響應(yīng)面法優(yōu)化柿子多糖超聲波提取工藝及抗氧化活性研究

王 輝，句榮輝，王 麗，朱建晨，汪長鋼

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 102442）

柿子是我國重要的農(nóng)產(chǎn)品，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，其中維生素、礦質(zhì)元素、碳水化合物等物質(zhì)含量較高，具有預(yù)防心血管疾病、化痰潤肺、控制血壓等保健作用[1-2]。中醫(yī)學(xué)提出，柿子味甘、澀，性寒，歸肺經(jīng)。其味甘而氣平，性澀而能收，故有健脾澀腸，治嗽止血之功[3-5]。柿子中含有的多糖較為豐富，具有一定的抗氧化作用，不僅可以很好地給身體補(bǔ)充營養(yǎng)，而且還有抗衰老以及強(qiáng)效護(hù)心的作用。

多糖是一種高分子聚合物，通過10個以上單糖糖苷鍵連接而成，故生物活性較為突出，相關(guān)研究成果已應(yīng)用于生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域[6-8]。多糖具有一定的免疫調(diào)節(jié)、抗病毒及抗癌、乳化、美容、降血糖、抗氧化等作用，常常由略帶修飾的重復(fù)單元構(gòu)成。由于結(jié)構(gòu)不同，多糖高分子和構(gòu)成它的單糖分子性質(zhì)迥異，可能無定形，甚至不溶于水。多糖屬于天然大分子化合物，在自然界分布相當(dāng)廣泛，存在于大多植物、動物及微生物中[9-11]。因此，研究和開發(fā)多糖資源，解析多糖構(gòu)成與藥理作用等，均有極為重要的現(xiàn)實意義。

超聲波提取是一種高效、安全的有效成分提取方法[12-13]，其具有一定的機(jī)械作用，可分散破壞植物組織，加速溶劑穿透組織作用，提高有效成分提取率[14]。超聲波提取法效率高，安全環(huán)保，營養(yǎng)成分損失少，設(shè)備簡單易操作，是值得研究的提取技術(shù)[15]。本文以磨盤柿為試驗材料，采用超聲波提取法提取柿子多糖，采用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，最后對柿子多糖抗氧化性進(jìn)行對比研究，以期為柿子多糖在功能保健食品中的應(yīng)用提供理論和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

磨盤柿，經(jīng)去皮去核后切片，脫水干燥至恒重，破碎后過65目篩，置于干燥皿中密封保存，備用。

試驗用水：試驗用水應(yīng)符合GB/T 6682—2008中三級水的規(guī)定；硫酸（H2SO4）、無水乙醇（C2H5OH）、苯酚（C6H6O）、葡萄糖（C6H12O6）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、鄰二氮菲、過氧化氫（H2O2）、硫酸鐵（FeSO4）、抗壞血酸、還原型輔酶I二鈉鹽（NADH）、氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）、5-甲基吩嗪硫酸甲酯（PMS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：均為分析純，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DHC-9053A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JYL-A070型勻漿機(jī)，九陽股份有限公司；DL-360B型超聲波清洗機(jī)，上海之信儀器有限公司；HH-4型恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HC-3018型高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；Q5866型渦旋振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；FA1104N型分析天平，上海菁海儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

柿子洗凈→去核切片→烘干→破碎→加水超聲波提取→提取液離心→上清液用乙醇沉淀→過濾沉淀→干燥→柿子多糖粗品

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 原料處理

將柿子粉用濾紙分批包好，配制成一定比例的待提取液，柿子烘干粉要盡量粉碎，不要留大塊，以便柿子多糖提取完全。

1.2.2.2 多糖的浸提

提取時避免溫度浮動過大，盡量縮短提取時間，減少料液受熱時間，以降低多糖分解的機(jī)會。

1.2.2.3 醇沉

將乙醇慢慢注入冷卻后的提取液中，此時柿子多糖呈現(xiàn)絮狀凝膠物沉淀析出，邊加邊攪至完全混合均勻，靜置過夜，然后過濾得沉淀物。

1.2.3 單因素試驗設(shè)計

1.2.3.1 料液比對柿子多糖提取的影響

取5份柿子粉各2g，分別加入20、30、40、50、60mL蒸餾水后，搖勻，于70℃水浴，超聲功率300 W條件下提取30 min，考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL））對柿子多糖得率的影響。

1.2.3.2 提取溫度對柿子多糖提取的影響

取5份柿子粉各2 g，溶于40 mL的蒸餾水中，于超聲功率300 W條件下提取30 min，考察不同提取溫度（50、60、70、80、90℃）對柿子多糖得率的影響。

