投喂頻率對雜交鯛及黑鯛的體成分、血清生化及基因表達的影響

孫瑞健 ，仇玉燕 ，2，楊志強 ，倪可雯 ，2，徐大鳳 ，于雯雯 ，劉艷麗 ，肖李霞 ，陳淑吟 *

（1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007；2.上海海洋大學水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；3.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017；4.啟東市漁業(yè)技術(shù)推廣站，江蘇 啟東 226213）

適宜的投喂頻率不僅可以促進魚的健康生長，降低規(guī)格差異，還可以節(jié)約飼料，改善水質(zhì)[1-3]。通過檢測魚體健康相關(guān)指標，可以了解設置的投喂頻率是否適宜。文獻[4]研究表明，魚體的營養(yǎng)狀況、健康水平以及生理代謝等情況，可以通過體成分與血清生化指標來反映；文獻[5-6]指出，投喂頻率對魚類的體成分和血清生化指標等有顯著影響。如投喂次數(shù)從每日1 次增加至4 次，條石鯛（Oplegnathus fasciatus）幼魚的粗脂肪含量顯著升高8.8%，而灰分含量顯著降低11.8%[7]；牙鲆（Paralichthys olivaceus）幼魚每天投喂3 次較每2 d投喂1 次的粗蛋白和粗脂肪含量分別升高10.6%和 87.5%[8]；花鱸（Lateolabrax maculatus）幼魚的水分含量隨著投喂次數(shù)的升高而降低[9]。團頭魴（Megalobrama amblycephala） 在每日投喂 3~4 次時，血液溶菌酶含量升高[10]；饑餓狀態(tài)會導致黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）幼魚血清總蛋白含量顯著升高[11]。另外，與魚體營養(yǎng)及能量需求相關(guān)功能基因也受到投喂頻率的影響[12]。當投喂頻率從每日2 次升至4 次時，中華鱘（Acipenser sinensis）幼魚肝臟ghr 基因表達量顯著降低，igf1 表達量顯著升高[13]；每日投喂 4 次，黃顙魚（P. fulvidraco）幼魚的肝臟lpl[14]及sod[15]基因表達量均顯著高于只投喂1 次的。

雜交鯛為選育的新品系，是以黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）（♀）×真鯛（Pagrus major）（♂）的雜交子一代為親本獲得的雜交子二代，其在早期發(fā)育階段，已表現(xiàn)出了明顯的生長優(yōu)勢[16]，是生長性能好、抗逆性強的潛力品種之一。從前期研究中，已了解雜交鯛與黑鯛的最佳投喂頻次，雜交鯛相對具有更優(yōu)的生長性能[1]。現(xiàn)分析比較投喂頻率對雜交鯛和黑鯛的體成分、血清生化及基因表達等影響，深入了解投喂頻率對其影響的機制，擬為其個性化投喂管理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗魚來源

試驗魚為江蘇省海水增養(yǎng)殖技術(shù)及種苗中心繁育的健康幼魚。隨機抽取規(guī)格一致的個體進行試驗，其中雜交鯛體質(zhì)量（6.42±0.14）g，體長（5.70±0.11）cm；黑鯛體質(zhì)量（6.52±0.23）g，體長（5.86±0.14）cm。

1.2 試驗設計

試驗前，將試驗魚暫養(yǎng)1 周。共設置4 個投喂頻率組（1~4 次/d，簡稱 1 T—4 T）。相同投喂頻率的2 種魚，飼養(yǎng)于同一室內(nèi)水泥池不同網(wǎng)箱中，網(wǎng)箱尺寸為1.0 m×1.0 m×1.2 m，3 個網(wǎng)箱并排為 1 組（即3 個試驗重復），2 種魚放養(yǎng)密度均為60 尾/網(wǎng)箱。各試驗組投喂及日常管理方法一致。投喂頻率和投喂時間見表1。飽食投喂粗蛋白≥40.0%的海水魚配合飼料，飼料粒徑大小依魚體生長過程而調(diào)整。試驗期間，水質(zhì)因子采用在線探頭監(jiān)測，水溫22~29 ℃，pH 值 7.5~8.2，鹽度 2.9%~3.0%，ρ（氨氮）<0.2 mg/L。24 h 持續(xù)充氣，水中 ρ（溶解氧）大于6.0 mg/L。每日換水1 次，日換水量為池水量的50%~80%，自然光照。

表1 雜交鯛及黑鯛的投喂頻率和投喂時間

1.3 樣品采集與指標測定

養(yǎng)殖40 d 后，試驗魚停止投喂24 h 后開始取樣。取樣時，從每個網(wǎng)箱里隨機各抽取6 尾魚，于魚尾靜脈取血，4 ℃冰箱靜置 12 h 后，4 ℃、4 500 r/min離心20 min，取血清于-80 ℃保存?zhèn)溆?；快速解剖，取肝臟、肌肉等組織速凍于液氮中，后置于-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.3.1 體成分測定

