薄荷油納米乳液的制備及抗菌特性研究

陳瑩瑩, 白禮濤, 劉 抗, 李強明, 羅建平, 查學強

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

薄荷油(peppermint oil,PO)是一種呈薄荷香味的無色或淡黃色澄清液體,具有祛除異味,防腐、抑菌及驅(qū)蟲等功效,常添加在糖果、糕點等加工食品、飲料、化妝品中,尤其是運用其抗菌和抗真菌活性作為食品防腐劑在食品中廣泛應用[1]。由于其沸點低、易揮發(fā)、不溶于水、生物利用率低，極大程度地阻礙了其在食品領(lǐng)域中的應用[2]。因此,基于成本效益低、生物相容性好、易于制備等特點,開發(fā)一種水包油乳液的輸送系統(tǒng),從而提高PO的水溶性及生物利用率是目前被廣泛研究的熱點。

近年來,水包油型乳液被廣泛用于包埋疏水性生物活性物質(zhì),在化妝品、制藥和食品工業(yè)都有廣泛應用[3]。乳液主要可根據(jù)其粒徑分為普通乳液(>200 nm)和納米乳液(50～200 nm)[4]。納米乳液因其納米級粒徑而具有極高的表面活性和吸附性,常用于構(gòu)建營養(yǎng)素的遞送體系。同時,納米乳液被認為是一種近熱力學穩(wěn)定體系[5],在其貯藏過程中不會出現(xiàn)聚集、絮凝、沉淀、奧氏熟化等現(xiàn)象[6]。

本文以乳清分離蛋白(whey protein isolate,WPI)和蓮藕支鏈淀粉(lotus root amylopectin,LRA)通過干熱反應偶聯(lián)得到的復合物WPI-LRA作為乳化劑,高壓均質(zhì)制備穩(wěn)定的水包油型PO納米乳液,研究不同油相比、芯壁比(CWR),對乳液粒徑、儲存穩(wěn)定性的影響以及納米乳液抑菌特性的測定。

1 材料與方法

1.1 材料

無花藕(合肥大興農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場);薄荷油(蘇州嘉葉生物科技有限公司);異丙醇、乙醇、異辛烷(國藥集團化學試劑有限公司);甲醇(西隴化工股份有限公司);超純水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

1.2 儀器

79HW-1恒溫磁力攪拌器(常州國宇儀器制造有限公司);FD-1D-80真空冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司);AL104電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);Nano-Zs90型納米粒度及Zeta電位分析儀(英國Malvern儀器公司);DHG-9070A 電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

(1) WPI-LRA復合物乳化劑的制備。稱取質(zhì)量比固定的WPI與LRA粉末相混合,完全溶解在蒸餾水中,冷凍干燥。收集冷凍干燥后得到的粉末,放置在底部盛有飽和KI溶液的干燥器中反應13.6 h,得到WPI-LRA復合物[7],待使用前,樣品一直存放在4 ℃冰箱。

(2) 乳液的制備。WPI-LRA復合物在水中分散后不斷攪拌(3 h),得到乳化劑水相溶液(質(zhì)量分數(shù)為1%)。純PO、不同體積比的PO與大豆油(soybean oil,SO)(1∶5、1∶1、5∶1)分別作為油相。乳化劑水相溶液與油相混合后,經(jīng)高速均質(zhì)(20 000 r/min,1 min)得到粗乳液,再分別在10、40、70、105 MPa的高壓下均質(zhì)1～7次從而得到粒徑不同的乳液[8]。高壓均質(zhì)制備樣品時,通過設(shè)定15 ℃的冷卻水系統(tǒng)溫度來控制均質(zhì)閥和樣品出入口的溫度。

(3) 乳液粒徑的測量。乳液經(jīng)濃度為8 mmol/L、pH=7.0的磷酸緩沖液稀釋至半透明狀態(tài),從而可以避免多次散射效應。使用動態(tài)光散射儀(dynamic light scattering,DLS)在室溫下測定乳液的平均粒徑。

