貝萊斯芽孢桿菌對采后葡萄果實貯藏品質的影響

張雨萌，牛新湘，鄒 強，楊紅梅，楚 敏，史應武,4,5,*

（1.新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農業(yè)科學院微生物應用研究所，新疆 烏魯木齊 830091；3.新疆農業(yè)科學院土壤肥料與農業(yè)節(jié)水研究所，新疆 烏魯木齊 830091；4.農業(yè)農村部西北綠洲農業(yè)環(huán)境重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830091；5.新疆特殊環(huán)境微生物實驗室，新疆 烏魯木齊 830091）

“玫瑰香”葡萄具有獨特香氣，常用于鮮食、釀酒等。每年8—9月份為“玫瑰香”葡萄成熟期，由于采收時正值高溫，且果實含糖量極高，表皮容易損傷，極易受病原菌的侵害發(fā)生腐爛、變軟、掉粒等現(xiàn)象[1-2]，導致貯藏期較短，貯藏品質大幅下降。我國需貯運外銷與貯運保鮮的葡萄果實約占80%，每年在采收、包裝、貯藏等環(huán)節(jié)出現(xiàn)的葡萄腐爛損失約占總產量的27%以上，造成嚴重的經濟損失[3]。如何保持葡萄采后貯藏品質是目前亟需解決的問題。我國在葡萄果實采后貯藏保鮮技術方面已有不少研究，最常見的是使用SO2熏蒸來防止葡萄果實腐爛[4-5]，但此方法易使果實發(fā)生漂白[6]，且易腐蝕庫房金屬設施，危害人體健康[7]。Pinto等[8]采用UV-C輻射的方法，使葡萄抗氧化活性增加，從而達到保鮮目的，但果實經輻射處理可能會引起化學及生物學效應。因此尋求安全有效的保鮮技術是維持良好貯藏品質的關鍵。多數學者研究表明，拮抗菌對葡萄采后防腐保鮮有較好的效果，如：芽孢桿菌、酵母菌、假單胞桿菌等[9-11]。

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）是芽孢桿菌屬的一個新種，在2008年被確定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）的后期異型體[12]。已經命名的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌植物亞種應該重新歸為B.velezensis。貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）是目前成功用于實際生產的生防菌之一，可產生蛋白、多肽、小分子量抗生素等多種抑菌物質，能有效防治草莓白粉病、蘭花枯萎病等農業(yè)病害，對稻瘟病菌、鏈格孢菌等病菌有較強的拮抗活性[13-14]，表現(xiàn)出很好的實際應用效果與前景[15-16]，對葡萄采后病原菌的侵害也有明顯抑制效果。Hamaoka等[17]研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌KOF112可以抑制灰霉病菌、炭疽菌和晚疫霉的菌絲生長。B.velezensis這些特性使其在食品行業(yè)中也具有一定的應用潛力，但其在葡萄采后保鮮中的應用鮮有報道。

本試驗以玫瑰香葡萄為試材，采用貝萊斯芽孢桿菌TP-1溶液處理葡萄，通過對果實失重率、腐爛率、可溶性固形物含量、相對電導率、硬度、果皮色度、可滴定酸（TA）含量、VC含量的測定，研究其對玫瑰香葡萄常溫和低溫貯藏品質的影響，探索葡萄采后保鮮處理的有效方法，以期為葡萄貯藏保鮮技術研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

拮抗菌：貝萊斯芽孢桿菌TP-1，分離自五家渠葡萄園土壤。病原菌：灰葡萄孢PH-23，由變質葡萄傷口處分離所得。葡萄：品種為玫瑰香，購自烏魯木齊市沙依巴克區(qū)北園春水果市場，選取顆粒飽滿，果實顏色較深且鮮艷，無損傷，大小相似的葡萄開展試驗。其他材料：0.22μm有機濾膜、打孔器、玻璃珠、穿刺針、竹簽。

酚酞：上海山浦化工有限公司。1%酚酞指示劑：將0.5 g酚酞用50 mL 95%乙醇充分溶解，得到1%酚酞指示劑，常溫保存?zhèn)溆谩溲趸c：天津永晟精細化工有限公司。0.1 mol/L NaOH溶液：取2.0 g氫氧化鈉，置于潔凈燒杯中，加入蒸餾水，用玻璃棒攪拌助溶，將溶液全部轉至500 mL容量瓶中定容，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 儀器與設備

