Wnt5a介導(dǎo)Wnt/Ca2+通路對(duì)BCG誘導(dǎo)牛原代肺泡上皮細(xì)胞自噬的調(diào)控作用

陳 琪，杜長(zhǎng)征，鄭雪迪，馬伯利，徐金瑞*，楊 易*

(1.寧夏大學(xué) 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021；2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，銀川 750021)

2021年世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的《2021年全球結(jié)核病報(bào)告》顯示，2020年全球結(jié)核潛伏感染人群近20億，新發(fā)結(jié)核病(tuberculosis，TB)患者約987萬(wàn)，發(fā)病率為127/10萬(wàn)，我國(guó)估算結(jié)核病發(fā)病數(shù)位居世界第2位，死亡率為2.1/10萬(wàn)，由于新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)大流行，結(jié)核病死亡人數(shù)出現(xiàn)了十余年來(lái)的首次增加[1]。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)是結(jié)核病的致病菌，其通過(guò)宿主代謝和能量代謝途徑侵?jǐn)_受感染細(xì)胞的自噬和凋亡[2]，Mtb可侵入機(jī)體各種器官，主要是肺，引起肺結(jié)核[3]。肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells，AECs)是抵抗外來(lái)物入侵的第一道防線，在肺免疫中擔(dān)負(fù)著由先天免疫到獲得性免疫的橋梁作用[4]。Mtb在AECs內(nèi)有更高的復(fù)制增殖能力，刺激AECs分泌各種細(xì)胞因子，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，以促進(jìn)Mtb的傳播和結(jié)核病的發(fā)生與發(fā)展[5]。雖然目前有多種方法來(lái)分離AECs，但仍未有一種公認(rèn)的方法能夠得到純度高且產(chǎn)量大的上皮細(xì)胞，因此，探討高效分離培養(yǎng)原代AECs的方法對(duì)肺功能特性研究意義重大。

自噬在維持細(xì)胞體內(nèi)平衡中起著至關(guān)重要的作用，在調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)和抗感染性疾病進(jìn)程中至關(guān)重要[6]。Wnt5a是Wnt蛋白家族成員之一，通過(guò)與膜受體或共受體復(fù)合物結(jié)合激活細(xì)胞中磷酸化蛋白傳遞信號(hào)，既作用于經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路，又活化非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路[7]。Wnt5a通過(guò)激活鈣/鈣調(diào)蛋白依賴(lài)的蛋白激酶II(calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)及鈣調(diào)磷酸酶的作用，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，使胞內(nèi)Ca2+濃度升高，活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of the activated T cell, NFAT)，發(fā)揮抑癌作用[8-9]。胞內(nèi)Ca2+在自噬調(diào)控中起著重要作用[10]，也在結(jié)核發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，Mtb操縱Ca2+信號(hào)以阻止吞噬體成熟及吞噬體和溶酶體融合的能力被廣泛研究[11]，特異性阻斷Ca2+顯著減少自噬小體的形成，且升高M(jìn)tb細(xì)菌載量，表明Ca2+在Mtb胞內(nèi)存活和細(xì)胞自噬中發(fā)揮重要作用[12]。但Ca2+在Mtb感染過(guò)程中調(diào)節(jié)自噬的確切作用尚不清楚，因此，探討Wnt5a是否通過(guò)非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)通路調(diào)控BCG感染的BAECs細(xì)胞自噬，對(duì)宿主導(dǎo)向的抗結(jié)核治療方法的研究具有重要意義。

本課題組前期已證明Wnt5a對(duì)BCG感染的小鼠肺上皮細(xì)胞自噬有調(diào)控作用[13]，因此，本研究通過(guò)分離BAECs，用BCG感染BAECs建立模型，抑制Wnt5a的表達(dá)處理，Western blot和免疫熒光染色檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白及非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)通路相關(guān)因子的蛋白水平表達(dá)，以明確Wnt5a對(duì)BCG感染的BAECs細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制，為肺結(jié)核治療和預(yù)防提供新視角。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

