灘羊肉宰后成熟期間ATPase活力變化對(duì)微觀結(jié)構(gòu)及保水性的影響

姬 琛，羅 輝，劉吉娟，羅瑞明,,*

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

灘羊是分布于陜西、甘肅、寧夏的優(yōu)質(zhì)特色畜種，由于其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富備受消費(fèi)者喜愛(ài)。保水性是衡量灘羊肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，可用滴水損失表征[1]。宰后成熟過(guò)程中肌肉會(huì)發(fā)生復(fù)雜的生理生化變化，對(duì)肉的保水性有重要影響。目前，宰后成熟過(guò)程中過(guò)度的汁液流失仍是影響灘羊肉外觀、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值的主要問(wèn)題之一。因此，研究宰后成熟過(guò)程中滴水損失的形成對(duì)于指導(dǎo)灘羊肉生產(chǎn)加工具有重要意義。

宰后成熟過(guò)程中肉品的保水性受諸多因素影響，如成熟條件、糖酵解、肌肉pH值等，最終由結(jié)構(gòu)蛋白的降解程度及空間排列決定，這些因素通過(guò)引起肌纖維和肌細(xì)胞的收縮來(lái)調(diào)節(jié)水分貯留[2-3]。鈣蛋白酶（Calpains）與細(xì)胞凋亡酶——胱天蛋白酶（Caspases）是目前公認(rèn)宰后成熟過(guò)程中水解結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的主要酶類(lèi)[4]。Koohmaraie[5]認(rèn)為Calpain-1對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白水解起主要作用。然而，由于宰后Calpain逐漸失活，其水解作用受限。慕妮[6]的研究結(jié)果表明雞肉成熟9 h時(shí)Calpain-1基本完全失活，但結(jié)構(gòu)蛋白的降解仍在發(fā)生。近些年，細(xì)胞凋亡理論被引入宰后肉品品質(zhì)形成研究中，Caspases被認(rèn)為是宰后肌纖維骨架蛋白降解的主要貢獻(xiàn)者，尤其是Caspase-3，研究證實(shí)其是宰后成熟過(guò)程中調(diào)控肌原纖維蛋白降解程度的主要酶之一，其活性主要受細(xì)胞凋亡相關(guān)通路調(diào)控。Huang Ming等[7]研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3可體外降解雞肉中的伴肌球蛋白、伴肌動(dòng)蛋白和α-輔肌動(dòng)蛋白，并弱化Z線與I盤(pán)的連接。Chen Lin等[8]研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3可體外降解雞肉中的肌鈣蛋白-T。宰后成熟期間ATPase可調(diào)控引發(fā)細(xì)胞凋亡的相關(guān)通路，通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活Caspase-3，從而水解結(jié)構(gòu)蛋白。Chaves等[9]發(fā)現(xiàn)Na＋-K＋-ATPase通過(guò)改變膜通透性，釋放細(xì)胞色素c，啟動(dòng)Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，影響肌肉細(xì)胞的凋亡和纖維化，破壞肌質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，從而影響肉的保水性。Sierra等[10]闡明了宰后Ca2＋-ATPase通過(guò)向細(xì)胞外泵出Ca2＋，促使H＋流入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致線粒體膜通透性改變，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，激活Caspase-3降解肌纖維蛋白。

本實(shí)驗(yàn)選取灘羊背最長(zhǎng)肌為研究對(duì)象，成熟8 d，通過(guò)測(cè)定ATPase活力、Caspase-3活力、微觀結(jié)構(gòu)與品質(zhì)指標(biāo)變化，確定灘羊肉保水性對(duì)ATPases活性變化的響應(yīng)，以期為指導(dǎo)灘羊肉生產(chǎn)加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灘羊背最長(zhǎng)肌由寧夏鹽池縣大夏牧場(chǎng)食品有限公司提供，選取9 只體質(zhì)量相近的6 月齡公灘羊，屠宰前統(tǒng)一管理。屠宰后立即采集胴體右側(cè)背最長(zhǎng)肌，剔除可見(jiàn)脂肪與結(jié)締組織后放置于保鮮袋中，于4 ℃、風(fēng)速3 m/s、相對(duì)濕度85%條件下成熟0、4、8 d。