(4) 乳液微觀結(jié)構(gòu)的表征。在載玻片上分散少量新鮮制備的乳滴,使用普通光學顯微鏡(400倍)觀察其形態(tài)并拍照。

(5) 實驗菌懸浮液的制備。經(jīng)固體培養(yǎng)基挑取金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii),并接種到LB肉湯液體培養(yǎng)基上。醒菌24 h使其活化后,再分別取1% 的金黃色葡萄球菌和阪崎腸桿菌于新鮮的LB中備用。

(6) 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)的測定。首先加入經(jīng)滅菌處理后的LB液體培養(yǎng)基100 mL置于錐形瓶中,然后向錐形瓶中分別加入6.00、2.00、1.00、0.50、0.25 mL的PO和PO納米乳液,再分別加入金黃色葡萄球菌或阪崎腸桿菌懸浮液1 mL,在保溫箱中培養(yǎng)10 h后,觀察錐形瓶中液體的渾濁情況[9]。

(7) 菌落生長曲線的測定。為了測定金黃色葡萄球菌和阪崎腸桿菌2種細菌在純PO和包埋PO的納米乳液的生長情況,菌落懸浮液經(jīng)培養(yǎng)75 h,每隔一段時間取2 mL液體于比色皿中,利用紫外分光光度計測定OD600值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均重復3次,數(shù)據(jù)取(平均值±標準差),采用SPASS數(shù)據(jù)處理軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 油相對乳液粒徑的影響

2.1.1 均質(zhì)壓力對乳液粒徑的影響

本文以PO作為油相,分析不同均質(zhì)壓力及均質(zhì)次數(shù)對乳液粒徑的影響。首先配制質(zhì)量分數(shù)為1%的WPI-LRA乳化劑水相溶液,再將PO分散在WPI-LRA乳化劑水相溶液中,使其質(zhì)量分數(shù)為10%。并分別在10、40、70、105 MPa的高壓下均質(zhì)7次得到乳化液。利用動態(tài)光散射儀測定不同均質(zhì)壓力及不同均質(zhì)次數(shù)下的乳化液的平均直徑。不同均質(zhì)壓力下乳液的微觀結(jié)構(gòu)如圖1所示,從圖1可以看出，乳液粒徑隨著均質(zhì)壓力的增大而增大,這可能是由于這類精油物質(zhì)自身特性導致的。文獻[10]研究表明裝載2種不同精油時,液滴尺寸也表現(xiàn)出相同的趨勢。這種現(xiàn)象可以用奧氏熟化(Ostwald ripening)理論解釋,由于油的易擴散性,小液滴匯集成大液滴從而導致平均粒徑增大[11]。

圖1 3種不同均質(zhì)壓力下乳液的微觀結(jié)構(gòu)

2.1.2 均質(zhì)次數(shù)對乳液粒徑的影響

本文以混合油相作為油相,研究在不同均質(zhì)次數(shù)下制備得到的乳液粒徑的變化情況。首先,SO和PO以不同比例混合,再將混合油相分散在質(zhì)量分數(shù)為1% 的WPI-LRA乳化劑水相溶液中,在105 MPa下進行高壓均質(zhì)，測定的粒徑結(jié)果如圖2所示,從圖2可看出,當SO體積比逐漸增大且均質(zhì)次數(shù)逐漸增多到7次時,乳液粒徑可以達到納米級。文獻[12]的研究結(jié)果與本文一致,向油相中添加一些水不溶性成分(如SO)時,可以有效抑制出現(xiàn)奧氏熟化現(xiàn)象。SO因其極性較低、密度較高、黏度大的特性常被廣泛用于增溶劑或載體溶劑,從而提高色素、精油、香料、維生素等物質(zhì)的生物利用率。

