基于PCR和LFS技術(shù)的摻假豌豆成分快速檢測

王 凱, 屈 瑋, 姚幫本,2, 徐建國, 姚 麗

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601;2.安徽省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院,安徽 合肥 230051)

目前摻假問題已成為包括加工、流通和餐飲在內(nèi)的整個食品供應(yīng)鏈中的質(zhì)量問題。摻假通常是指在高價原料中摻入配料或替代較便宜的配料,以賺取更多利潤和/或在食品制造、加工、包裝或儲存過程中不遵守衛(wèi)生規(guī)則[1]。市面上已經(jīng)出現(xiàn)各種摻假行為,包括油、蜂蜜、乳制品、果汁、咖啡、面粉和肉類產(chǎn)品等摻假[2-4]。近年來,也出現(xiàn)各種豆類摻假現(xiàn)象,以綠豆食品為例,一些企業(yè)為獲取高額利潤,常利用豌豆、大豆等其他原材料充當(dāng)綠豆食品出售[5-6],特別在綠豆糕中,有些綠豆糕中豌豆占主要成分。這些對消費市場產(chǎn)生了負(fù)面影響,損害了國民經(jīng)濟,在某些情況下對特殊人群(如過敏反應(yīng)者)產(chǎn)生健康威脅。為了防止此類食品欺詐事件的發(fā)生,需要開發(fā)一種可靠且靈敏的分析工具,以便對豆類品種進行鑒定。

針對摻假檢測,研究人員基于蛋白質(zhì)和DNA分析技術(shù)開發(fā)了許多摻假材料定性和定量分析方法?；诘鞍踪|(zhì)的檢測方法,包括高效液相色譜、電泳技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附測定等[7-8],在物種鑒定中顯示出令人滿意的結(jié)果。但該方法取決于多肽靶標(biāo)的檢測,該靶標(biāo)始終是組織依賴性的[9],當(dāng)經(jīng)過熱處理時,它們較低的靈敏度缺點就會顯現(xiàn),并且這些檢測方法大多需要昂貴儀器、危險有毒樣品制備以及熟練的人員,相對來說難以準(zhǔn)確、方便且廉價地進行摻假的檢測。與基于蛋白質(zhì)檢測方法相比,基于DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)被認(rèn)為是一種更可靠穩(wěn)定的方法。首先,DNA可以承受高溫引起的降解,因此,足夠長且完整的片段仍可用于擴增[10];其次,PCR擴增以高靈敏度和特異性為特征,可以通過非常少量的DNA分析就能檢測出低含量的豌豆摻假。此外,基因組DNA可以從任何植物組織中提取,并且不受環(huán)境條件或植物發(fā)育階段的影響[11]。但在所有PCR方法中,用于物種鑒定的直接PCR分析都需要凝膠電泳相配合[12],電泳檢測步驟相對繁瑣,檢測時間長,并且會接觸有毒甚至致癌藥物。然而,用于常規(guī)驗證檢測和現(xiàn)場檢測的側(cè)向流試紙條(lateral flow strip,LFS)技術(shù)成為PCR后電泳檢測良好的替代方法。對于PCR-LFS檢測,首先需要在5’端標(biāo)記基因特異性引物(例如,通過生物素和熒光素修飾),然后用于擴增,最后使用試紙條檢測標(biāo)記PCR產(chǎn)物[13]。由于LFS技術(shù)易于使用,反應(yīng)迅速且價格合理,同時該技術(shù)無需經(jīng)過培訓(xùn)的操作人員和配備精良的實驗室即可對待檢成分進行適當(dāng)?shù)臋z測,使其被越來越廣泛地使用。此外,由于其響應(yīng)時間短(5～10 min),并且可以進行原位測試,因此可以在短時間內(nèi)采取糾正措施。

本文采用PCR和LFS相結(jié)合方法,對綠豆食品中的摻假豌豆成分進行快速檢測。實驗采用穩(wěn)定和高效的PCR技術(shù),擴增出生物素(Biotin)和異硫氰酸熒光素(FITC)雙標(biāo)記的特異性的豌豆基因產(chǎn)物,然后用識別目標(biāo)分析物的LFS技術(shù)進行檢測,可以在2 h內(nèi)快速、方便地對摻假豌豆成分進行可視化鑒別,該方法僅依靠肉眼觀察或便攜式設(shè)備就可以進行圖像的檢測和分析。