1.2 儀器與設(shè)備

DW3.0.1型超低溫冰箱 無(wú)錫冠亞恒溫制冷技術(shù)有限公司；352型酶標(biāo)儀 芬蘭Labsystems Multiskan MS公司；AC8型洗板機(jī) 芬蘭ThermoLabsystems公司；TG16W型離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；GNP-9080型恒溫培養(yǎng)箱 上海昕?jī)x儀器儀表有限公司；Leica UC7型超薄切片機(jī) 德國(guó)徠卡公司；HT7700型透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司；便攜式pH計(jì) 上海德圖儀器國(guó)際貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

采集成熟0、1、2、4、8 d的灘羊背最長(zhǎng)肌約200 g，用于測(cè)定pH值與滴水損失率；采集不同成熟時(shí)間樣品各20 g置于-30 ℃保存，用于測(cè)定蛋白溶解度；采集不同成熟時(shí)間樣品各5 g封裝于滅菌冷凍管中，置于-80 ℃保存，用于測(cè)定酶活力。

1.3.2 pH值測(cè)定

去除樣品可見(jiàn)脂肪，使用pH計(jì)測(cè)定肌肉pH值。使用前pH計(jì)以3 種標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（pH 9.18、6.86、4.0）進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.3.3 滴水損失率測(cè)定

參照左惠心[11]的方法并稍作修改。取約60 g樣品準(zhǔn)確稱(chēng)質(zhì)量后用繩子懸掛于自封袋中，確保樣品與自封袋無(wú)接觸，置于4 ℃冰箱中，24 h后用紙巾吸干樣品表面水分后重新稱(chēng)質(zhì)量。滴水損失率以?xún)纱畏Q(chēng)量的質(zhì)量差占肉塊初始質(zhì)量的百分比表示。

在屋里做飯的媳婦聽(tīng)見(jiàn)孩子的哭聲，急忙從屋里出來(lái)，邊走邊在圍裙上擦著手，嘴里吆呼著：“狗蛋咋啦？狗蛋咋啦？”看見(jiàn)哥們兒朝洛蒙背著雙肩包在黑地里高粱桿似的戳著。媳婦把狗蛋從地上抱起來(lái)，顛著哄：“奧奧奧，狗蛋別哭，狗蛋別哭，我們的狗蛋不哭?！?/p>

1.3.4 微觀結(jié)構(gòu)觀察

參考Li Ke等[12]的方法，取不同成熟時(shí)間樣品切成20 mm×20 mm×20 mm塊狀，戊二醛溶液預(yù)固定4 h后用磷酸緩沖液（0.1 mol/L、pH 7.4）漂洗3 次，每次15 min。再加入含1%鋨酸的磷酸緩沖液（0.1 mol/L、pH 7.4）室溫固定2 h，用磷酸緩沖液（0.1 mol/L、pH 7.4）漂洗3 次，每次15 min。乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹(shù)脂滲透包埋，用超薄切片機(jī)切成厚60 nm的超薄切片，鈾鉛雙染色（2%醋酸鈾飽和乙醇溶液、枸櫞酸鉛各染色15 min），切片室溫干燥過(guò)夜，用透射電子顯微鏡進(jìn)行拍照觀察。

1.3.5 蛋白溶解度測(cè)定

參照李升升[13]的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g肉樣剪碎置于10 mL離心管中，加入SDS溶液（85 ℃、50 g/L、1 mL），12 000 r/min均質(zhì)3 min（每30 s間歇10 s）后15 000 r/min離心20 min，上清液即為總可溶性蛋白。

