SLC5A8基因甲基化與甲狀腺腫瘤臨床特征及預(yù)后相關(guān)性的分析*

楊 彥，徐 斌，李玉霞，唐運(yùn)祥，楊 錢(qián)

(重慶市急救醫(yī)療中心/重慶市第四人民醫(yī)院:1.腫瘤血液科；2.核醫(yī)學(xué)科；3.普通外科 400014)

作為內(nèi)分泌系統(tǒng)中的常見(jiàn)腫瘤，甲狀腺腫瘤發(fā)病率逐年攀升，嚴(yán)重影響居民的身心健康[1-3]。如何提高甲狀腺腫瘤診斷的準(zhǔn)確性，識(shí)別腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)是臨床醫(yī)生迫切需要思考的問(wèn)題。隨著分子診斷學(xué)的發(fā)展，DNA甲基化已成為表觀遺傳學(xué)的重要研究機(jī)制，在腫瘤形成發(fā)展中起到了非常重要的調(diào)節(jié)作用[4-5]。SLC5A8基因于2002年在甲狀腺中首次被發(fā)現(xiàn)，存在于人類染色體的12q13-23，相關(guān)研究已證實(shí)其有促進(jìn)腫瘤凋亡和抗腫瘤細(xì)胞增殖的作用[6-8]。SLC5A8基因在多種腫瘤組織中呈異常表達(dá)狀態(tài)，大量研究分析發(fā)現(xiàn)，人類大部分腫瘤中均有SLC5A8 基因，例如甲狀腺癌[9]、食管癌[10]、宮頸癌[11]等。目前關(guān)于SLC5A8基因甲基化檢測(cè)對(duì)于甲狀腺腫瘤的良惡性的早期診斷的研究不多，同時(shí)針對(duì)甲狀腺腫瘤惡變監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究采用回顧性方法，探討SLC5A8基因甲基化在甲狀腺腫瘤的診斷及預(yù)后中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年10月至2019年9月在本院行初次甲狀腺手術(shù)的患者，其中男126例，女274例，平均年齡(49.24±4.76)歲。切下新鮮樣本，獲取甲狀腺病灶組織(甲狀腺癌或甲狀腺腺瘤)、癌旁組織(與腫瘤邊緣的間距<0.5 cm)、正常甲狀腺組織(簡(jiǎn)稱正常組織，與腫瘤邊緣的間距>2.0 cm，并經(jīng)病理證實(shí)無(wú)癌)。不同病理類型標(biāo)本各取100例，共計(jì)400例。100例甲狀腺癌中有分化型甲狀腺癌89例，其中乳頭狀癌83例，濾泡狀癌6例；未分化癌5例；髓樣癌6例。標(biāo)本均由本院病理科給予確診，切除后立刻放入液氮中保存?；颊呔炇鹬橥鈺?shū)，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)定。納入標(biāo)準(zhǔn)：入組的所有病例均具備明確的手術(shù)適應(yīng)證；具有完整的臨床資料、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、病理診斷資料；所有患者否認(rèn)甲狀腺相關(guān)疾病臨床治療史，否認(rèn)在接受手術(shù)治療前有放化療等抗癌治療，否認(rèn)合并其他類型惡性腫瘤及其他相關(guān)遺傳病史；年齡20～70周歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有其他甲狀腺疾病者，或有其他類型惡性腫瘤病史。

1.2 臨床資料

收集患者性別、年齡、結(jié)節(jié)數(shù)目、結(jié)節(jié)大小、是否侵犯包膜、甲狀腺結(jié)合球蛋白(TG)、膽固醇、甘油三酯、術(shù)前甲狀腺功能、B超特點(diǎn)(是否有鈣化灶、邊界是否清晰、是否有血流信號(hào))、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分級(jí)等信息。臨床資料以患者手術(shù)時(shí)的住院病例為依據(jù)。

1.3 信息隨訪

通過(guò)查閱門(mén)診病歷、住院病例、打電話形式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間自術(shù)后起至2021年9月，平均隨訪時(shí)間2年。記錄患者最后隨訪日期及疾病狀態(tài)(無(wú)事件、疾病持續(xù)、復(fù)發(fā)、疾病特異性死亡)，記錄復(fù)發(fā)類型(局部復(fù)發(fā)、區(qū)域復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處復(fù)發(fā))、復(fù)發(fā)日期等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1引物設(shè)計(jì)