1 材料方法

1.1 實驗樣本

實驗所需的豌豆、綠豆、黑豆、紅豆、蠶豆和蕓豆等均在超市購買。摻假樣本的制備是先將綠豆和豌豆磨成粉,然后將豌豆粉末按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%的比例摻入綠豆粉中作為摻假樣本。

1.2 實驗試劑

三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、鹽酸、乙二胺四乙酸、硼酸、氯化鈉、氫氧化鈉、乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、彩色乳膠微球和其他實驗中所用的化學(xué)試劑均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司;鏈霉親和素(SAV)、牛血清蛋白(BSA)、dNTP混合液、蛋白酶K,核糖核酸酶、DNA Marker,4S Red plus核酸染料、瓊脂糖粉末、TBE粉末等均購于生工生物工程(上海)股份有限公司;FITC抗體、二抗均購于廣州格瑞林生物科技有限公司;結(jié)合墊、樣品墊、聚氯乙烯(PVC)結(jié)合墊、吸收墊和硝酸纖維素(NC)膜均購于潔寧生物技術(shù)公司;實驗所需FITC和Biotin功能化修飾上下游引物由通用生物系統(tǒng)有限公司合成。

1.3 實驗儀器

實驗所用儀器有粉碎機、分析天平、水浴鍋、PCR儀、電泳儀、核酸測定儀、凝膠成像系統(tǒng)、高速冷凍離心機、純水儀、恒溫干燥箱、pH計、噴膜機和全自動切條機等。

1.4 DNA提取

本實驗采用磁珠法提取DNA,該方法參考文獻(xiàn)[14]方法并稍做修改。將豌豆用粉碎機磨成粉,稱取50 mg豌豆粉加入1.5 mL 離心管管中,然后加入700 μL SDS緩沖液,30 μL蛋白酶和5 μL核糖核苷酸酶,在65 ℃水浴鍋中加熱1 h。水浴完成后,冷卻至室溫,12 000 r/min離心1 min,取上清加入新的離心管,加入1/10體積分?jǐn)?shù)醋酸鉀溶液,冰水浴10 min。水浴完成后,12 000 r/min離心10 min,取上清加入新的離心管,加入10 μg磁珠,混勻,再加入1/2體積分?jǐn)?shù)PEG/NaCl溶液,混勻5 min。之后用磁力架磁力吸附棄上清,用1 mL 75%乙醇清洗3次,37 ℃烘箱干燥10 min。干燥完成加入100 μLTE緩沖液,65 ℃水浴10 min,磁力吸附取上清加入到新的離心管,離心管中液體即為提取的豌豆DNA。

1.5 乳膠微球與抗體偶聯(lián)

乳膠微球與抗體偶聯(lián)參考文獻(xiàn)[15]方法并稍做修改。取1 mL0.05 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH=8.2),30 μL 10 mg/mL EDC和30 μL 10 mg/mL NHS,渦旋混勻,加10 μL彩色羧基化聚苯乙烯乳膠微球,混勻,超聲10 s,孵育30 min。孵育完,13 000 r/min離心15 min,棄上清,1 mL硼酸鹽緩沖液重懸,超聲10 s,加4 μL 1 mg/mL FITC抗體,渦旋混勻,孵育2 h后,加100 μL BSA封閉1 h。封閉完,13 000 r/min離心15 min,棄上清,100 μL BSA重懸,即偶聯(lián)完成。

1.6 PCR擴增及電泳檢測

PCR擴增體系為25 μL,該體系含有1 μL DNA提取物、10 mmol/L 10×Buffer、待優(yōu)化的上下游引物、0.2 mmol/L的dNTP、待優(yōu)化的MgCl2和1 U Taq DNA聚合酶。樣品在PCR儀(Bio-Rad)中進行擴增,擴增條件為95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,在待優(yōu)化的退火溫度下退火30 s,72 ℃延伸30 s,3個循環(huán),最終72 ℃延伸5 min。在相同條件下用水代替提取的模板DNA作為陰性對照。以1×TBE為緩沖液,4S Red plus為核酸染料,經(jīng)3%瓊脂糖電泳鑒定。