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g肉樣剪碎置于10 mL離心管中，加入1 mL超純水，12 000 r/min均質(zhì)2 min后15 000 r/min離心5 min，上清液即為水溶性蛋白溶液。收集上一步驟沉淀，加入1 mL低鹽溶液（含0.116 9 g NaCl、0.038 0 g EGTA、0.305 0 g MgCl2、0.077 1 g二硫蘇糖醇、0.003 5 g苯甲基磺酰氟、0.040 8 g NaH2PO4、0.042 9 g Na2HPO4），4 ℃、12 000 r/min均質(zhì)2 min后，15 000 r/min離心5 min并收集上清液，即為低鹽溶性蛋白溶液。收集低鹽溶性蛋白溶液剩余的沉淀，加入1 mL高鹽溶液（含0.19 g EGTA、0.305 g MgCl2、0.077 1 g二硫蘇糖醇、0.003 5 g苯甲基磺酰氟、2.659 g Na2P2O7），4 ℃、12 000 r/min均質(zhì)2 min后15 000 r/min離心20 min，上清液即為高鹽溶性蛋白溶液。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.6 Caspase-3、Na＋-K＋-ATPase及Ca2＋-ATPase活力測(cè)定

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定Caspase-3、Na＋-K＋-ATPase及Ca2＋-ATPase活力。稱(chēng)取1 g切碎肌肉樣品加入9 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.2、0.01 mol/L）于4 ℃勻漿，然后4 ℃、5 000 r/min離心15 min，收集上清液。將上清液與共軛試劑（多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲基酯酶）于37 ℃孵育30 min后采用蒸餾水梯度稀釋加入96 孔微量滴定板中。加入酶標(biāo)試劑并于37 ℃反應(yīng)30 min。將50 μL顯色液A（醋酸鈉、檸檬酸、過(guò)氧化氫）和50 μL顯色液B（EDTA-Na、檸檬酸、甘油、四甲基聯(lián)苯胺）依次加入滴定板，37 ℃于避光處孵育15 min，最后加入50 μL硫酸溶液（1 mol/L）終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。采用梯度稀釋法，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋共軛試劑，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算酶活力（U/L）。以成熟0 d時(shí)初始酶活力為1，計(jì)算各成熟時(shí)間樣品中Caspase-3、Na＋-K＋-ATPase及Ca2＋-ATPase相對(duì)活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示存在顯著差異。采用Origin軟件繪圖。采用SPSS軟件計(jì)算各指標(biāo)間的皮爾遜相關(guān)性系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 灘羊肉宰后成熟過(guò)程中pH值及滴水損失率的變化

由圖1可知，宰后成熟期間灘羊背最長(zhǎng)肌滴水損失率隨成熟時(shí)間延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)（P＜0.05），并于成熟2 d時(shí)達(dá)到最大值（7.57%）。滴水損失率越高，肉的保水性越差，表明成熟2 d時(shí)灘羊肉的保水性較差，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，肉中可流失水分含量總體減少，因此滴水損失率亦減小。本研究結(jié)果與惠小洋等[14]對(duì)4 ℃成熟過(guò)程中黃牛×西門(mén)塔爾雜交牛背最長(zhǎng)肌滴水損失率變化規(guī)律的研究結(jié)果一致。肌肉中的水分可分為結(jié)合水、自由水、不易流動(dòng)水，其中自由水儲(chǔ)存于細(xì)胞間隙，最易流失；結(jié)合水由于與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合而不易受宰后成熟過(guò)程的影響；不易流動(dòng)水約占肌肉水分含量的80%，由于其被固定在肌纖維結(jié)構(gòu)中，但并不與蛋白質(zhì)結(jié)合，因此最易受到肌原纖維蛋白降解和蛋白質(zhì)電荷變化的影響[1]，故肉品的保水性雖受諸多因素影響，但最終由細(xì)胞骨架蛋白的結(jié)構(gòu)及其空間排列的變化決定。灘羊背最長(zhǎng)肌保水性的變化表明宰后成熟過(guò)程中肌肉結(jié)構(gòu)的完整性遭到破壞，肌肉中潴留的水分減少，成熟初期肌細(xì)胞間隙的自由水首先在重力作用下流失，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，肌細(xì)胞收縮、肌原纖維蛋白降解及肌肉pH值下降，導(dǎo)致不易流動(dòng)水流失，并在重力作用下形成滴水損失；成熟后期，由于絕大多數(shù)自由水及不易流動(dòng)水已轉(zhuǎn)化為滴水損失，肉中的水分含量總體減少，因此可轉(zhuǎn)化為滴水損失的水分亦減少。