1.2.3.3 超聲功率對柿子多糖提取的影響

取5份柿子粉各2 g，溶于40 mL的蒸餾水中，于60℃水浴中提取30 min，考察不同超聲功率（100、200、300、400、500 W）對柿子多糖得率的影響。

1.2.3.4 超聲時間對柿子多糖提取的影響

取5份柿子粉各2 g，溶于40 mL的蒸餾水中，在60℃水浴及超聲功率為300 W的條件下提取，考察不同超聲時間（10、20、30、40、50 min）對柿子多糖得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化磨盤柿多糖的提取工藝，通過擬合二次多項式，計算出最佳工藝組合和該條件下磨盤柿多糖提取率的最大理論值[16]。

使用Design-Expert8.0軟件的Box-Behnken Design（BBD）進(jìn)行試驗設(shè)計[17]。自變量為料液比（A）、提取溫度（B）、超聲功率（C）和提取時間（D），低、中、高水平分別用-1、0、1表示，詳見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平表Table 1 Response surface factorsand levels

1.2.5 驗證試驗

根據(jù)響應(yīng)面試驗得到最優(yōu)工藝參數(shù)，進(jìn)行3次柿子多糖提取驗證試驗，以平均多糖得率作為驗證值。

1.2.6 測定項目與方法

1.2.6.1 磨盤柿多糖得率

準(zhǔn)確吸取10μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別加入10 mL刻度試管中，用蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL。向試液中加至1.0 mL 5%苯酚溶液，快速加入5.0 mL硫酸溶液，靜置10 min。使用渦旋振蕩器使反應(yīng)液充分混合，然后將試管靜置于30℃水浴鍋中反應(yīng)20 min，測定波長為490 nm處的吸光度值，并以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

采用苯酚-硫酸法[18]對磨盤柿的多糖含量進(jìn)行測定。將磨盤柿提取物按一定比例進(jìn)行稀釋，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定490 nm處的吸光度值。使用回歸方程計算多糖濃度后，確定多糖得率，樣品中多糖得率計算公式為：

式中：m1為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的葡萄糖質(zhì)量，μg；V1為樣品定容體積，mL；m2為樣品質(zhì)量，g；V2為測定用樣品液的體積，mL；0.9為換算系數(shù)。

1.2.6.2 羥基自由基清除率

將超聲波所提取的柿子多糖樣品分別配制成質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5 mg/mL的5種溶液[19]。在微孔板中加入50μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，分別加入100μL PBS緩沖液（0.2 mol/L、pH 7.4）、50μL鄰二氮菲（0.75 mmol/L）、50μL體積分?jǐn)?shù)0.01%的H2O2溶液、50μL FeSO4溶液（0.75 mmol/L），搖勻后，在37℃下存放30 min，測定536 nm波長處的吸光度值，同時以同濃度的VC作對照。羥基自由基清除率計算公式為：

式中：A1為樣品的吸光值；A0為空白對照試驗（水代替多糖溶液）的吸光值；A2為蒸餾水替代H2O2和多糖的吸光值。

1.2.6.3 超氧陰離子自由基清除率

在微孔板中加入50μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，分別加入50μL NADH溶液（468μmol/L）、50μL NBT溶液（156μmol/L）及50μL PMS溶液（60μmol/L），混合后，在25℃水浴5 min，測定560 nm波長處的吸光度值，同時以同濃度的VC為對照。超氧陰離子自由基清除率計算公式為：

式中：A0為空白對照試驗（水代替多糖溶液）的吸光值；A1為樣品試驗的吸光值；A2為樣品干擾試驗（0.2 mol/LpH 7.4磷酸鹽緩沖溶液代替NBT溶液）的吸光值。

1.2.6.4 DPPH自由基清除率

在微孔板中加入50μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，分別加入100μL水、15μLDPPH溶液（0.4 mmol/L），搖勻后，在避光條件下存放30 min，測定517 nm波長處的吸光度值，同時以同濃度的VC為對照。DPPH自由基清除率計算公式為：

式中：A0為空白對照試驗（水代替多糖溶液）的吸光值；A1為樣品試驗吸光值；A2為樣品干擾試驗（無水乙醇代替DPPH）的吸光值。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3次，使用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對柿子多糖得率的影響

由圖1可知，在超聲波提取過程中，隨著溶液比例的增加，多糖得率也不斷增加，可能是隨著溶劑水的用量增大，有利于多糖的溶出，料液比從1∶10（g/mL）到1∶20（g/mL）多糖得率增幅較快，繼續(xù)增加水的用量，多糖得率增幅放緩?？紤]減少工作量和操作成本，選擇料液比1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗。