成年健康牛肺組織。

1.2 主要試劑及儀器

硫酸鏈霉素、氨芐青霉素(Amersco，美國(guó))，兩性霉素(Sigma，美國(guó))，膠原酶I(Gibco，美國(guó))，RNase-Free DNase I、紅細(xì)胞裂解液(天埂生化科技有限公司)，Biolaminin包被液(上海逍鵬生物科技有限公司)，Wnt5a特異性抑制劑Box-5(Sigma，美國(guó))，DMEM/F12培養(yǎng)基(BI，美國(guó))，胎牛血清及TrypleTM胰酶(Gibco，美國(guó))，青霉素/鏈霉素溶液(北京索萊寶科技有限公司)，全蛋白提取試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)，BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒(南京凱基公司)，脫脂奶粉(BD，美國(guó))，一抗Cytokeratin14、Cytokeratin5、Atg5、P62、內(nèi)參GAPDH兔多克隆抗體、二抗HRP-Goat、LC3熒光一抗和山羊抗兔熒光二抗(Proteintech，美國(guó))，LC3一抗(CST，美國(guó))，Atg7一抗(Abcam，美國(guó))，預(yù)染彩虹蛋白Marker(大連美倫生物技術(shù)有限公司)，ECL 顯影液(環(huán)亞生物科技有限公司)，4%多聚甲醛(BD，美國(guó))，Triton X-100(Sigam，美國(guó))，封閉用驢血清、含DAPI 的熒光封片劑(北京索萊寶科技有限公司)。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO，日本)，全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Bio-Rad美國(guó))，高通量組織細(xì)胞破碎儀(北京儀嘉林科技有限公司)，電轉(zhuǎn)儀和電泳儀(Bio-Rad，美國(guó))，GE化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(Gene，美國(guó))，光學(xué)顯微鏡(Motic公司，中國(guó))，熒光顯微鏡(Olympics，日本)。

1.3 結(jié)核分枝桿菌BCG來(lái)源及培養(yǎng)

將購(gòu)自成都生物制品研究所有限公司牛結(jié)核分枝桿菌卡介苗(BCG)疫苗株粉末用7H9培養(yǎng)液(含0.2% Tween-80和10% ADC)溶解重懸，置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中于飽和濕度、5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行感染試驗(yàn)。

1.4 牛原代肺泡上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)

參考Xu等[14]和廖偉等[15]分離原代肺上皮細(xì)胞的方法，并進(jìn)一步優(yōu)化：取成年健康牛肺組織，縱切支氣管并切成小塊，置于無(wú)菌50 mL離心管，加入預(yù)冷的PBS(含雙抗及兩性霉素B)漂洗至洗液澄清。將組織塊置于預(yù)冷消化液(PBS+20% DMEM+15%胎牛血清+5%雙抗+1 g·L-1膠原酶I+胰酶+10 mg·L-1DNase I+2.5 mg·L-1兩性霉素B)，放入4 ℃冰箱消化至出現(xiàn)渾濁，加等體積PBS終止消化。將管腔面向上，刮刷管腔，收集洗液，1 000 r·min-1離心5 min，加入紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，補(bǔ)加DMEM/F12培養(yǎng)液(DMEM/F12+12%胎牛血清+1%雙抗)于200目細(xì)胞篩過(guò)濾，接種于培養(yǎng)皿中2～4 h，使易于貼壁的成纖維細(xì)胞等貼壁。收集未貼壁的細(xì)胞懸液，1 000 r·min-1離心5 min，用含DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，接種于提前用Biolaminin包被液包被的培養(yǎng)皿中，飽和濕度下，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)。

1.5 BAECs鑒定

將分離的細(xì)胞以2×105個(gè)·孔-1接種于提前放置玻璃片的12孔板中貼壁8 h，棄培養(yǎng)液，PBS漂洗， 5 min×3；4% 多聚甲醛固定20 min，同上PBS漂洗；0.2% TritonX-100通透細(xì)胞20 min，PBS漂洗；10% 驢血清/PBS封閉1 h，PBS潤(rùn)洗，5 min×2；37 ℃靜置孵育CK14和CK5一抗(稀釋比 200∶1)2 h，PBS洗滌后37 ℃避光孵育熒光二抗(稀釋比100∶1)30 min，PBS洗滌3次后用含DAPI 封片劑染核指甲油封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.6 BCG感染及抑制Wnt5a處理BAECs