由圖2可知，成熟0～2 d，灘羊肉pH值顯著降低（P＜0.05），并于成熟2 d時(shí)降至最低（5.55），2～4 d變化不顯著（P＞0.05），4 d后顯著升高至5.63（P＜0.05）。既往研究表明，宰后成熟初期家畜肌肉pH值可降至5.4～6.3[15-16]，本研究結(jié)果符合這一規(guī)律。宰后成熟過(guò)程中，肌肉pH值下降的速率和程度顯著影響代謝酶的活性，對(duì)于肉色、嫩度、保水性和風(fēng)味前體的形成有重要影響[3]。糖原被認(rèn)為是宰后成熟過(guò)程中肌肉中唯一的碳水化合物來(lái)源，研究表明宰后成熟初期肌肉中腺苷酸活化蛋白激酶活力升高，己糖激酶、果糖磷酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶等被激活[17-18]，進(jìn)而促進(jìn)糖原轉(zhuǎn)化為乳酸，導(dǎo)致乳酸積累，該過(guò)程是引起肌肉pH值降低的主要原因。肌肉pH值被認(rèn)為是宰后重要的品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，除影響肌原纖維蛋白降解相關(guān)酶活性外，蛋白質(zhì)與水分的結(jié)合也受其影響，當(dāng)肌肉pH值降至蛋白等電點(diǎn)時(shí)，蛋白對(duì)水分的吸引力降低[11]，其主要機(jī)制為不易流動(dòng)水儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)交聯(lián)所形成的空間內(nèi)[1]，pH值降低至一定程度會(huì)引起儲(chǔ)存水分的蛋白質(zhì)變性（如肌球蛋白頭部）[19]，導(dǎo)致存儲(chǔ)水分的空間減小，從而引起滴水損失增加，造成肌肉保水性下降。成熟2 d時(shí)灘羊肉保水性較差可能與pH值降至最低時(shí)引起的肌球蛋白頭部等蛋白變性有關(guān)，而成熟后期滴水損失有所降低可能與pH值偏離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)有關(guān)。因此，宰后成熟過(guò)程中肌肉pH值的變化對(duì)滴水損失有重要影響。

圖2 灘羊肉宰后成熟期間肌肉pH值的變化Fig. 2 Variation in pH of Tan sheep meat during postmortem aging

2.2 宰后成熟期間灘羊背最長(zhǎng)肌微觀結(jié)構(gòu)變化及肌原纖維蛋白降解情況

如圖3所示，成熟0 d時(shí)，灘羊背最長(zhǎng)肌肌原纖維排列緊密，相鄰肌纖維間隙很小，肌纖維結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊；Z線結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊；H帶結(jié)構(gòu)清晰、連續(xù)；大部分肌纖維膜與肌原纖維緊密相連，相鄰肌原纖維之間沒(méi)有明顯間隙。成熟4 d時(shí)，肌細(xì)胞整體呈中度水腫，肌纖維排列整齊、結(jié)構(gòu)致密，分布略顯稀疏，間隙明顯增寬，肌節(jié)呈對(duì)稱(chēng)分布。Z線結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊，沒(méi)有明顯斷裂；H帶結(jié)構(gòu)清晰；肌原纖維間隙較小，肌膜大部分與肌原纖維分離。成熟8 d時(shí)，肌細(xì)胞整體呈重度水腫，肌纖維結(jié)構(gòu)稀疏、排列松散、邊緣模糊，較多肌絲發(fā)生斷裂、溶解現(xiàn)象，肌纖維不連續(xù)；Z線局部斷裂、不連續(xù)；H帶結(jié)構(gòu)模糊、消失。

