毛果楊接種雙色蠟蘑培養(yǎng)外生菌根的方法及其對毛果楊生長的影響

馬嘉楠, 楊穎麗

(西北師范大學生命科學學院，甘肅 蘭州 730000)

菌根是真菌與植物根系形成的共生體，一般分為外生菌根和內(nèi)生菌根.菌根在陸地植物營養(yǎng)器官中普遍存在.世界上約95%的維管束植物屬于典型的菌根家族植物[1]，雖然只有約3%的種子植物能夠與外生菌根真菌建立起菌根共生體系，但這些植物種類是溫帶、寒帶和部分熱帶地區(qū)森林和林地的主要樹種[2].外生菌根真菌在溫帶和北方森林生態(tài)系統(tǒng)中占主導地位[3]，其能與植物根部形成菌根共生結(jié)構(gòu)，即菌根的菌絲一部分連接植物根系而另一部分延伸到土壤中，增強宿主植物對土壤中水分和營養(yǎng)元素(特別是氮、磷)的吸收、利用，促進植物生長并增強植物的抗逆性[4-5].有關(guān)外生菌根共生體建立過程的研究較少[6]，在擔子菌中，雙色蠟蘑(Laccariabicolor)—毛果楊(Populustrichocarpa)[7]、松乳菇(Lactariusdeliciosus)—草莓樹(Arbutusunedo)[8]、黑孢塊菌(Tubermelanosporum)—冬青櫟(Quercusilex)幼苗[9]等幾種外生菌根的共生建立過程目前均有較多研究.對外生菌根的培養(yǎng)方法如溫室土培[10]和盆栽土培[11]有見報道.Souza et al[12]以泥炭—蛭石混合物作為基質(zhì)培養(yǎng)桉樹外生菌根，而Vuorinen et al[13]在硅基固態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌菌絲.隨著菌根真菌與宿主植物互作的分子機制等研究工作的不斷深入，建立不同外生菌根真菌與宿主植物形成外生菌根的無菌實驗模型也顯得更為迫切.

雙色蠟蘑屬于擔子菌亞門(Basidiomycotina)軸腹菌科(Hydnangiaceae)蠟蘑屬(Laccaria)，通過定殖于植物根部[14]，形成菌根菌絲網(wǎng)絡能提高植物的抗病性和抗逆性[15].楊樹廣泛分布于歐、亞和北美地區(qū)，具有生長快、產(chǎn)量高、易擴繁與適應性強等特性，多數(shù)種類具有較強的適應性[16].目前雙色蠟蘑與毛果楊都已完成基因組測序[17-18]，因此毛果楊-雙色蠟蘑共生體系成為研究林木外生菌根發(fā)育分子機制的理想模型.本研究以毛果楊和雙色蠟蘑為供試材料，以石英砂為基質(zhì)體外培養(yǎng)外生菌根，從形態(tài)學方面鑒定外生菌根，并研究了外生菌根真菌對共生植物的影響，旨在為外生菌根真菌與植物相互的分子機制研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

真菌菌株雙色蠟蘑和毛果楊組培幼苗，由法國農(nóng)業(yè)科學院Francis Martin院士惠贈.

1.2 方法

1.2.1 雙色蠟蘑的培養(yǎng) 雙色蠟蘑的菌絲體在固體培養(yǎng)基[Thiamine 0.05 g·L-1，CaCl20.05 g·L-1，NaCl 0.025 g·L-1，KH2PO40.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.15 g·L-1，(NH4)2HPO40.25 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g·L-1，葡萄糖10 g·L-1，麥芽糖提取物3 g·L-1，酵母提取物0.5 g·L-1]上培養(yǎng)，pH為5.8.25 ℃下暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)接到200 mL的MMN液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速200 r·min-1.培養(yǎng)好的菌絲用三層紗布過濾后備用.

1.2.2 毛果楊幼苗的培養(yǎng) 毛果楊幼苗在培養(yǎng)瓶中生長3～4周后，剪掉多余葉片，并剪切為2～3 cm長的莖段，在生根培養(yǎng)基(2%蔗糖+1 mg·L-1吲哚丁酸IBA)中培養(yǎng)2～3周后備用.培養(yǎng)條件為：光周期16 h(白天)，暗周期8 h(夜晚)；溫度為25 ℃(白天)和18 ℃(夜晚)，相對濕度為50%～60%，光照度為14 000 lx.

1.2.3 毛果楊根部接種雙色蠟蘑 培養(yǎng)瓶中裝入150 g石英砂，在25 mL培養(yǎng)液(Thiamine 0.05 g·L-1,CaCl20.05 g·L-1,NaCl 0.025 g·L-1,KH2PO40.5 g·L-1,MgSO4·7H2O 0.15 g·L-1,(NH4)2HPO40.25 g·L-1,FeSO4·7H2O 0.001 g·L-1,葡萄糖1 g·L-1)中培養(yǎng)，pH為5.8.121 ℃滅菌20 min，備用.將3.5 g培養(yǎng)好的菌絲接種到楊樹幼苗根部，置于裝有石英砂的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3周.培養(yǎng)條件：光周期16 h(白天)，暗周期8 h(夜晚)，溫度23 ℃(白天)，光照度14 000 lx.對照組為沒有菌絲的共培養(yǎng)培養(yǎng)液，每種處理設置6組重復，用于株高和鮮重生物量的測定.