待BAECs生長(zhǎng)至80%左右時(shí)，用胰酶消化后臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，將細(xì)胞以4×105個(gè)·孔-1接種于6孔板培養(yǎng)皿，貼壁8 h，棄培養(yǎng)基，補(bǔ)加1 mL培養(yǎng)液，根據(jù)已有試驗(yàn)[13]基礎(chǔ)用感染復(fù)數(shù)10∶1的BCG感染BAECs 4 h，設(shè)置對(duì)照組(C組)和BCG感染組(BCG)；不同濃度Wnt5a特異性抑制劑Box-5處理BAECs 6 h收樣，設(shè)置對(duì)照組(C組)及Box-5濃度為5、10、30、50和100 μmol·L-1處理組；用適宜濃度Box-5預(yù)處理BAECs 2 h，BCG繼續(xù)感染BAECs 4 h(MOI=10)，設(shè)置對(duì)照組(C組)，BCG感染組(BCG)，Box-5 抑制劑組(Box-5)和抑制劑與BCG共處理組(Box-5+BCG)。

1.7 總蛋白提取及Western blot檢測(cè)

將不同處理組BAECs用PBS緩沖液潤(rùn)洗2次，每孔加100 μL全蛋白裂解液，置于4 ℃搖床15 min，使細(xì)胞充分裂解。將細(xì)胞刮下，收集于提前加了細(xì)胞磁珠的1.5 mL離心管中，置于細(xì)胞破碎儀破碎1 min左右至裂解液澄清，于低溫離心機(jī)離心(4 ℃，14 000 r·min-1，15 min)，收集上清液。BCA檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度后定量加入上樣緩沖液，于沸水浴滅活5 min后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μg變性蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5% 脫脂奶粉的TBS室溫封閉2 h，TBS洗滌，4 ℃過(guò)夜孵育一抗，TBST洗滌，室溫孵育二抗2 h， TBST洗滌，加ECL化學(xué)發(fā)光液，用GE化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀記錄蛋白條帶。

1.8 免疫熒光染色檢測(cè)

將BAECs以2×105個(gè)·孔-1接種于提前放置玻璃片的12孔板中貼壁8 h，同“1.6”處理，棄培養(yǎng)基用PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗滌5 min×3，0.2% Triton X-100通透 20 min，PBS洗滌5 min×3，用10%的驢血清室溫靜置封閉1 h，PBS洗滌5 min×2，37 ℃靜置孵育LC3一抗(一抗稀釋液按照稀釋比200∶1稀釋)2 h，PBS洗滌5 min×3，37 ℃避光孵育熒光二抗(PBS按照稀釋比100∶1)30 min，PBS洗滌5 min×3，用含DAPI 封片劑染核指甲油封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 牛肺泡上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)

對(duì)牛肺組織進(jìn)行細(xì)胞分離，在培養(yǎng)36 h視野中出現(xiàn)明顯的細(xì)胞團(tuán)(圖1A)，第一代細(xì)胞經(jīng)胰酶消化離心重懸后，用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活率均在85%～92%之間，顯微鏡觀察傳代培養(yǎng)24 h細(xì)胞形態(tài)(圖1B)。

A. 分離培養(yǎng)36 h原代細(xì)胞；B. 傳代培養(yǎng)24 h的原代細(xì)胞

2.2 牛肺泡上皮細(xì)胞鑒定

2.2.1 免疫熒光染色檢測(cè)CK14的表達(dá) 為了鑒定分離肺細(xì)胞類(lèi)型，依據(jù)上皮細(xì)胞類(lèi)型的特異性表面標(biāo)記抗原，CK14是一種具有特異性的上皮標(biāo)記蛋白[16]，免疫熒光染色檢測(cè)CK14的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)絕大部分細(xì)胞表達(dá)CK14(圖2)，提示分離的肺細(xì)胞是BAECs。