1.7 試紙條組裝和檢測過程

LFS由5部分組成,包括裝載樣品溶液的樣品墊、裝載偶聯(lián)了FITC抗體的乳膠微球結(jié)合墊、固定識別分子的硝酸纖維素膜、吸水墊和支撐所有組件的支撐卡。抗FITC抗體的二抗和SAV分別固定在NC膜上作為豌豆檢測的控制線(T線)和檢測線(C線)。用含有0.05 mol/L Tris HCl(pH=8.0)、0.15 mol/L NaCl和0.25% Triton X-100的緩沖液使樣品墊飽和。用含有0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)、5%蔗糖、1%海藻糖、0.3%吐溫20和0.25%PEG-20000的緩沖液預(yù)處理結(jié)合墊。此外,將5 μL制備的偶聯(lián)FITC抗體乳膠微球滴加在結(jié)合墊上。所有處理過的組分在37 ℃下干燥2 h。LFS檢測過程是將5 μL PCR擴增產(chǎn)物和30 μL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)預(yù)混合,然后直接滴加在試紙條上的樣品墊,5～10 min后觀察T線和C線顯色情況。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 實驗檢測原理

本實驗的操作過程及原理如圖1所示。簡單地說,通過磁珠法提取各豆類的DNA,加入Biotin和FITC分別修飾上游引物和下游引物,常規(guī)PCR擴增得到Biotin和FITC雙修飾的目標(biāo)產(chǎn)物,然后經(jīng)過試紙條檢測。試紙條檢測過程中,當(dāng)有目標(biāo)產(chǎn)物時,產(chǎn)物一端FITC與結(jié)合墊上乳膠微球偶聯(lián)的FITC抗體通過抗原抗體識別,而另一端Biotin被T線上SAV捕獲從而顯色,未結(jié)合的乳膠微球被C線上的二抗捕獲顯色;相應(yīng)地,當(dāng)沒有目標(biāo)產(chǎn)物時,T線不會顯色,而C線上二抗會捕獲未結(jié)合的乳膠微球上的抗體而顯色。

圖1 實驗檢測原理

2.2 引物設(shè)計與可行性驗證

引物設(shè)計是實驗的關(guān)鍵,設(shè)計過程中要考慮引物的特異性,若出現(xiàn)非特異性擴增,則試紙條會出現(xiàn)假陽結(jié)果。此外,加工過程中DNA完整性會被破壞,因此選取的擴增片段盡量要短。本實驗引物設(shè)計過程中,首先通過美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)找到豌豆MEY基因差異序列,然后使用Primer5軟件設(shè)計得到本實驗所用的引物,引物序列見表1所列。該引物通過基于局部比對算法的搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)檢索,只能擴增出豌豆MEY基因,擴增片段大小為101 bp,符合實驗要求。此外,電泳和試紙條的預(yù)實驗結(jié)果也表明該引物的可行性。

表1 引物序列

2.3 PCR的優(yōu)化分析

因為本實驗采用PCR和LFS相結(jié)合的方法,需要考慮PCR的擴增效率和非特異性擴增,擴增效率影響檢測的靈敏度,非特異性擴增特別是引物二聚體會導(dǎo)致試紙條出現(xiàn)假陽,所以需要對PCR條件進行優(yōu)化。影響PCR條件包括模板量、退火溫度、dNTP、引物、循環(huán)數(shù)和鎂離子等,本研究就退火溫度、引物量和鎂離子3個重要因素進行優(yōu)化,結(jié)果如圖2所示。

退火溫度是PCR的關(guān)鍵因素,直接影響引物的結(jié)合效率,溫度過高引物結(jié)合效率低甚至無法結(jié)合,過低結(jié)合特異性低[16]。圖2a中:M代表M-500 bp DNA Marker;1～8分別代表退火溫度為55.0、56.0、57.3、59.0、61.3、63.1、64.3、65.0 ℃。由圖2a可知:泳道1～4條帶亮度幾乎相同;從泳道4(59.0 ℃)后,條帶逐漸變暗,擴增效率逐漸降低;泳道6(63.1 ℃)以后沒有目標(biāo)條帶;空白對照組也未出現(xiàn)引物二聚體。因此選取退火溫度為59.0 ℃進行鎂離子優(yōu)化分析。