圖3 宰后成熟過(guò)程中灘羊肉微觀結(jié)構(gòu)的變化Fig. 3 Variation in microstructure of Tan sheep meat during postmortem aging

以上結(jié)果表明，成熟0～4 d內(nèi)僅部分肌原纖維蛋白發(fā)生降解，構(gòu)成粗絲及細(xì)絲的肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白等可能被蛋白水解酶降解；隨著成熟時(shí)間延長(zhǎng)，Z線斷裂、H帶消失、肌纖維斷裂、肌原纖維結(jié)構(gòu)松散、肌纖維及肌膜之間形成間隙，可能是因?yàn)榧￠g線蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白在成熟后期發(fā)生了降解，且肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白等蛋白的持續(xù)降解導(dǎo)致肌絲之間的間隙擴(kuò)大，這些間隙的形成為肉中水分的流失提供了通道。另外，研究表明宰后成熟過(guò)程中肌膜中整聯(lián)蛋白的降解使肌原纖維和肌膜之間形成間隙[20-21]。因此，肌纖維與肌膜之間間隙的形成除了受肌原纖維蛋白降解的影響之外，可能還與成熟后期整聯(lián)蛋白的降解有關(guān)。

由于水分主要儲(chǔ)存于肌肉結(jié)構(gòu)中，且微觀結(jié)構(gòu)的變化主要由結(jié)構(gòu)蛋白的降解引起，因此，測(cè)定蛋白降解情況對(duì)于研究肉品保水性十分重要，而蛋白溶解度是衡量蛋白降解程度的重要指標(biāo)。肌肉中的蛋白根據(jù)溶解性可分為水溶性蛋白、低鹽溶性蛋白及高鹽溶性蛋白，其中，水溶性蛋白與低鹽溶性蛋白均屬于肌漿蛋白，包括肌紅蛋白、糖酵解酶、三羧酸循環(huán)酶、氧化磷酸化酶等[22]；高鹽溶性蛋白屬于肌原纖維蛋白，包括肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白、肌聯(lián)蛋白等[23]。如圖4A所示，灘羊背最長(zhǎng)肌總可溶性蛋白質(zhì)量濃度隨成熟時(shí)間延長(zhǎng)由28.01 μg/μL降至19.92 μg/μL（P＜0.05），可能是內(nèi)源酶降解蛋白所致。如圖4B、C所示，水溶性蛋白質(zhì)量濃度在成熟0～2 d變化不顯著（P＞0.05），第8天時(shí)顯著降至2.09 μg/μL，低鹽溶性蛋白在成熟0～8 d期間持續(xù)下降至2.14 μg/μL，可能是因?yàn)殡S著pH值的下降及成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，內(nèi)源酶逐漸變性所致；如圖4D所示，高鹽溶性蛋白質(zhì)量濃度在宰后成熟過(guò)程中呈顯著下降趨勢(shì)，由13.82 μg/μL降低至9.96 μg/μL，表明肌原纖維蛋白在整個(gè)成熟期內(nèi)均發(fā)生降解。

圖4 灘羊肉宰后成熟期間蛋白質(zhì)溶解度的變化Fig. 4 Variation in protein solubility of Tan sheep meat during postmortem aging