免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞CK14的表達(dá)，CK14為綠色，DAPI為藍(lán)色；A～C. 放大倍數(shù)100；D～F. 放大倍數(shù)200

2.2.2 免疫熒光染色檢測(cè)角蛋白5的表達(dá) CK5為細(xì)胞骨架中間絲蛋白，具有維持上皮細(xì)胞形態(tài)完整性作用，免疫熒光染色檢測(cè)CK5的表達(dá)，結(jié)果顯示絕大部分細(xì)胞表達(dá)CK5(圖3)，進(jìn)一步表明分離的細(xì)胞是BAECs。

免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞CK5的表達(dá)，CK5為綠色，DAPI為藍(lán)色；A～C. 放大倍數(shù)100；D～F. 放大倍數(shù)200

2.3 BCG感染對(duì)BAECs自噬相關(guān)蛋白及Wnt5a表達(dá)的影響

為確定BCG感染BAECs的細(xì)胞自噬及Wnt5a表達(dá)水平，用BCG感染BAECs后，Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Wnt5a及自噬相關(guān)因子 LC3蛋白水平表達(dá)。結(jié)果顯示，相較對(duì)照組(C組)，BCG組Wnt5a及自噬相關(guān)蛋白LC3II蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01，圖4)，表明BCG感染BAECs上調(diào)Wnt5a表達(dá)水平，增加細(xì)胞自噬。

A. 蛋白表達(dá)印跡圖；B、C.直方圖。**. P<0.01，下同

2.4 不同濃度Box-5作用BAECs后Wnt5a及細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

為了確定Wnt5a特異性抑制劑Box-5抑制Wnt5a的表達(dá)水平，不同濃度Box-5作用BAECs，Western blot檢測(cè)胞內(nèi)Wnt5a及自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)水平顯示，Box-5濃度為50 μmol·L-1時(shí)Wnt5a的表達(dá)水平顯著低于其他組(P<0.001)，且LC3II較C組(0 μmol·L-1)顯著升高(P<0.001,圖5)。因此確定Box-5處理濃度50 μmol·L-1為抑制BAECs中Wnt5a表達(dá)的最適濃度。

A. 蛋白表達(dá)印跡圖；B、C. 直方圖。ns.無(wú)差異；*. P<0.05；***. P<0.001。下同

2.5 Wnt5a對(duì)BCG誘導(dǎo)BAECs自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為確定Wnt5a對(duì)BCG感染BAECs自噬的調(diào)控作用，用Box-5與BCG單獨(dú)或共處理BAECs，Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、Atg5、Atg7及P62的表達(dá)水平，結(jié)果顯示， Box-5+BCG組較BCG組自噬相關(guān)因子LC3II、Atg5、Atg7及P62的蛋白水平表達(dá)均明顯降低(P<0.01,圖6)。表明Wnt5a對(duì)BCG誘導(dǎo)的BAECs細(xì)胞自噬有調(diào)控作用，且抑制Wnt5a的表達(dá)下調(diào)BCG誘導(dǎo)的BAECs細(xì)胞自噬。

A. 蛋白表達(dá)印跡圖；B～E. 直方圖

2.6 Wnt5a對(duì)BCG誘導(dǎo)BAECs自噬體形成的影響

LC3是自噬體成膜過(guò)程中的重要參與因子，被用來(lái)作為自噬體形成的標(biāo)記[18]，自噬形成時(shí)，RFP-LC3 融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成熒光斑點(diǎn)。為了進(jìn)一步探究Wnt5a對(duì)BCG感染的BAECs細(xì)胞自噬的調(diào)控作用，免疫熒光染色檢測(cè)BAECs內(nèi)LC3綠色熒光斑點(diǎn)數(shù)量及亮度。結(jié)果顯示，BCG感染BAECs內(nèi)LC3熒光斑點(diǎn)(綠色)數(shù)量與熒光強(qiáng)度較C組均明顯增加，且Box-5+BCG 組較BCG 組細(xì)胞熒光斑點(diǎn)數(shù)量和強(qiáng)度均明顯降低(圖7)。表明抑制Wnt5a對(duì)BCG感染BAECs細(xì)胞自噬體的形成有抑制作用，進(jìn)一步證明抑制Wnt5a的表達(dá)下調(diào)了BCG誘導(dǎo)的BAECs細(xì)胞自噬。

