環(huán)狀RNA ciRS-7靶向miR-219a-5p影響微小隱孢子蟲體外增殖的機(jī)制

尹艷玲，黃 爽，姚 倩，吳江平，郭浩晨，楊 新，宋軍科*，趙光輝*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100； 2.重慶三峽職業(yè)學(xué)院，重慶 404155)

隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種重要的專性細(xì)胞內(nèi)寄生的頂復(fù)門原蟲，主要寄生于宿主的胃腸道上皮細(xì)胞，引起腹瀉為主的胃腸道疾病[1-2]。免疫功能正常的個(gè)體感染后通常表現(xiàn)為自限性腹瀉，而免疫功能缺陷個(gè)體(如HIV患者和器官移植患者)感染后會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)期慢性腹瀉和嚴(yán)重的消化不良，甚至死亡[3]。隱孢子蟲也是導(dǎo)致發(fā)展中國(guó)家兒童腹瀉的第二大原因，據(jù)報(bào)道，在南亞和撒哈拉以南的非洲等欠發(fā)達(dá)地區(qū)，每年兩歲以內(nèi)兒童的隱孢子蟲感染人數(shù)高達(dá)470萬(wàn)例[4-6]。但是，目前尚無(wú)有效防控隱孢子蟲病的疫苗，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)的可用于治療隱孢子蟲病的唯一一種藥物——硝唑尼特對(duì)于免疫功能缺陷個(gè)體治療無(wú)效，且不能用于治療最易感的嬰幼兒群體(< 1歲)[7-8]。考慮到隱孢子蟲病的嚴(yán)重程度與宿主狀態(tài)密切相關(guān)，解析宿主和隱孢子蟲的相互作用對(duì)于制定有效防控隱孢子病的策略至關(guān)重要。

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類無(wú)5′和3′自由末端的共價(jià)閉環(huán)非編碼RNA，對(duì)RNase R耐受，比線性RNA更為穩(wěn)定[9]。circRNA具有多種功能，包括充當(dāng)miRNA海綿、作為蛋白質(zhì)和mRNA的調(diào)節(jié)因子以及翻譯成蛋白質(zhì)等，其中，研究較多的是充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)發(fā)揮miRNA海綿作用[9-12]。據(jù)報(bào)道，細(xì)菌、病毒以及寄生蟲等病原感染均可導(dǎo)致宿主circRNA的差異表達(dá)，且circRNA在宿主應(yīng)對(duì)病原感染的反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[13-15]。作者前期利用微陣列芯片技術(shù)檢測(cè)微小隱孢子蟲(C.parvum)感染的HCT-8細(xì)胞circRNAs表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，顯著上調(diào)的circRNA ciRS-7可通過海綿吸附miR-1270調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)C.parvum在HCT-8細(xì)胞中的增殖[16]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，ciRS-7可能與22個(gè)miRNAs存在靶向互作關(guān)系[16]。研究表明，miR-219a-5p可通過調(diào)控炎癥和多種細(xì)胞功能(如細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等)在腸易激綜合征、肝病和多種癌癥中發(fā)揮重要作用[17-20]。在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中，ciRS-7可通過靶向miR-219a-5p調(diào)節(jié)細(xì)胞活力、遷移和侵襲以及細(xì)胞凋亡影響NSCLC的進(jìn)展[20]。基于此，本研究探討了ciRS-7與miR-219a-5p在HCT-8細(xì)胞中的靶向關(guān)系，以及ciRS-7/miR-219a-5p軸對(duì)C.parvum在HCT-8細(xì)胞中增殖的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和蟲株

人結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所獸醫(yī)寄生生物學(xué)研究室饋贈(zèng)；C.parvum卵囊由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院張龍現(xiàn)教授團(tuán)隊(duì)贈(zèng)送，保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT-8細(xì)胞在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中以37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 C. parvum卵囊的傳代與純化

為保證卵囊活力，卵囊需每3個(gè)月在新生犢牛體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)繁傳代，擴(kuò)繁得到的卵囊經(jīng)氯化銫密度梯度離心純化處理后，重懸于添加100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素和0.25 μg·mL-1兩性霉素B的1×PBS中，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 體外感染模型

將細(xì)胞均勻地接入細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%后，按照卵囊∶細(xì)胞=(2～10)∶1比例進(jìn)行感染，感染時(shí)使用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基，4 h后更換為含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)[21]。

1.5 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

使用Trizol試劑(艾科瑞，湖南)提取細(xì)胞總RNA，Nano-100微量分光光度計(jì)(奧盛，杭州)測(cè)定RNA的濃度。用于miRNA表達(dá)分析的模板按照Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit說(shuō)明書對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為10 μL，包括0.25～0.80 μg cDNA、5 μL mRQ Buffer(2×)、1.25 μL mRQ Enzyme，剩余部分用DEPC水補(bǔ)齊；反應(yīng)程序?yàn)?7 ℃ 1 h，85 ℃ 5 min。