應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5并參照Gene Bank自行設(shè)計(jì)SLC5A8基因引物，交由上海生工生物有限公司協(xié)助合成，引物的序列詳見(jiàn)表1。針對(duì)SLC5A8基因的DNA序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。

表1 引物的序列及擴(kuò)增片段

1.4.2SLC5A8基因甲基化檢測(cè)

采用甲基化特異性PCR(MSP)法檢測(cè)，按照 DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取標(biāo)本組織 DNA 并修飾，將對(duì)應(yīng)引物進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾 DNA 樣本的 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 15 s；58 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s，40次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增完畢后，120 V 電泳30 min，電泳后對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳照相，甲基化引物擴(kuò)增后有陽(yáng)性條帶者發(fā)生基因甲基化，未出現(xiàn)條帶的結(jié)果為實(shí)驗(yàn)中的陰性對(duì)照。

1.4.3SLC5A8基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

采用RT-PCR 法檢測(cè)SLC5A8基因mRNA轉(zhuǎn)錄情況，按照 RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取樣本組織總RNA，隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用熒光定量PCR試劑盒對(duì)cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃15 s；60 ℃ 40 s,72 ℃ 30 s,40次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。采集熒光信號(hào)PCR結(jié)束后，記錄擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(CT值)。對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳照相。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 組織中SLC5A8基因甲基化情況

400例標(biāo)本中，4組間SLC5A8基因甲基化陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=130.765，P<0.001)。進(jìn)一步兩兩比較顯示，癌組織SLC5A8基因甲基化陽(yáng)性率均顯著高于腺瘤組織(χ2=4.23，P<0.05)、癌旁組織(χ2=64.98，P<0.05)和正常組織(χ2=90.51，P<0.05)；腺瘤組織高于癌旁組織(χ2=29.28,P<0.05)和正常組織(χ2=61.28,P<0.05)。癌旁組織與正常組織比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.54，P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 SLC5A8基因甲基化陽(yáng)性率分析[n(%),n=100]

2.2 組織中SLC5A8基因表達(dá)水平

對(duì)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)差值(△CT)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，甲狀腺癌組織、腺瘤組織、癌旁組織、正常組織SLC5A8基因表達(dá)水平分別為9.54±1.03、8.03±0.99、6.85±0.74、6.30±1.03，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.324，P=0.033)。這表明SLC5A8基因在癌組織中表達(dá)水平較腺瘤組織、癌旁組織及正常組織明顯降低。

2.3 SLC5A8甲基化與甲狀腺腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

SLC5A8甲基化陽(yáng)性組與陰性組比較，包膜侵犯、TG水平、膽固醇水平、甘油三酯水平、術(shù)前甲狀腺功能及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而年齡、性別、結(jié)節(jié)數(shù)量、結(jié)節(jié)大小等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 SLC5A8甲基化與臨床特征的關(guān)系(n=200)

2.4 甲狀腺腫瘤患者復(fù)發(fā)率分析

在2年的隨訪中，甲狀腺癌組及甲狀腺腺瘤組中分別有17例及21例患者失訪，甲狀腺腺癌組患者的復(fù)發(fā)率(13.25%，11/83)顯著低于甲狀腺腺瘤組(29.11% ，23/79)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.428，P<0.05)。進(jìn)一步分析顯示，SLC5A8甲基化陽(yáng)性患者的復(fù)發(fā)率(25.67%，20/113)高于甲基化陰性患者(10.20%，5/49)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.936，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

2.5 甲狀腺腫瘤預(yù)后分析

單因素分析顯示，甲狀腺腫瘤預(yù)后與SLC5A8甲基化、甲狀腺結(jié)節(jié)數(shù)量、結(jié)節(jié)大小、包膜侵犯、TG水平、膽固醇水平、術(shù)前甲狀腺功能、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。進(jìn)一步通過(guò)Cox回歸分析模型顯示，SLC5A8甲基化、甲狀腺結(jié)節(jié)數(shù)量、結(jié)節(jié)大小、包膜侵犯、TG水平、術(shù)前甲狀腺功能、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分級(jí)為甲狀腺腫瘤患者預(yù)后的影響因素(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 甲狀腺腫瘤預(yù)后單因素和多因素分析