圖2 PCR條件的優(yōu)化結(jié)果

鎂離子是Taq DNA聚合酶發(fā)揮作用的活性中心,鎂離子濃度的高低會影響酶的活性,進而影響反應(yīng)的擴增效果。圖2b中:M代表M-500 bp DNA Marker;1～7分別代表鎂離子濃度為1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00 mmol/L。由圖2b可知,泳道1～7均在101 bp附近出現(xiàn)唯一的目標(biāo)條帶,泳道1條帶亮度較低,泳道2(1.75 mmol/L)以后條帶亮度幾乎一樣,因此選取鎂離子濃度為1.75 mmol/L進行引物優(yōu)化分析。

引物量是PCR另一個重要因素,過低影響擴增效率,過高影響特異性。圖2c中:M代表M-500 bp DNA Marker;1～7分別代表修飾引物濃度為0.02、0.04、0.08、0.12、0.20、0.30、0.40 μmol/L。由圖2c可知,泳道1～7均在101 bp附近出現(xiàn)唯一的目標(biāo)條帶,且1～5條帶亮度隨引物濃度的增加條帶越亮,泳道5(0.20 μmol/L)條帶達(dá)到最亮,泳道6和7條帶亮度不再增加,說明最佳修飾引物加入量為0.20 μmol/L。

2.4 特異性檢測結(jié)果

特異性是實際應(yīng)用的關(guān)鍵,本文選取8種常見的豆類,這些豆類在綠豆加工過程中經(jīng)常會涉及到,因此適合用來作特異性分析。針對豌豆特異性檢測,本文利用上述優(yōu)化好的條件進行PCR擴增,最后通過LFS檢測,結(jié)果如圖3所示。圖3中，試線條1～8分別代表豌豆、大豆、綠豆、黑豆、紅豆、蠶豆、蕓豆、鷹嘴豆，由圖3可知,只有試紙條1(豌豆)T線呈陽性結(jié)果,其他試紙條均為陰性,灰度掃描圖也相對應(yīng)。這表明該測定方法對目標(biāo)物種具有高度特異性,不會導(dǎo)致其他物種的錯誤識別。

圖3 特異性檢測結(jié)果

2.5 靈敏度檢測結(jié)果

為了進一步檢測PCR-LFS方法的靈敏度,將提取質(zhì)量濃度為120 ng/μL豌豆DNA模板進行倍比稀釋,依次稀釋為原來模板的1/10、1/100、1/1 000、1/10 000、1/100 000,各取1 μL模板進行檢測,檢測結(jié)果如圖4所示。

圖4 靈敏度檢測結(jié)果

圖4中,試紙條1～7對應(yīng)加入豌豆DNA的量為120、12、1.2、0.12、0.012、0.001 2、0 ng,結(jié)果顯示試紙條1～4檢測線都顯色,且顯色顏色逐漸降低,5～7沒有顯線,灰度掃描圖也相對應(yīng),說明本實驗方法的最低檢測線為0.12 ng。

2.6 樣品摻假檢測結(jié)果

考慮本實驗方法的實際應(yīng)用效果,模擬了綠豆中豌豆摻假的過程,將豌豆粉按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.0%～0%摻入到綠豆粉中,混勻,取50 mg摻假樣本提取DNA,用建立的PCR-LFS方法檢測,檢測結(jié)果如圖5所示。圖5中，試線條1～9分別對應(yīng)的豌豆粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%，從圖5可以看出，試紙條1～6的T線顯色,且顏色逐漸變淺,試紙條6(0.5%)以后不顯色,灰度掃描圖也相對應(yīng),說明最低可檢測的樣品摻假量為0.5%?？紤]到實際摻假情況,商家為自身利益摻假豌豆量一般高于1.0%,因此本方法最低0.5%摻假可檢測結(jié)果完全滿足實際的檢測要求。

圖5 摻假檢測結(jié)果

3 結(jié) 論

本文以豌豆特異性基因為基礎(chǔ),采用PCR-LFS檢測技術(shù),建立一種快速、簡便的摻假豌豆成分檢測方法。實驗設(shè)計了豌豆的特異性引物序列,并驗證了引物的可行性,為了保證PCR的擴增效率和特異性,分別對退火溫度、修飾引物濃度和鎂離子濃度進行優(yōu)化,最后進行LFS檢測。該方法既擁有PCR特異性強、靈敏度高的特點,又具有LFS的快速、簡便的優(yōu)勢,有利于簡化操作步驟,縮短檢測時間,保護實驗人員的安全。此外,只需要改變特異性引物和擴增條件,就能對其他豆類品種進行鑒定,在物種認(rèn)證和追溯性方面具有廣泛的應(yīng)用價值。