免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC3的表達(dá)，LC3為綠色，DAPI為藍(lán)色，放大倍數(shù)100

2.7 Wnt5a調(diào)控BCG誘導(dǎo)的BAECs細(xì)胞自噬機(jī)制

為了探討Wnt5a調(diào)控BCG感染的BAECs細(xì)胞自噬機(jī)制，用Box-5及BCG單獨(dú)或共處理BAECs，Western blot檢測(cè)非經(jīng)典Wnt/Ca2+通路相關(guān)因子Wnt5a、CaMKII及NFAT蛋白水平表達(dá)。結(jié)果顯示，BCG感染BAECs內(nèi)Wnt5a、CaMKII及NFAT的蛋白水平較C組均升高(P<0.05)，Box-5+BCG組相較于BCG組Wnt5a、CaMKII及NFAT的蛋白水平均降低(P<0.05,圖8)，結(jié)果表明，Wnt5a介導(dǎo)非經(jīng)典Wnt/Ca2+通路調(diào)控BCG誘導(dǎo)的BAECs細(xì)胞自噬。

A. 蛋白表達(dá)印跡圖；B. 直方圖

3 討 論

結(jié)核病是由Mtb感染引發(fā)通過(guò)呼吸道傳播的人畜共患傳染病，也是世界上最致命的單一病原體死因，肺結(jié)核為最常見(jiàn)的結(jié)核病[19]。肺作為機(jī)體與外界之間的主要屏障，通過(guò)不同類(lèi)型上皮細(xì)胞組成一層連續(xù)的上皮細(xì)胞層，構(gòu)成對(duì)吸入物質(zhì)和病原體的物理和生物屏障[20]，肺上皮細(xì)胞是抵御肺部感染的第一道防線，具有防止病原體和毒素侵害的作用[21]，也是微生物防御的積極效應(yīng)器，對(duì)肺的先天免疫功能和適應(yīng)性免疫功能都起著重要的作用[22]。目前分離BAECs方法有機(jī)械分散法、組織塊培養(yǎng)法和酶消化分離法等，各有優(yōu)缺點(diǎn)[23-24]。本研究采用酶聯(lián)合消化法和機(jī)械刮刷法獲取BAECs，而在分離BAECs過(guò)程中可能混合其他細(xì)胞(如纖維細(xì)胞和肌肉細(xì)胞等)，利用不同細(xì)胞貼壁時(shí)間不同，差速貼壁純化BAECs。角蛋白(cytokeratin，CK)是細(xì)胞骨架中間絲蛋白，特異性表達(dá)于上皮細(xì)胞，其在維持上皮細(xì)胞形態(tài)完整性中扮演重要角色[25-26]，研究表明，CK14是上皮細(xì)胞基底細(xì)胞特異性表面標(biāo)記抗原[27-28]，CK5為細(xì)胞骨架中間絲蛋白，具有維持上皮細(xì)胞形態(tài)完整性作用，因此，本研究將CK5和CK14作為鑒定上皮細(xì)胞的標(biāo)記，采用免疫熒光鑒定分離的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)分離純化的上皮細(xì)胞純度極高，因此，本研究提供了一種純度較高的分離BAECs的方法，對(duì)探究牛屬動(dòng)物結(jié)核病感染及發(fā)病機(jī)制具有重要作用。