圖1 料液比對柿子多糖得率的影響Fig.1 Effect of material to liquid ratio on the yield of persimmon polysaccharide

2.1.2 提取溫度對柿子多糖得率的影響

由圖2可知，隨著超聲波提取溫度的升高，多糖浸出速度加快，浸出多糖增多，多糖得率在水浴處理60℃時達(dá)到最大值，但繼續(xù)升高溫度，多糖得率逐漸減小，可能是高溫破壞了多糖的生物結(jié)構(gòu)，影響了其活性。故選擇適宜提取溫度為60℃進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖2 提取溫度對柿子多糖得率的影響Fig.2 Effect of different extraction temperatureson theyield of persimmon polysaccharide

2.1.3 超聲功率對柿子多糖得率的影響

由圖3可見，隨著超聲功率的增大，多糖得率先上升后下降。超聲功率由200 W提高到300 W時，多糖得率出現(xiàn)了較大幅度的升高，在300 W時多糖得率達(dá)到最大值，可能是因為隨著超聲功率增大，多糖溶出較多，但當(dāng)超聲功率超過300 W時，多糖溶出趨于平緩，且雜質(zhì)溶出較多，浸提液的渾濁度增加，使多糖得率下降。因此，選擇適宜超聲功率為300 W進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖3 超聲功率對柿子多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the yield of persimmon polysaccharide

2.1.4 提取時間對柿子多糖得率的影響

由圖4可見，多糖得率隨提取時間的延長而上升，20 min時達(dá)到最大值，之后繼續(xù)延長提取時間，得率整體呈下降趨勢，這可能是由于當(dāng)浸提時間超過20 min后，多糖在水中的溶出趨于平衡，而雜質(zhì)溶出較多，多糖得率反而降低。因此選擇適宜超聲提取時間為20 min進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖4 不同提取時間對柿子多糖得率的影響Fig.4 The effect of different extraction time on the yield of persimmon polysaccharide

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與方差分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，以料液比（A）、提取溫度（B）、超聲功率（C）和提取時間（D）為自變量，以柿子多糖得率為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table2 Design optionsand resultsof theresponsesurface experiments

由表3方差分析可見，從試驗數(shù)據(jù)中獲得的模型F值為3.48，P值為0.013 1，表明該模型具有顯著性。模型中一次項D影響極顯著（P＜0.01），一次項A、二次項C2、交互項AD、BD影響顯著（P＜0.05）。

表3 響應(yīng)面方差分析表Table 3 Response surface analysisof variance

通過對表2中的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)回歸擬合，得到超聲波處理后多糖得率的回歸方程為：

Y=16.56-1.19A-0.40B+0.48C-1.71D-0.30AB+0.25AC+2.18AD-0.85BC+1.90BD+1.00CD-0.60A2-0.42B2-1.79C2-0.58D2，其方程的R2=0.776 7。在此模型中，失擬項不顯著，表明該回歸模型與實測值有較高的擬合度。

2.2.2 各因素間的交互作用對響應(yīng)值的影響

為探究各變量之間的交互作用及其對響應(yīng)值的影響，以回歸方程為依據(jù)，分別根據(jù)因素交互情況繪制每兩個因素固定于零水平條件下[20]，另外兩個因素交互作用形成的響應(yīng)曲面圖，如圖5～10所示。

圖5 料液比與提取溫度的交互作用對柿子多糖得率的影響Fig.5 Effect of the interaction between material to liquid ratio and extraction temperatureon theyield of persimmon polysaccharide

圖6 料液比與超聲功率的交互作用對柿子多糖得率的影響Fig.6 Effect of the interaction between material to liquid ratio and ultrasonic power on theyield of persimmon polysaccharide

圖8 提取溫度與超聲功率的交互作用對柿子多糖得率的影響Fig.8 Effect of theinteraction between extraction temperatureand ultrasonic power on the yield of persimmon polysaccharide

圖10 超聲功率與提取時間的交互作用對柿子多糖得率的影響Fig.10 Effect of the interaction between ultrasonic power and extraction timeon theyield of persimmon polysaccharide

由圖5～10可以看出，圖7和圖9曲面的坡度比較陡，說明料液比與提取時間、提取溫度與提取時間的交互作用對柿子多糖得率影響顯著（P＜0.05）。根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果，預(yù)測柿子多糖得率的最大值為20.0%，最佳提取工藝條件為：料液比1∶15（g/mL），提取溫度55℃，超聲功率300 W，提取時間15 min。