1.2.4 外生菌根切片染色 毛果楊幼苗和雙色蠟蘑菌絲共培養(yǎng)3周后，對楊樹幼苗的菌根進行觀察分析.新鮮的外生菌根用多聚甲醛固定樣品4 h后，使用PBS溶液清洗3遍；隨后用4%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖進行包埋.使用振動切片機(Leica VT1000 S)制備橫切片(厚度25 μm).用小麥凝集素(WGA染料，終濃度為10 μg·mL-1)和碘化丙啶(PI染料，終濃度為1 μg·mL-1)進行染色，染色0.5 h后用PBS溶液清洗3次.利用激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV3000)觀察菌根的形態(tài).激發(fā)波長為488、561 nm.

1.2.5 毛果楊株高鮮重的測定 從石英砂中取出楊樹苗，清水洗凈根部殘留的石英砂，使用直尺測量株高；將楊樹苗瀝干水分后，使用精密天平測定其鮮重.

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，使用Origin 2018軟件繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 毛果楊菌根的形成

楊樹幼苗和雙色蠟蘑在無菌環(huán)境下共培養(yǎng)3周后，形成的外生菌根結(jié)構(gòu)如圖1、2所示.與未接種雙色蠟蘑的毛果楊幼苗相比，接種雙色蠟蘑的毛果楊幼苗形成較多的側(cè)根和菌根(圖2A).菌根化毛果楊幼苗的主根不明顯，側(cè)根被雙色蠟蘑菌絲包裹和纏繞，呈現(xiàn)褐色短小的菌根；非菌根化楊樹的主根較為明顯，側(cè)根較少，呈現(xiàn)乳白色；側(cè)根間有菌絲網(wǎng)和明顯的菌根結(jié)構(gòu)(圖2B、2C).

2.2 毛果楊菌根的結(jié)構(gòu)

圖3A～3D和圖3E～3H分別為20倍與40倍顯微鏡下的菌根切片圖.圖3A、3B為明場下的外生菌根橫切片，內(nèi)部排列致密的為楊樹根細胞，外部為纏繞的真菌菌絲.由圖3可知外生菌根形態(tài)完整.綠色為外生菌根真菌(圖3B、3F)，紅色為楊樹根細胞(圖3C、3G)，綠色的菌絲呈現(xiàn)絲狀或空心圓圈狀；楊樹根細胞普遍為橢圓狀，排列齊整，但最外層細胞排列較內(nèi)部根細胞松散，細胞間有菌絲伸入，有空隙.圖3D、3H分別為488 nm和561 nm的疊加場圖.通過WGA與PI染色，可同時觀察到菌絲圍繞在楊樹根細胞周圍，在根際周圍形成菌套；部分真菌菌絲進入楊樹根細胞間并在楊樹的表皮和皮質(zhì)細胞之間形成哈氏網(wǎng)(圖3D、3H).

A.雙色蠟蘑菌絲MMN固體培養(yǎng)7 d；B.雙色蠟蘑菌絲MMN液體培養(yǎng)7 d；C.在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)毛果楊幼苗2～3周；D.石英砂加25 mL共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基；E.毛果楊幼苗和雙色蠟蘑菌絲共培養(yǎng)；F.共培養(yǎng)3周后進行檢測.圖1 毛果楊—雙色蠟蘑外生菌根的體外培養(yǎng)體系Fig.1 Ectomycorrhizal culture system of P.trichocarpa -L.bicolor in vitro

A.毛果楊樹根系生長形態(tài)；B.顯微鏡下菌根化毛果楊根形態(tài)；C.顯微鏡下非菌根化毛果楊根形態(tài).圖2 不同處理的毛果楊樹根系生長形態(tài)圖Fig.2 Morphology of P.trichocarpa root with or without L.bicolor inoculation

2.3 菌根化對毛果楊幼苗生長的影響

圖4 不同處理對毛果楊生長狀態(tài)的影響Fig.4 Effect of mycorrhization on the growth of P.trichocarpa

在菌根真菌的作用下，處理組(楊樹與真菌共培養(yǎng))的楊樹幼苗較對照組(未添加真菌的共培養(yǎng))具有更好的生長狀態(tài)(圖4).

共培養(yǎng)3周后發(fā)現(xiàn)，未添加真菌的毛果楊幼苗平均株高為(45.67±8.77) mm，外生菌根真菌共培養(yǎng)的毛果楊平均株高為(53.17±5.56) mm，菌根化的毛果楊幼苗的株高比未添加真菌的毛果楊提高了15.16%(圖5A)；未添加真菌的毛果楊幼苗鮮重為(412.15±59.49) mg，外生菌根真菌共培養(yǎng)的毛果楊鮮重為(620.92±57.43) mg，菌根化的毛果楊幼苗的鮮重比非菌根化毛果楊提高了50.65%(圖5B).單因素方差分析結(jié)果表明，接種外生菌根真菌雙色蠟蘑對毛果楊鮮重有顯著影響(P=0.030)，對株高無顯著影響(P=0.487).

A.楊樹苗株高；B.楊樹苗鮮重.*表示具有顯著性.圖5 不同處理對毛果楊鮮重與株高的影響Fig.5 Effect of mycorrhization on fresh weight and plant height of P.trichocarpa

3 小結(jié)

本研究以石英砂為基質(zhì)，使用模式植物楊樹與模式外生菌根真菌雙色蠟蘑培養(yǎng)外生菌根，并觀察到菌絲進入楊樹根細胞間隙，形成了典型的哈氏網(wǎng)結(jié)構(gòu).通過測量生長3周的毛果楊幼苗的株高與鮮重，發(fā)現(xiàn)添加雙色蠟蘑的毛果楊幼苗的株高與鮮重比未添加雙色蠟蘑的分別增長15.16%與50.65%.表明外生菌根真菌能促進楊樹生長，顯著增加楊樹的鮮重.