圖2 均質(zhì)次數(shù)對乳液粒徑的影響

2.2 混合油相對乳液黏度和粒徑的影響

混合油相成分對乳液黏度和粒徑的影響如圖3所示。從圖3可以看出,不同比例的混合油相對乳液的粒徑和黏度有很大的影響。隨著SO體積分數(shù)的增加,粒徑逐漸減小,黏度呈現(xiàn)上升的趨勢，當SO體積分數(shù)達到20%時,與純PO為油相制備的乳液相比,粒徑從1 592 nm減小到310 nm，隨著SO體積分數(shù)繼續(xù)升高,粒徑小幅減小。同時,隨著SO體積分數(shù)的增大,乳液的黏度由25.6 mPa·s增加到45.1 mPa·s。SO體積分數(shù)對液滴粒徑和黏度的影響趨勢與文獻[13]的報道一致。經(jīng)分析,液滴的直徑會極大程度地影響乳液的流變行為[14]。在同一剪切速率下,粒徑的減小會使黏度升高。降低的粒徑和提高的黏度有益于提高乳液的穩(wěn)定性。綜上所述,使用經(jīng)PO和SO組成的混合油相可以有效抑制純PO發(fā)生奧氏熟化。

圖3 混合油相對PO乳液粒徑和黏度的影響

2.3 CWR對乳液粒徑和多分散系數(shù)的影響

CWR指芯材與壁材之間的質(zhì)量比,其對乳液包載效率有很大影響。乳液在工業(yè)制備過程中,CWR與負載營養(yǎng)素的含量呈正相關(guān)趨勢,有益于提高工廠的效益。但CWR也不能無限度增大,由于負載過量的營養(yǎng)素或藥物時,極易導致絮凝或凝聚等現(xiàn)象發(fā)生,從而使得乳液的物理化學性質(zhì)發(fā)生相應變化。只有選擇合適的CWR,才可以制備出合適的乳液。因此,本研究以質(zhì)量分數(shù)為1%的WPI-LRA為乳化劑,SO和PO為混合油相,均質(zhì)壓力為105 MPa的條件下,分析不同芯材載量對乳液粒徑和多分散指數(shù)(polydisperse index,PDI)的影響,從而探究制備乳液最合適的CWR,結(jié)果見表1所列,由表1可知，當CWR由1∶3升高到3∶3時,乳液的粒徑只有略微的改變,隨著CWR升高到4∶3時,乳液粒徑由182 nm升高到251 nm。主要原因在于油相比過大時,導致乳化劑并沒有被完全乳化而出現(xiàn)了懸浮,營養(yǎng)素沒有被完全包載。文獻[15]指出,可以根據(jù)PDI值的大小判斷乳液的分散情況與均一性，較小的PDI值表明乳滴分散集中,粒徑分布較窄,乳液均一性好。由表1可知,CWR為3∶3時制備的乳液的粒徑和PDI值均最小,說明這是最適宜制備乳液的CWR值。

表1 不同CWR對乳液粒徑和PDI的影響

2.4 乳液儲藏穩(wěn)定性分析

30 d內(nèi)乳液粒徑的變化如圖4所示。

圖4 儲藏時間對30 d內(nèi)乳液粒徑變化

從圖4可以看出,乳液的粒徑會隨儲藏時間(1、15、30 d)的變化而發(fā)生相應改變,并且不同油相比(1∶5、1∶1、5∶1)制備的乳化液粒徑均呈現(xiàn)出逐漸增大的趨勢。V(PO)∶V(SO)為1∶5時,儲藏30 d后乳液的粒徑從176 nm增加到260 nm；V(PO)∶V(SO)為1∶1時,儲藏30 d后乳液的粒徑從205 nm增加到319 nm,而V(PO)∶V(SO)為5∶1時,儲藏30 d后乳液的粒徑從210 nm增加到344 nm。由此可以看出,PO體積比較高的油相制備的乳液的初始粒徑和最終粒徑都相對較大,且儲藏過程中略微出現(xiàn)了油滴懸浮的現(xiàn)象。