UV-2550型紫外分光光度計，日本島津自動化設備有限公司；NR10QC型通用色差計，深圳市三恩馳科技有限公司；FiveEasy Plus型pH計，北京東南儀誠實驗室設備有限公司；GY-4型水果硬度計，浙江托普云農科技股份有限公司；DDS-307型電導率儀，上海儀電科學儀器股份有限公司；CL20A型高速冷凍離心機，德國艾本德股份公司；DH-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；RXZ型智能人工氣候箱，寧波江南儀器廠；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司；WYT-A型手持折射儀，成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌液處理

將拮抗菌和病原菌的菌液分別于室溫條件下，8 000 r/min離心15 min，收集菌體，用0.85%生理鹽水重懸菌體，8 000 r/min離心15 min，收集菌體，重復操作洗滌菌體至少3次。然后用與菌液等量的生理鹽水重懸菌體。

1.2.2 樣品處理

葡萄表面用清水進行沖洗，去除灰塵后用2%次氯酸鈉浸泡1 min，用無菌水沖洗，晾干。在葡萄果實表面均勻選取4點，用無菌針頭進行打孔，孔深3 mm，將打孔后大小、成熟度均一的葡萄隨機分為4組。①將葡萄置于無菌水中浸泡1 min，以此為對照組（CK），記為T1。②將葡萄在拮抗菌溶液（TP-1）中浸泡1 min，記為T2。③將葡萄先在拮抗菌溶液中浸泡1 min，然后在病原菌溶液（PH-23）中浸泡30 s，為（TP-1+PH-23），記為T3。④將葡萄在病原菌溶液（PH-23）中浸泡30 s，記為T4。所有試驗均重復3次。將4組處理分別置于相對濕度為85%條件下貯藏，設置低溫（4℃）及常溫（25℃）兩組處理，低溫處理在10～50 d進行測定，常溫處理在5～25 d進行測定。

1.2.3 測定項目與方法

1.2.3.1 腐爛率

采用計數法測定腐爛率，每個處理50粒葡萄果實。計算公式為：

腐爛率（%）=腐爛果粒數/總果粒數×100

1.2.3.2 失重率

采用稱重法，具體參照吳帆等[18]的方法。低溫（4℃）貯藏處理組每10 d取樣一次，準確稱重并記錄。常溫（25℃）貯藏處理組每5 d取樣一次，準確稱重并記錄。

1.2.3.3 可溶性固形物（TSS）含量

利用WYT-A手持折射儀進行測定[19]。

1.2.3.4 相對電導率

使用DDS-307型電導率儀進行測定[20]。

1.2.3.5 硬度

參考葉爽等[21]的方法，采用GY-4型水果硬度計對葡萄進行穿刺測試。

1.2.3.6 果皮色度

參考孔祥佳等[22]的方法，使用NR10QC型通用色差計隨機測定葡萄果實表面L*、a*、b*值，L*表示亮度，a*表示紅綠色度，b*表示黃藍色度。根據a*和b*值計算果皮的色飽和度C值，色飽和度代表果實色澤的鮮艷程度，該數值越大果實色澤越鮮艷。色飽和度C值計算公式為：C=（a*2+b*2）1/2。