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)分解代謝過(guò)程，通過(guò)溶酶體降解過(guò)程維持體內(nèi)平衡或清除入侵的病原體，自噬及其相關(guān)途徑是免疫和炎癥的中心穩(wěn)態(tài)機(jī)制[29]。Wnt5a是一種主要的非經(jīng)典Wnt配體，存在于上皮細(xì)胞中[30]，Wnt5a 介導(dǎo)相關(guān)自噬通路是宿主細(xì)胞先天免疫的重要組成部分，也是限制病原菌感染的關(guān)鍵[31]。ESAT-6分泌系統(tǒng)-1(ESX-1)作為Mtb毒力決定因子，ESX-1基因是阻止吞噬體成熟的關(guān)鍵，由RD1基因位點(diǎn)編碼，缺乏RD1是導(dǎo)致BCG毒力減弱的原因，也是誘導(dǎo)細(xì)胞自噬關(guān)鍵[32]。因此，研究Wnt5a與自噬的關(guān)系對(duì)肺結(jié)核的預(yù)防和治療具有現(xiàn)實(shí)意義。本研究探討抑制胞內(nèi)Wnt5a對(duì)BCG感染BAECs細(xì)胞自噬的影響，結(jié)果表明Wnt5a對(duì)BCG誘導(dǎo)的BAECs細(xì)胞自噬有調(diào)控作用，且抑制Wnt5a的表達(dá)下調(diào)了BCG誘導(dǎo)的BAECs細(xì)胞自噬。進(jìn)一步探究 Wnt5a對(duì) BCG誘導(dǎo)BAECs細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制對(duì)結(jié)核預(yù)防和治療具有重要意義。

Wnt5a與細(xì)胞膜上的Fzd受體和Ror2受體結(jié)合，通過(guò)CaMKII及鈣調(diào)磷酸酶的作用，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加，進(jìn)而激活非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)途徑。Ca2+在結(jié)核發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，Mtb操縱Ca2+信號(hào)以阻止吞噬體成熟及吞噬體和溶酶體融合的能力已被廣泛研究[33]。Kim等[34]在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Wnt5a/Ca2+信號(hào)通路在炎癥內(nèi)皮細(xì)胞中被激活，能迅速誘發(fā)COX-2、IL-6 及IL-8 等炎性因子的表達(dá)；BLANC等[35]發(fā)現(xiàn)，Wnt5a 通過(guò)Wnt/Ca2+信號(hào)參與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)?。灰灿醒芯堪l(fā)現(xiàn)非經(jīng)典Wnt5a/Ca2+/CaN/NFAT信號(hào)在胚胎手指細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[36]，非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)途徑成為目前研究的熱點(diǎn)。本研究探究抑制Wnt5a對(duì)BCG感染BAECs的Wnt/Ca2+信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明，Wnt5a介導(dǎo)非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)通路調(diào)控BCG誘導(dǎo)BAECs細(xì)胞自噬。根據(jù)是否有 mTOR信號(hào)參與可將自噬分為 mTOR 信號(hào)依賴(lài)性自噬和mTOR非依賴(lài)性自噬[37]，異丙酚通過(guò)Ca2+/CaMKKβ/AMPK/mTOR通路抑制自噬而介導(dǎo)氧糖剝奪再充氧誘發(fā)的神經(jīng)元損傷[38]，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的積累激活CaMKKβ/AMPK信號(hào)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致mTOR信號(hào)抑制，從而誘導(dǎo)自噬[39]，因此，Wnt5a/CaMKII對(duì)BCG誘導(dǎo)BAECs細(xì)胞自噬的調(diào)控所依賴(lài)的自噬通路有待進(jìn)一步探究，這將為結(jié)核病預(yù)防和控制提供新依據(jù)。

4 結(jié) 論

應(yīng)用膠原酶I、胰酶和DNase I酶聯(lián)合消化法結(jié)合細(xì)胞刮刷法，成功分離培養(yǎng)純度和活率較高的BAECs，BCG感染促進(jìn)BAECs胞內(nèi)Wnt5a的表達(dá)及細(xì)胞自噬，抑制Wnt5a的表達(dá)下調(diào)BCG誘導(dǎo)的BAECs細(xì)胞自噬，且Wnt5a介導(dǎo)非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)通路調(diào)控BCG誘導(dǎo)的BAECs細(xì)胞自噬。