圖7 料液比與提取時間的交互作用對柿子多糖得率的影響Fig.7 Effect of the interaction between material to liquid ratioand extraction time on the yield of persimmon polysaccharide

圖9 提取溫度與提取時間的交互作用對柿子多糖得率的影響Fig.9 Effect of the interaction between extraction temperature and extraction timeon theyield of persimmon polysaccharide

2.3 驗證試驗

在響應(yīng)面優(yōu)化試驗得到的最優(yōu)工藝參數(shù)條件下進(jìn)行柿子多糖提取驗證試驗，測定3次重復(fù)試驗的多糖得率，得到柿子多糖得率平均驗證值為19.9%，與響應(yīng)面試驗預(yù)測最大值20.0%接近，說明該模型能預(yù)測實際多糖得率。

2.4 柿子多糖體外抗氧化活性測定

2.4.1 柿子多糖對羥基自由基的清除作用

由圖11可見，當(dāng)柿子多糖質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL和2.0 mg/mL時，其對羥基自由基的清除率分別為42.4%和84.6%，最高清除率為88.50%。VC質(zhì)量濃度在0.5 mg/mL和2.0 mg/mL時對羥基自由基清除率分別為45.7%和92.7%。可以看出，柿子多糖和VC對羥基自由基均有較強(qiáng)的清除作用，在一定范圍內(nèi)，清除效果與質(zhì)量濃度之間成正比，但質(zhì)量濃度高于2.0 mg/mL時，二者清除率的增加均減緩。柿子多糖抗氧化能力不及VC，但是對羥基自由基的清除率也較高，具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力[21]。

圖11 柿子多糖及VC對羥基自由基的清除作用Fig.11 Scavenging effect of persimmon polysaccharide and VCon hydroxyl free radicals

2.4.2 柿子多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

由圖12可見，當(dāng)柿子多糖質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL和2.0 mg/mL時，其對超氧陰離子自由基的清除率分別為56.6%和78.8%，最高清除率為81.21%。VC質(zhì)量濃度在0.5 mg/mL和2.0 mg/mL時對超氧陰離子自由基清除率分別為83.4%和92.7%。可以看出，柿子多糖和VC對超氧陰離子自由基均有較強(qiáng)的清除作用，在一定范圍內(nèi)，清除效果與質(zhì)量濃度之間成正比，但當(dāng)質(zhì)量濃度高于2.0 mg/mL后，二者清除率的增加均減緩。柿子多糖對超氧陰離子自由基的清除率始終低于VC。

圖12 柿子多糖及VC對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.12 Scavengingeffect of persimmon polysaccharideand VCon superoxide anion free radical

2.4.3 柿子多糖對DPPH自由基的清除作用

由圖13可見，當(dāng)柿子多糖質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL和2.5 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除率分別為49.6%和78.6%，最高清除率為79.10%。VC質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL和2.5 mg/mL時對DPPH自由基清除率分別為67.4%和91.6%?？梢钥闯?，柿子多糖和VC對DPPH自由基都具有很強(qiáng)的清除作用，在一定范圍內(nèi)，清除作用隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，但質(zhì)量濃度高于2.5 mg/mL后，二者清除率的增加趨勢減緩。柿子多糖對DPPH自由基的清除率始終低于VC。

圖13 柿子多糖及VC對DPPH自由基的清除作用Fig.13 Scavengingeffect of persimmon polysaccharideand VCon DPPH free radical

3 結(jié)論與討論

本研究采用超聲波輔助提取技術(shù)提取磨盤柿中的多糖，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析，得到最優(yōu)工藝參數(shù)為：料液比1∶15（g/mL），提取溫度55℃，超聲功率300 W，提取時間15 min。在該工藝條件下柿子多糖得率預(yù)測值為20.0%，驗證值為19.9%。其中提取時間對多糖得率的影響最大，可能是因為過長的提取時間會使柿子多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞[22]。

試驗研究結(jié)果表明，柿子多糖對羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基均有一定的清除作用，最高清除率分別為88.50%、81.21%、79.10%。這表明本試驗制備的柿子多糖具有較強(qiáng)的抗氧化作用，可作為一種天然抗氧化劑加以研究并應(yīng)用于功能保健食品中。然而本試驗只在體外對3種自由基的清除效果進(jìn)行了研究，而對于生物體內(nèi)柿子多糖是否具有同樣的抗氧化效果，還有待于進(jìn)一步的深入研究。