1.2.3.7 可滴定酸（TA）含量

參考曹建康等[23]的方法，采用酸堿滴定法進行測定，以酒石酸計。

1.2.3.8 VC含量

參照袁王旬等[24]的方法，在420nm處測定吸光值。

1.2.4 數據處理

采用Excel 2010軟件繪圖，采用SPSS21.0軟件進行數據統(tǒng)計分析。各指標的測定均重復3次。

2 結果與分析

2.1 貝萊斯芽孢桿菌TP-1對貯藏期間葡萄果實感官指標的影響

2.1.1 貝萊斯芽孢桿菌TP-1對貯藏期間葡萄果實的防腐效果

如圖1所示，在整個貯藏期間葡萄果實腐爛率均呈現(xiàn)上升趨勢，常溫貯藏15～20 d時，腐爛率顯著上升，但T2處理組的腐爛率始終低于其他處理組。T4處理組腐爛率增加最快，第25天時已經達到84%，約為T2組的2倍，T3處理組腐爛率在貯藏后期顯著低于對照組（P＜0.05）。常溫貯藏條件下，貝萊斯芽孢桿菌防腐效果明顯。低溫貯藏葡萄果實的腐爛率明顯低于常溫貯藏，貯藏50 d時腐爛率均不超過40%，且T2處理組腐爛率最低。貯藏25 d時，常溫貯藏條件T2組的腐爛率為42.4%，貯藏50d時，低溫貯藏條件T2組的腐爛率僅為27.4%。綜上，貝萊斯芽孢桿菌可以有效抑制葡萄果實的腐爛。

圖1 葡萄果實貯藏期間腐爛率的變化Fig.1 Changesin rottingrateof grapesduringstorage

2.1.2 貝萊斯芽孢桿菌TP-1對貯藏期間葡萄果實失重率的影響

如圖2所示，隨著貯藏時間的延長，各組果實失重率均呈上升趨勢，且兩種貯藏條件下各貯藏階段水分含量變化趨勢較為一致。常溫貯藏的葡萄失重率在貯藏15 d以后上升趨勢顯著，T4組失重率顯著高于其他處理組（P＜0.05），而T1、T2組在貯藏10～15 d失重率迅速上升，此后緩慢上升，各處理組間表現(xiàn)出明顯差異。第25天時T2組失重率為14.38%，顯著低于其他3組（P＜0.05），此時T3組的失重率為25.03%，而T4組的失重率為31.99%，說明常溫貯藏條件下貝萊斯芽孢桿菌可以大幅降低葡萄果實失重率。葡萄在低溫貯藏期間的失重率整體呈均勻上升趨勢，且T4處理組失重率始終顯著高于其他處理組（P＜0.05），T2組果實失重率始終低于T1組（P＜0.05），說明貝萊斯芽孢桿菌TP-1可有效抑制低溫貯藏下葡萄果實的失重。

圖2 葡萄果實貯藏期間失重率的變化Fig.2 Changesin weight lossrate of grapes during storage

2.1.3 貝萊斯芽孢桿菌TP-1對貯藏期間葡萄果皮色度的影響

如圖3所示，常溫貯藏過程中各處理組L*值差異不大，貯藏15 d以后T2組的L*值始終低于其他處理組，貯藏25 d時T4處理組L*值最高，為31.34。葡萄果實低溫貯藏50 d時，T1、T2、T3組間L*值無明顯差異，T4組L*值為33.65，顯著高于其他3組（P＜0.05）。常溫貯藏葡萄果實T1、T2、T3處理組的C值均呈先下降后上升的變化趨勢，T4處理組的C值在貯藏25 d時顯著上升。低溫貯藏的各處理組C值整體呈上升趨勢，第50天時T4處理組C值最大。試驗結果表明，不同貯藏條件下葡萄果皮明暗程度無明顯變化，低溫貯藏的葡萄顏色更為鮮艷。

圖3 葡萄果實貯藏期間果皮色度的變化Fig.3 Changesin grape skin color duringstorage

2.1.4 貝萊斯芽孢桿菌TP-1對貯藏期間葡萄果實硬度的影響

如圖4所示，隨著貯藏時間的延長，葡萄果實硬度呈現(xiàn)下降趨勢，硬度的保持效果為T2＞T1＞T3＞T4，常溫下貯藏的葡萄果實硬度下降更快。常溫T4處理組硬度下降最快，第25天時硬度為0。在低溫貯藏過程中，果實硬度呈現(xiàn)均勻下降的趨勢，其中T3組硬度始終高于T4處理，可見低溫貯藏條件下貝萊斯芽孢桿菌可以更好地維持葡萄果實硬度。上述結果說明貝萊斯芽孢桿菌可以較好地維持果實細胞間結合力和果實的抗壓力[25]。