續(xù)表4 甲狀腺腫瘤預(yù)后單因素和多因素分析

A：甲狀腺腺瘤于甲狀腺癌患者復(fù)發(fā)情況比較；B：SLC5A8基因甲基化陽(yáng)性及陰性患者復(fù)發(fā)情況比較。

3 討 論

現(xiàn)今，甲狀腺癌已成為內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率正在逐年升高[12-13]。鑒于目前對(duì)甲狀腺腫瘤的過(guò)度診斷及其惰性生長(zhǎng)的特性，不少學(xué)者反對(duì)開(kāi)展甲狀腺腫瘤的人群篩查，如何快速、準(zhǔn)確診斷甲狀腺腫瘤型別仍是當(dāng)前的臨床難點(diǎn)。目前，DNA甲基化異常已經(jīng)成為判定腫瘤分子的特異性生物標(biāo)志物，在腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷上具有指導(dǎo)性作用[14-16]。既往研究表明，大部分腫瘤中都會(huì)發(fā)現(xiàn)SLC5A8 基因，其表達(dá)明顯降低或缺失，例如甲狀腺癌、食管癌[10]、乳腺癌[17]等。同時(shí)，SLC5A8基因能夠和生物素起反應(yīng)，可以抑制細(xì)胞癌變，殺死癌細(xì)胞，加快癌細(xì)胞凋亡速度。

本研究通過(guò)對(duì)不同甲狀腺組織中SLC5A8基因甲基化的檢測(cè)情況發(fā)現(xiàn)，其在癌組織及腺瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，而其mRNA轉(zhuǎn)錄水平減弱，與張利紅等[18]研究結(jié)果一致，表明SLC5A8基因甲基化在甲狀腺腫瘤中普遍存在。因常規(guī)病理檢查中存在潛隱性的可能，不能及時(shí)、準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)甲狀腺組織惡變，而導(dǎo)致診斷的準(zhǔn)確率有所差異，癌旁組織及正常組織中SLC5A8基因甲基化的檢測(cè)，從分子水平上彌補(bǔ)了這一缺陷。

早期對(duì)甲狀腺癌進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)評(píng)定，對(duì)避免低?；颊咭虿槐匾倪^(guò)度治療帶來(lái)的不良反應(yīng)和精準(zhǔn)預(yù)測(cè)患者的預(yù)后情況都具有重要意義。經(jīng)過(guò)為期2年的隨訪發(fā)現(xiàn)，甲狀腺腺瘤及甲狀腺癌的復(fù)發(fā)率分別為29.11%和13.25%，略高于國(guó)內(nèi)相關(guān)研究(8.89%～23.53%)[19-21]，其原因在于本研究中行單側(cè)切除術(shù)的患者較多，此外部分患者術(shù)后未行131I清掃，從而導(dǎo)致復(fù)發(fā)率升高。既往已有研究表明，DNA甲基化可用于結(jié)腸癌[22]、肝癌[16]的診斷與預(yù)后評(píng)測(cè)，本研究結(jié)果顯示，SLC5A8基因甲基化與甲狀腺腫瘤患者包膜侵犯、TG水平、膽固醇水平、甘油三酯含水平、術(shù)前甲狀腺功能、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與年齡、性別、結(jié)節(jié)數(shù)量、結(jié)節(jié)大小等因素?zé)o關(guān)。隨訪發(fā)現(xiàn)，SLC5A8基因甲基化陽(yáng)性患者術(shù)后2年復(fù)發(fā)率(25.67%)顯著高于陰性患者(10.20%)，且與疾病分級(jí)相關(guān)。COX多因素分析結(jié)果顯示，SLC5A8基因甲基化為影響甲狀腺腫瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素之一，與王曉輝等[9]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，通過(guò)對(duì)甲狀腺腫瘤SLC5A8基因甲基化的檢測(cè)，表明其在甲狀腺腫瘤中普遍存在，可作為診斷、識(shí)別甲狀腺腫瘤的輔助技術(shù)。同時(shí)，為進(jìn)一步研究甲狀腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的表觀遺傳學(xué)變化機(jī)制提供了重要依據(jù)，并對(duì)甲狀腺腫瘤的分子生物學(xué)治療提供潛在幫助。