2.5 乳液的抑菌特性分析

2.5.1 最低抑菌濃度分析

最低抑菌濃度(MIC)指能夠抑制細菌生長、繁殖的最低藥物濃度。本文測定的MIC指制備的PO乳液抑制金黃色葡萄球菌和阪崎腸桿菌生長繁殖的最低濃度。乳液抑菌結(jié)果分析見表2所列。表2中：+表示加入該物質(zhì)；-表示未加該物質(zhì)。從表2可以看出,純PO與PO乳液對金黃色葡萄球菌和阪崎腸桿菌2種菌株的MIC均為0.50%,說明與純PO相比,納米乳液乳化體系對這2種菌株的抑制效果一致,并不會改變薄荷油的抑菌能力。原因在于納米乳化體系可以有效保護包埋的營養(yǎng)物質(zhì),阻止其出現(xiàn)氧化或揮發(fā)。文獻[16-17]研究結(jié)果與本文結(jié)果一致。

表2 乳液抑菌結(jié)果

2.5.2 菌落生長曲線分析

通過將金黃色葡萄球菌和阪崎腸桿菌與最低抑菌濃度的PO和納米乳液包埋的PO共同培養(yǎng),觀察在75 h內(nèi)對生長曲線的影響,從而測定其對這2種菌株生長情況的影響。培養(yǎng)測定時間主要分為以下4個階段：緩慢生長期(0～5 h)；快速生長期(5～18 h)；穩(wěn)定期(18～20 h)；凋亡期(20～45 h)。菌落的生長曲線如圖5所示,由圖5可知,單純?nèi)橐航M處理的金黃色葡萄球菌和阪崎腸桿菌的OD600曲線十分相似,表明單純?nèi)橐翰]有抑制細菌的生長，2種菌株對PO和PO納米乳液的敏感程度不同,表現(xiàn)為其OD600在不同時間達到最大值,且其最大值也不同;PO處理的阪崎腸桿菌在18 h時達到最大值0.875,而經(jīng)PO乳液處理的阪崎腸桿菌在12 h就達到最大值0.788。對于金黃色葡萄球菌,經(jīng)PO處理與PO納米乳液處理時,OD600均在12 h時達到最大值,然而PO組的OD600值為0.900,PO納米乳液處理時的OD600最大值為0.778。因此,不同菌屬經(jīng)PO乳液處理的OD600值均小于純PO組。

雖然純PO和PO納米乳液對2種菌株的MIC相同,但PO納米乳液更能抑制2種菌株的生長,表現(xiàn)出持續(xù)更長時間的抑菌能力。主要是PO經(jīng)納米乳液包埋后,一方面是由于納米級粒徑降低了乳液的傳質(zhì)阻力,有利于菌株被動吸附PO,因而PO的抑菌能力有所提高;另一方面由于納米乳化體系可以保護PO的有效生物活性成分,且提高了PO的溶解度和理化穩(wěn)定性,增大了生物活性成分與微生物的作用幾率,從而得以延長抑菌時間[18]。

圖5 菌落的生長曲線

3 結(jié) 論

PO和SO組成的混合油相可以有效抑制發(fā)生奧氏熟化現(xiàn)象。當PO與SO的體積比為1∶5時,經(jīng)高壓均質(zhì)7次后,可以得到粒徑為176 nm的納米乳液。設(shè)定CWR為3∶3時,制備得到的乳液粒徑和PDI均較小,為最合適的CWR。乳液儲藏穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明,不同PO與SO體積比的混合油相制備的乳液粒徑均隨儲藏時間的延長而增大,而且PO體積比越高的油相制備的乳液初始粒徑和最終粒徑都相對較大,并且儲藏期間出現(xiàn)了油滴懸浮現(xiàn)象。通過測定MIC可知，純PO和經(jīng)納米乳液包埋的PO的MIC相同，然而比較2種菌株恒溫培養(yǎng) 75 h 的生長曲線可知,PO納米乳液具有比PO持續(xù)時間更長的抑菌能力,即由WPI-LRA包埋PO的納米乳液具有時效更長的抑制微生物生長特性。