圖4 葡萄果實貯藏期間硬度的變化Fig.4 Changesin thehardnessof grapesduringstorage

2.2 貝萊斯芽孢桿菌TP-1對貯藏期間葡萄果實營養(yǎng)指標的影響

2.2.1 貝萊斯芽孢桿菌TP-1對貯藏期間葡萄果實可溶性固形物含量的影響

如圖5所示，常溫貯藏期間葡萄果實的可溶性固形物含量整體呈下降趨勢。其中常溫貯藏條件T4處理組下降幅度更大。常溫貯藏25 d時，可溶性固形物含量由高到低依次為：T2＞T3＞T1＞T4。低溫貯藏條件下前20 d可溶性固形物含量呈下降趨勢，20～50 d有所上升，低溫貯藏50 d時可溶性固形物含量由大到小為：T2＞T1＞T3＞T4，說明葡萄果實在貯藏過程中甜度呈下降趨勢，但拮抗菌處理組可延緩果實代謝活動[26]，有效維持葡萄的甜度。

圖5 葡萄果實貯藏期間可溶性固形物含量的變化Fig.5 Changesof soluble solidscontents in grapesduring storage

2.2.2 貝萊斯芽孢桿菌TP-1對貯藏期間葡萄果實VC含量的影響

如圖6所示，常溫貯藏條件下各組葡萄的VC含量呈現(xiàn)下降趨勢，15 d時下降幅度較大，其中T2處理組對維持VC含量最有優(yōu)勢，貯藏25 d時，各處理組VC含量由高到低依次為：T2＞T3＞T1＞T4；低溫貯藏葡萄果實VC含量整體呈下降趨勢，貯藏50 d時，VC含量由高到低依次為：T2＞T3＞T1＞T4。常溫貯藏前期VC含量大于低溫貯藏，但隨著貯藏時間延長，常溫貯藏VC含量下降較快，而低溫貯藏在整個貯藏期間VC含量下降幅度緩慢，貯藏中后期低溫貯藏條件下VC含量高于常溫貯藏，且T2處理組的VC含量始終最高。表明生物保鮮與低溫保鮮結合可以較好地維持葡萄果實中VC含量，有助于葡萄果實長期貯藏。

圖6 葡萄果實貯藏期間VC含量的變化Fig.6 Changesof VCcontentsin grapesduringstorage

2.2.3 貝萊斯芽孢桿菌TP-1對貯藏期間葡萄果實可滴定酸含量的影響

如圖7所示，在整個貯藏期間葡萄果實可滴定酸含量呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢。常溫貯藏25 d時，各處理可滴定酸含量由高到低依次為：T2＞T1＞T3＞T4；低溫貯藏的葡萄果實可滴定酸含量較常溫貯藏降幅平緩，第50天時，各處理由高到低依次為：T3＞T2＞T1＞T4。由此可見，貝萊斯芽孢桿菌TP-1可有效抑制葡萄果實貯藏期間可滴定酸含量的下降，且低溫貯藏較常溫貯藏更有利于減緩可滴定酸含量的下降。

圖7 葡萄果實貯藏期間可滴定酸含量的變化Fig.7 Changesin titratableacids contentsin grapes during storage

2.3 貝萊斯芽孢桿菌TP-1對貯藏期間葡萄果實生理指標的影響

由于葡萄果實不斷成熟衰老，其果肉的相對電導率隨著貯藏時間的延長逐漸上升（圖8）。常溫貯藏25 d時，T4處理組的相對電導率顯著高于其他3組（P＜0.05），而T2處理組顯著低于其他3組（P＜0.05）。低溫貯藏50 d時，相對電導率由大到小依次為：T4＞T3＞T1＞T2，T2處理組顯著低于其他3組（P＜0.05）。常溫貯藏果實的相對電導率略高于低溫貯藏的果實。推測葡萄在貯藏期間相對電導率迅速增大，破壞了葡萄果實組織膜結構，發(fā)生膜內電解質外泄。貝萊斯芽孢桿菌TP-1可以顯著抑制細胞膜的損傷。

圖8 葡萄果實貯藏期間相對電導率的變化Fig.8 Changesin the electrical conductivity of grapesduring storage