2.3 灘羊肉宰后成熟過(guò)程中ATPase及Caspase-3活力變化

如圖5所示，宰后灘羊背最長(zhǎng)肌細(xì)胞中Na＋-K＋-ATPase相對(duì)活力整體呈先上升后下降的趨勢(shì)（P＜0.05），成熟1 d時(shí)達(dá)到最高值，為0 d時(shí)的1.04 倍，8 d時(shí)降至最低，為0 d時(shí)的56%。Na＋-K＋-ATPase是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上進(jìn)行離子轉(zhuǎn)運(yùn)的跨膜載體蛋白，負(fù)責(zé)維持細(xì)胞膜內(nèi)Na＋/K＋電化學(xué)梯度[24]，且可以加速降解ATP。本研究結(jié)果顯示Na＋-K＋-ATPase活力于成熟1 d后顯著降低，表明灘羊肉肌細(xì)胞在1 d內(nèi)可能啟動(dòng)了離子交換系統(tǒng)，通過(guò)改變線粒體膜通透性啟動(dòng)細(xì)胞凋亡影響Caspase-3活力。研究表明宰后成熟過(guò)程中，Na＋-K＋-ATPase啟動(dòng)Na＋與K＋在線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜兩側(cè)對(duì)向移動(dòng)，激活Na＋-H＋、K＋-H＋交換系統(tǒng)，形成膜內(nèi)外H＋梯度差，從而改變線粒體膜通透性，釋放細(xì)胞色素c，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[25]。此外，Na＋-K＋-ATPase有助于ATP水解，而ATP水解產(chǎn)物的積累可能也與成熟初期肌肉pH值的下降有關(guān)。Ca2＋-ATPase介導(dǎo)Ca2＋跨膜運(yùn)輸，其活力在0～1 d顯著升高（P＜0.05），并于1 d時(shí)升至最大值，為0 d的1.42 倍，1～2 d顯著下降（P＜0.05），2～4 d有所回升，4～8 d又顯著降低（P＜0.05）。宰后成熟初期Ca2＋-ATPase活力顯著升高，表明成熟初期大量離子交換導(dǎo)致Ca2＋-ATPase被激活，Ca2＋被Ca2＋-ATPase泵出，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2＋超載，1～2 d內(nèi)其活力下降可能與pH值的降低有關(guān)。Ca2＋-ATPase活力于宰后1 d達(dá)到最大值，表明灘羊肉肌細(xì)胞在宰后1 d內(nèi)可能由于Ca2＋超載啟動(dòng)了細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。王琳琳等[26]研究發(fā)現(xiàn)宰后12 h牦牛背最長(zhǎng)肌中Ca2＋-ATPase活力達(dá)到最大值，本研究結(jié)果與其不一致，可能是由于物種不同。

圖5 灘羊肉宰后成熟期間ATPase活力的變化Fig. 5 Variation in the activity of ATPase in Tan sheep meat during postmortem aging

如圖6所示，成熟0～2 d，Caspase-3活力顯著升高至最大值，為初始值的1.52 倍（P＜0.05），2 d后其活力顯著降低（P＜0.05），宰后8 d降至0 d時(shí)的1.19 倍。王琳琳[4]的研究結(jié)果表明宰后成熟7 d時(shí)牦牛背最長(zhǎng)肌中Caspase-3活力高于0 d時(shí)，與本研究結(jié)果一致。Caspase-3活力的變化趨勢(shì)表明宰后2 d內(nèi)灘羊肌細(xì)胞啟動(dòng)了細(xì)胞凋亡，并激活了凋亡效應(yīng)酶Caspase-3。動(dòng)物宰后受缺血、缺氧信號(hào)的調(diào)節(jié)，肌肉中糖原分解、代謝物積累、ATP消耗，從而引起細(xì)胞凋亡，這一過(guò)程依賴(lài)于內(nèi)源線粒體信號(hào)途徑[27]。牦牛肉在宰后成熟過(guò)程中活性氧的產(chǎn)生和Ca2＋超載可能導(dǎo)致細(xì)胞色素c的釋放，從而激活Caspase-3[28-29]。本研究結(jié)果表明，宰后成熟初期肌細(xì)胞內(nèi)Na＋-K＋-ATPase與Ca2＋-ATPase活力變化可能引起了細(xì)胞內(nèi)離子失衡及Ca2＋超載，促使細(xì)胞色素c從呼吸鏈上游離并釋放至胞漿中，最終形成凋亡小體并激活下游Caspase-3。Caspase-3被認(rèn)為有助于肌原纖維的水解，弱化Z盤(pán)與I盤(pán)的連接[7]。研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3可以促進(jìn)宰后成熟過(guò)程中西門(mén)塔爾牛肌肉中肌動(dòng)蛋白、伴肌動(dòng)蛋白和肌鈣蛋白-T的降解[30]。另外，酸化的細(xì)胞環(huán)境有利于維持Caspase-3活力[31]，因此，成熟后期肌肉組織內(nèi)間隙增多可能與Caspase-3降解結(jié)構(gòu)蛋白有關(guān)，并且較低的肌肉pH值維持了較高的Caspase-3活力。