取肌肉測定體成分。粗脂肪（crude fat, EE）、粗蛋白（crude protein, CP）、水分（moisture）、灰分（ash）等分別按《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》（GB 5009.6—2016）《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》（GB 5009.5—2016）《食品安全國家標準食品中水分的測定》（GB 5009.3—2016）《食品安全國家標準食品中灰分的測定》（GB 5009.4—2016）進行測定。

1.3.2 血清生化指標測定

取血清測定血清生化指標。皮質(zhì)醇（cortisol,COR）、總膽固醇（total-cholesterol, TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）、總蛋白（total protein,TP）、溶菌酶（lysozyme,LZM）活性均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進行測定。

1.3.3 基因表達量測定

取肝臟組織用于測定相關(guān)基因表達量。使用Trizol 法提取雜交鯛及黑鯛肝臟組織總RNA，采用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa, #RR047A）反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并置于-20 ℃保存待用。根據(jù)黑鯛基因組中的相關(guān)基因序列，應用Primer 5.0軟件設計特異性引物，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列見表2。采用SYBR Green 熒光嵌合法，利用BIO-RAD CFX ConnectTM熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)，進行實時熒光定量PCR擴增反應，反應程序為：95 ℃預變性3 min；循環(huán)條件：95 ℃變性 10 s，55 ℃退火 20 s，72 ℃延伸20 s，75 ℃最后延伸 5 s，共進行 40 個循環(huán)。反應完成后繪制熔解曲線，熔解反應條件為：65~95 ℃，每5 s 升溫0.5 ℃。選取actin作為內(nèi)參基因，對各組織樣本進行標準化，采用2-ΔΔCt 法進行計算基因相對表達量。

表2 實時定量PCR 引物

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應用Excel 2019 和SPSS.22 統(tǒng)計軟件分析試驗數(shù)據(jù)，結(jié)果以“平均值±標準誤（mean±SE）”表示，差異顯著（P<0.05）時，再采用Duncan 法，進行組間差異的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交鯛及黑鯛體成分的變化差異

由體成分檢測結(jié)果得出，同一投喂頻率的2 種魚的各個體成分指標均無顯著差異（P>0.05），見表3。隨著投喂頻率的升高，雜交鯛和黑鯛的粗脂肪含量呈升高的趨勢，且1 T 組顯著低于4 T 組（P<0.05）；而魚體的水分含量呈降低的趨勢，1 T 組顯著高于4 T 組（P<0.05）。投喂頻率對 2 種魚的粗蛋白、灰分含量均無顯著影響（P>0.05）。

表3 不同投喂頻率下雜交鯛及黑鯛體成分的變化差異① %

2.2 雜交鯛及黑鯛血清生化指標的變化差異

血清生化檢測結(jié)果表明，隨著投喂頻率的升高，雜交鯛的TC 及黑鯛的TC、TG 含量也逐漸升高，1 T組顯著低于 4 T 組（P<0.05），但與 2 T、3 T 組間無顯著差異（P>0.05）。雜交鯛和黑鯛的TP 隨著投喂頻率的升高呈先升高后降低的趨勢，2 T 組顯著高于 4 T 組（P<0.05）。雜交鯛在 4 T 組的 TC、TG 含量顯著低于黑鯛（P<0.05），見圖1。此外，皮質(zhì)醇和溶菌酶指標，不因魚種及投喂頻率的不同而變化。

圖1 不同投喂頻率下雜交鯛及黑鯛血清生化指標的比較

2.3 雜交鯛及黑鯛相關(guān)基因表達量的變化差異

2 種魚的相關(guān)基因表達水平受投喂頻率不同程度的影響，不同投喂頻率下雜交鯛及黑鯛相關(guān)基因相對表達量的比較見圖2。由圖2 可見，投喂頻率從1 T升至3 T 時，雜交鯛及黑鯛的ghr 基因表達量顯著降低（P<0.05）；igf1 基因相對表達量顯著升高（P<0.05），Cu/Zn sod 基因表達量無顯著變化（P＞0.05）；lpl 基因表達量則呈先升高后降低的趨勢，2 T 組顯著高于1 T組和 3 T 組（P<0.05）。投喂頻率從 3 T 升高至 4 T 時，ghr、igf1、lpl、Cu/Zn sod 基因表達量均無顯著變化（P>0.05）。4 T 組 lpl、ghr 基因表達量顯著低于 2 T 組，Cu/Zn sod 基因表達量顯著高于2 T 組。此外，雜交鯛在2 T組的 igf1、lpl 基因表達量顯著高于黑鯛（P<0.05），1 T組的 ghr 基因表達量顯著低于黑鯛（P<0.05），4 T 組的Cu/Zn sod 基因表達量顯著高于黑鯛（P<0.05）。