3 討論

貝萊斯芽孢桿菌含有多種菌肽基因組，大量研究報道了其生防潛力，但在果實貯藏保鮮方面應用很少。潘夢詩等[27]研究了貝萊斯芽孢桿菌對花生白絹病的生防機理，結果表明，貝萊斯芽孢桿菌產生的蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶和嗜鐵素可抑制病原菌的生長。有研究表明，貝萊斯芽孢桿菌可以抑制厚皮甜瓜上尖孢鐮刀菌的生長，有效抑制甜瓜腐爛[28]。本研究中，貝萊斯芽孢桿菌TP-1處理后葡萄果實腐爛率在整個貯藏期都處于較低水平，這可能是由于貝萊斯芽孢桿菌抑制了病原菌的生長，從而延緩了發(fā)病時間。

果實的失重率、硬度和色度是保鮮研究中常用的感官指標[29]，可以反映葡萄果實的衰老程度、果實品質以及顏色變化。本研究中貝萊斯芽孢桿菌TP-1處理能夠有效減少葡萄果實水分的散失，且常溫貯藏條件下效果更顯著。硬度可以表征果實抗壓能力的強弱，在果實成熟的過程中其組織結構變得松弛，硬度下降[30]。有研究表明，貝萊斯芽孢桿菌ZSY-1可以顯著降低乙烯釋放量，有效控制番茄采后軟化，維持較好的硬度[31]。本研究中，貝萊斯芽孢桿菌TP-1處理在整個貯藏期間硬度呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，常溫貯藏25 d時，貝萊斯芽孢桿菌TP-1處理的硬度是對照組的1.42倍，低溫貯藏條件下貝萊斯芽孢桿菌TP-1處理與對照組硬度均無大幅下降。整個貯藏期間果實表面亮度小幅上升，色澤逐漸變淺，低溫貯藏較常溫貯藏相比，葡萄果實顏色更為鮮艷，這與在梨[32]、獼猴桃[33]、蘋果[34]等水果的研究結果大體一致。果實組織的相對電導率反映了組織細胞膜的完整性與衰老程度[35]。本研究中，在整個貯藏期間葡萄果實組織的相對電導率保持上升趨勢，且貝萊斯芽孢桿菌TP-1處理組始終低于其他處理組。導致果實相對電導率上升的原因可能是離子的滲透率增加，致使細胞膜的組織結構被破壞[36]。本研究中，兩種貯藏溫度條件下果實可溶性固形物含量均有不同程度的下降，低溫貯藏條件可以延緩果實可溶性固形物含量的下降，可溶性固形物含量的變化可能與貯藏期間葡萄果實內部糖的轉化有關[37]。

孫思勝等[38]研究表明，對于低溫貯藏的“夏黑”葡萄，采用不同濃度復方中藥提取物可以有效抑制可滴定酸含量的下降，該結論與本研究結果一致。VC是衡量果實營養(yǎng)價值的重要指標。本試驗中，整個常溫貯藏期間果實VC含量大幅下降，貝萊斯芽孢桿菌TP-1處理組VC含量顯著高于對照組（P＜0.05），說明貝萊斯芽孢桿菌TP-1處理可以延緩VC的降解，有效維持果實的營養(yǎng)。低溫貯藏條件下VC含量無明顯變化，推測可能是由于低溫抑制了抗壞血酸酶的活性，進而減緩了VC含量的下降[39]。

貝萊斯芽孢桿菌TP-1在常溫貯藏條件下維持葡萄果實品質效果更明顯，低溫貯藏條件下有關貝萊斯芽孢桿菌貯藏保鮮的機理還需進一步研究。

4 結論

貝萊斯芽孢桿菌TP-1可以有效抑制采后葡萄果實腐爛率、失重率和相對電導率的上升，并且結合低溫貯藏條件可以有效延緩葡萄果實硬度、可滴定酸含量、可溶性固形物含量和VC含量的下降，使葡萄果實保持良好的色度。常溫貯藏較低溫貯藏防腐和維持果實品質的效果更明顯，但低溫貯藏條件可以延長葡萄果實的貯藏期。貝萊斯芽孢桿菌TP-1結合低溫貯藏的方法可以有效改善“玫瑰香”葡萄果實的貯藏品質。