照組、Mock組和NC組（圖6），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明miR-367-3p模擬物可調(diào)節(jié)ZEB2蛋白的表達(dá)水平。

圖 1 miR-367-3p在組織和血清中表達(dá)水平比較。A：miR-367-3p在NSCLC患者癌組織和癌旁組織中的表達(dá)比較；B：miR-367-3p在NSCLC患者和健康查體者血清中的比較。Fig 1 Comparison of miR-367-3p expression in tissues and serum. A: comparison of miR-367-3p expression in cancer tissues and adjacent tissues of NSCLC patients; B: comparison of miR-367-3p expression in serum of NSCLC patients and healthy subjects. NSCLC:non-small cell lung cancer.

圖 2 miR-367-3p診斷NSCLC的ROC曲線。A: 組織; B:血清。Fig 2 ROC curve of miR-367-3p in diagnosis of NSCLC. A: tissue; B: serum. ROC: receiver operating characteristic.

圖 3 miR-367-3p在細(xì)胞系中的表達(dá)水平。A: miR-367-3p在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B中的表達(dá)；B: miR-367-3p在經(jīng)不同處理的A549細(xì)胞中的表達(dá)。Fig 3 Expression level of miR-367-3p in cell lines. A: Expression of miR-367-3p in lung cancer cell line A549 and normal bronchial epithelial cell line BEAS-2B; B: Expression of miR-367-3p in A549 cells after different treatments. *P＜0.05.

圖 4 過表達(dá)miR-367-3p后肺癌細(xì)胞增殖能力變化Fig 4 Changes in proliferation of lung cancer cells after overexpression of miR-367-3p

2.7miR-367-3p靶基因ZEB2表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后TCGA數(shù)據(jù)庫中（https://www.cancer.gov/），根據(jù)ZEB2中位表達(dá)水平，將NSCLC患者分為ZEB2高表達(dá)組（腫瘤組織中ZEB2表達(dá)≥中位表達(dá)水平）和低表達(dá)組，采用Logrank檢驗(yàn)比較高低標(biāo)的組NSCLC患者DFS和OS有無差異。結(jié)果顯示，ZEB2高表達(dá)組NSCLC患者OS和DFS與低表達(dá)組NSCLC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但高表達(dá)組顯示出了OS及DFS降低的趨勢，圖7。

圖 5 過表達(dá)miR-367-3p后肺癌細(xì)胞侵襲能力。A：空白組；B：Mock組；C：NC組；D：試驗(yàn)組；E：侵襲能力柱狀圖。Fig 5 Invasion ability of lung cancer cells after overexpression of miR-367-3p. A: blank group; B: Mock group; C: NC group; D:experimental group; E: invasiveness histogram.

圖 6 miR-367-3p靶基因ZEB2表達(dá)水平分析。A：ZEB2在不同處理A549細(xì)胞中的mRNA表達(dá)情況；B：ZEB2在不同處理A549細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況。Fig 6 Expression of miR-367-3p target gene ZEB2. A: mRNA expression of ZEB2 in A549 cells in different groups; B: Protein expression of ZEB2 in A549 cells in different groups. *P＜0.05.

2.8ZEB2表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤 TIMER數(shù)據(jù)庫中分析ZEB2基于表達(dá)與NSCLC免疫細(xì)胞浸潤情況，ZEB2表達(dá)與B淋巴細(xì)胞（r=0.32,P＜0.05）、CD8+T細(xì)胞（r=0.44,P＜0.05）CD4+T細(xì)胞（r=0.46,P＜0.05）、巨噬細(xì)胞（r=0.65,P＜0.05）、中性粒細(xì)胞（r=0.73,P＜0.05）和樹突狀細(xì)胞（r=0.71,P＜0.05）浸潤均存在正向關(guān)系。

3 討論

本研究采用生物信息分析聯(lián)合細(xì)胞分子實(shí)驗(yàn)探討微小RNA在肺癌的發(fā)生發(fā)展及生物學(xué)表型中發(fā)揮重要作用。分析miR-367-3p在NSCLC患者中的表達(dá)及其對NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。研究中我們通過檢測NSCLC患者及健康查體者癌組織、癌旁肺組織、血清中miR-367-3p的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者癌組織miR-367-3p水平顯著低于癌旁組織，而NSCLC患者血清中miR-367-3p水平顯著低于健康查體者。進(jìn)一步細(xì)胞系中也發(fā)現(xiàn)，miR-367-3p在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中的表達(dá)水平顯著低于正常支氣管上皮細(xì)胞。上述結(jié)果在人體組織、血液及細(xì)胞系中均證實(shí)miR-367-3p在NSCLC中表達(dá)下調(diào)。同時(shí)已發(fā)表的文獻(xiàn)也證實(shí)，在大多數(shù)腫瘤中，miR-367-3p表達(dá)下降，這些腫瘤包括胃癌、宮頸癌和睪丸生殖細(xì)胞腫瘤等[10-12]。

進(jìn)一步的生物學(xué)功能研究顯示，上調(diào)肺癌細(xì)胞株A549中miR-367-3p的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖和遷移能力均明顯降低。提示miR-367-3p可能通過參與細(xì)胞增殖和侵襲相關(guān)信號(hào)通路，影響A549細(xì)胞的增殖和遷移能力改變。國內(nèi)杜寧等[13]探討miR-367-3p在NSCLC組織中的表達(dá)及對細(xì)胞功能的影響，通過檢測NSCLC組織中miR-367-3p的水平，也證實(shí)其在癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，與本研究結(jié)果一致。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，miR-367-3p可能通過靶向下游FBXW7的表達(dá)，而影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期[14]。在本研究中，我們通過生物信息分析，預(yù)測了miR-367-3p與ZEB2基因mRNA能特異性結(jié)合，提示ZEB2為其下游靶基因。進(jìn)一步的分析顯示，上調(diào)miR-367-3p表達(dá)后，A549細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯降低，而上調(diào)miR-367-3p后ZEB2基因mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低，進(jìn)一步提示miR-367-3p可能通過靶向ZEB2基因表達(dá)而發(fā)揮生物學(xué)功能。

同時(shí)，我們選取TCGA數(shù)據(jù)庫中NSCLC患者的預(yù)后資料作為研究對象，分析ZEB2基因表達(dá)水平與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果雖然顯示ZEB2高表達(dá)組NSCLC患者OS和DFS與低表達(dá)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但高表達(dá)組顯示出了OS及DFS降低的趨勢。因此，我們研究結(jié)果顯示，miR-367-3p在NSCLC患者中表達(dá)下調(diào)，并通過靶向ZEB2基因參與NSCLC的增殖和侵襲生物學(xué)過程，提示miR-367-3p可能成為NSCLC患者靶向治療和靶向藥物研發(fā)的新靶點(diǎn)[15]。

Author contributions

Su YJ conceived and designed the study. Zhang H performed the experiments. Su YJ and Zhang H analyzed the data. Su YJ and Zhang H provided critical inputs on design,analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.