圖6 灘羊肉宰后成熟期間Caspase-3活力的變化Fig. 6 Variation in the activity of caspase-3 in Tan sheep meat during postmortem aging

2.4 宰后成熟期間ATPase在灘羊肉保水性變化中的作用

對(duì)灘羊肉宰后成熟期間肌肉pH值、滴水損失率及Na＋-K＋-ATPase、Ca2＋-ATPase、Caspase-3活力進(jìn)行相關(guān)性分析，由表1可知，灘羊肉滴水損失率與肌肉pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與Na＋-K＋-ATPase及Caspase-3活力均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；灘羊肉pH值與Na＋-K＋-ATPase、Ca2＋-ATPase及Caspase-3活力均呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。Caspase-3活力與Na＋-K＋-ATPase及Ca2＋-ATPase活力均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，Na＋-K＋-ATPase與Ca2＋-ATPase活力的變化會(huì)影響肌細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活力，進(jìn)而調(diào)控肌原纖維蛋白的水解過(guò)程，影響肌肉結(jié)構(gòu)的完整性，最終影響肉的保水性。而肌肉pH值與Na＋-K＋-ATPase、Ca2＋-ATPase及Caspase-3活力均呈極顯著負(fù)相關(guān)，可能是因?yàn)槟芰啃?yīng)酶與宰后細(xì)胞內(nèi)代謝相關(guān)，影響肌肉pH值下降的速率與程度，反之，pH值又會(huì)影響酶活性。Ca2＋-ATPase活力與滴水損失率無(wú)明顯相關(guān)性可能是由于Ca2＋-ATPase通過(guò)影響肌肉pH值間接影響灘羊肉的保水性。

表1 灘羊肉Na＋-K＋-ATPase、Ca2＋-ATPase、Caspase-3活力及pH值、滴水損失率的相關(guān)性Table 1 Correlation between activities of Na+-K+-ATPase, Ca2+-ATPase and caspase-3 and drip loss rate in Tan sheep muscle

3 結(jié) 論

灘羊肉4 ℃成熟過(guò)程中Na＋-K＋-ATPase與Ca2＋-ATPase活力均先升高后降低，并于1 d時(shí)達(dá)到最大值；Caspase-3活力先升高后降低，2 d時(shí)達(dá)到最大值；滴水損失率先升高后降低，肌肉pH值先降低后有所回升；總蛋白、低鹽溶性蛋白及高鹽溶性蛋白質(zhì)量濃度均逐漸減少，水溶性蛋白質(zhì)量濃度于成熟2 d后顯著降低；成熟至8 d時(shí)，肌原纖維斷裂，肌纖維之間、肌束之間、肌纖維及肌膜之間形成間隙，Z線斷裂、H帶消失。灘羊肉宰后成熟過(guò)程中Na＋-K＋-ATPase與Ca2＋-ATPase活力變化可能促使下游Caspase-3激活；肌肉pH值的降低可能使Caspase-3活力維持在較高的水平；Caspase-3水解結(jié)構(gòu)蛋白促使肌肉組織在不同部位形成間隙；在重力作用下肌肉中的水分流入結(jié)構(gòu)蛋白降解所形成的間隙中，引起灘羊肉滴水損失率升高，致使灘羊肉的保水性變差。