圖2 不同投喂頻率下雜交鯛及黑鯛相關(guān)基因相對表達量的比較

3 討論

3.1 體成分檢測結(jié)果

魚體成分是被用來評估魚體質(zhì)量、評判投喂策略的標準之一[17]。該試驗中，隨著投喂頻率的升高，雜交鯛和黑鯛的粗脂肪含量升高，水分含量降低。對大雜交鱘（Huso dauricus♀×Acipenser schrenckii♂）[18]、黃河鯉魚（Cyprinus carpio）[19]、花羔紅點鮭（Salvelinus malma）[20]等幼魚的研究，也得到了相似的結(jié)果。這可能是因為增加投喂頻率，魚類的飼料攝食量增大，因此魚體中轉(zhuǎn)化儲藏起來的脂肪含量也隨之增大[21-22]。但魚種或飼料成分等的不同，也存在不同的研究結(jié)果[23]。另外，投喂頻率對2 種魚的粗蛋白、灰分含量均無顯著影響。文獻[24-25]關(guān)于烏蘇里擬鲿（Pseudobagrus ussuriensis）幼魚、陰影施氏油鯰（Steindachneridion scriptum）幼魚的研究結(jié)果與本試驗結(jié)果相似。推測是蛋白質(zhì)和灰分含量涉及魚體組織功能，不易受投喂頻率等外源因素的影響[26]。但也有研究認為，部分魚類在饑餓狀態(tài)下，優(yōu)先利用脂類與糖原供能，蛋白質(zhì)的消耗少，粗蛋白含量相對較高[27]。

3.2 血清生化指標

COR 是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一種“應激激素”，與魚體的代謝、免疫功能有關(guān)，而LZM 是參與免疫、抗菌抗病的堿性酶[28-29]。本試驗中，投喂頻率對2 種魚的 COR、LZM 含量無顯著影響。文獻[30-31]對大口黑鱸（Micropterus salmoides）、花鰻鱺（Anguilla marmorata）等的研究也有同樣結(jié)果。推測投喂頻率的改變對多數(shù)魚類的免疫功能不會造成影響。但也有個別魚類如團頭魴[10]、哲羅魚（Hucho taimen）[32]等的COR 和LZM 活性，受到了投喂頻率的顯著影響，這可能是高攝食量對其產(chǎn)生了應激反應。而TP 含量是體現(xiàn)魚體營養(yǎng)狀況相關(guān)的重要指標[33]。投喂頻率升高時，雜交鯛和黑鯛的TP 含量先升高后降低，且2 T 組顯著高于4 T 組。文獻[18]對研究的大雜交鱘TP 含量變化趨勢與本試驗相似，這或許是因為超出適宜范圍的高投喂頻率，影響到魚體的營養(yǎng)吸收。而花鰻鱺的TP 含量不因投喂頻率變化而發(fā)生改變，只與自身的合成代謝相關(guān)[31]。TC 和TG 含量與魚體的脂代謝有關(guān)[34]。因此，隨著投喂頻率的升高，2 種魚的TC 含量及黑鯛的TG 含量均呈顯著升高趨勢，這與文獻[35-36]關(guān)于吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）、條紋鋸（Centropristis striata）的研究結(jié)果一致。此外，4 T 組內(nèi)雜交鯛的TC、TG 含量顯著低于黑鯛?？梢?，在高投喂頻率組中，黑鯛更容易在體內(nèi)積累由多余的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化而成的脂肪。

3.3 不同基因表達水平

類胰島素生長因子（igf1）的基因表達，受魚類營養(yǎng)貧瘠狀況的影響[37-38]。升高投喂頻率到2 T，igf1 的表達水平隨之升高。生長激素受體（ghr）是檢驗魚類生長性能和生理狀態(tài)的指標，其在細胞內(nèi)的表達量對生長激素發(fā)揮作用有重要影響[39]。本試驗中，在較低投喂頻率下，2 種魚的ghr 基因表達處于較高水平。其原因可能是投喂量較少時，魚體通過自身調(diào)節(jié)，上調(diào)ghr 表達，以減少營養(yǎng)不足對生長性能的影響，ghr 表達量也隨之升高[40]。此外，2 種魚的igf1 與生長速率呈正相關(guān)，ghr 與生長速率呈負相關(guān)，對多數(shù)魚的研究都得到了該結(jié)果[41]。而同一投喂頻率下，雜交鯛ghr 表達量低于黑鯛，igf1 表達量高于黑鯛，這在一定程度上反映雜交鯛的生長速度或許比黑鯛更快。

魚種的脂蛋白脂肪酶（LPL）和超氧化物歧化酶（SOD）的表達，亦受能量與營養(yǎng)的影響[42-43]。本試驗中，日投喂1 次時，2 種魚生長所需的營養(yǎng)不足，脂肪積累少，lpl 與Cu/Zn sod 基因表達均處于較低的水平；投喂2 次時，進食量加大，魚體脂肪含量升高，LPL分解甘油三酯為機體供能，lpl 及Cu/Zn sod 基因表達均顯著上調(diào)[44]；投喂4 次時，魚體脂代謝紊亂，胃腸負荷加大，加之攝食活動增加，lpl 消耗量上升，其表達量下降，而機體通過自我調(diào)節(jié)恢復平衡后，Cu/Zn sod表達量降低[45-46]。此外，雜交鯛2 T 組的lpl 基因與4 T組的Cu/Zn sod 基因表達量，均顯著高于黑鯛，表明雜交鯛的脂代謝平衡能力與抗氧化能力優(yōu)于黑鯛。