用于其它基因表達(dá)分析的模板按照Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(艾科瑞，湖南)說(shuō)明書對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，先去除基因組DNA，反應(yīng)體系為10 μL，包括1 μg cDNA、2 μL 5×gDNA Clean Buffer、1 μL gDNA Clean Reagent，剩余部分用DEPC水補(bǔ)齊；反應(yīng)程序?yàn)?2 ℃ 2 min。然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，向上一步反應(yīng)物中加入1 μL RT Primer Mix、1 μL Evo M-MLV RTase Enzyme Mix、4 μL 5× RTase Reaction Buffer Mix I以及4 μL DEPC水；反應(yīng)程序?yàn)?7 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.6 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

miRNA的qRT-PCR反應(yīng)體系包括2 μL cDNA、12.5 μL TB Green?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)、0.5 μL ROX Dye(50×)、0.5 μL miRNA-specific forward primer、0.5 μL mRQ3’primer、9 μL ddH2O；反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，退火30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)水平，以u(píng)6基因作為內(nèi)參對(duì)照[22]。

其他基因的qRT-PCR反應(yīng)體系包括5 μL cDNA、1 μL Primer mix、4 μL DEPC水和10 μL 2×SYBR Green Mix；反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，退火30 s，72 ℃ 32 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平，以GAPDH基因作為內(nèi)參對(duì)照[21]。引物信息見表1。

表1 qRT-PCR引物信息

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

按照Lipofectamine 2000試劑說(shuō)明書分別將pcDNA3.1(+)-ciRS7 Exon質(zhì)粒(Addgene，美國(guó))及其對(duì)照pcDNA3.1(+)質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)室保存)、ciRS-7干擾RNA(si-ciRS-7)及其對(duì)照si-control(銳博，廣州)、miR-219a-5p mimics及其對(duì)照mimics control(吉瑪，上海)、miR-219a-5p inhibitor及其對(duì)照inhibitor control(吉瑪，上海)轉(zhuǎn)染至HCT-8細(xì)胞中。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建

1.8.1 野生型載體的構(gòu)建 通過在線工具starBase v3.0(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)預(yù)測(cè)到ciRS-7序列上存在的miR-219a-5p的結(jié)合位點(diǎn)，以此設(shè)計(jì)包含結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)的ciRS-7野生型(ciRS-7-WT)片段的PCR擴(kuò)增引物(表2)，于引物的上下游分別添加保護(hù)堿基和SacI和SalI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；經(jīng)PCR擴(kuò)增得到ciRS-7-WT的擴(kuò)增產(chǎn)物，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化；連接至pMDTM19-T(上海生工)載體上，16 ℃過夜連接；將pMDTM19-T-ciRS-7-WT連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM-109感受態(tài)細(xì)胞中；于LB固體培養(yǎng)基(含0.1% Amp)中，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)后挑取菌落；以菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；對(duì)陽(yáng)性菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取pMDTM19-T-ciRS-7-WT重組質(zhì)粒；將pMDTM19-T-ciRS-7-WT質(zhì)粒和pmirGLO進(jìn)行雙酶切，得到線性化的pmirGLO質(zhì)粒和ciRS-7-WT片段連接后按照上述操作步驟，最終得到mirGLO-ciRS-7-WT重組質(zhì)粒[23]；進(jìn)行測(cè)序和雙酶切鑒定；將構(gòu)建成功的pmirGLO-ciRS-7-WT重組質(zhì)粒置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 包含miR-219a-5p結(jié)合位點(diǎn)的野生型ciRS-7的引物信息

1.8.2 突變型載體的構(gòu)建 將ciRS-7和miR-219a-5p的結(jié)合位點(diǎn)突變后，包含ciRS-7和miR-219a-5p突變結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)的ciRS-7突變序列(ciRS-7-MUT)由北京擎科生物科技有限公司合成，在突變序列的頭尾分別添加保護(hù)堿基及SacⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；合成的突變序列直接連接到pmirGLO質(zhì)粒上；擴(kuò)大培養(yǎng)后提取pmirGLO-ciRS-7-MUT重組質(zhì)粒；進(jìn)行測(cè)序和雙酶切鑒定；將構(gòu)建成功的pmirGLO-ciRS-7-MUT重組質(zhì)粒置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)

使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞；按照Lipofectamine 2000試劑說(shuō)明書將pmirGLO-ciRS-7-WT重組質(zhì)粒(或pmirGLO-ciRS-7-MUT重組質(zhì)粒)或pmirGLO空質(zhì)粒和miRNA mimics(或mimics control)轉(zhuǎn)染至HCT-8細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h[23]。培養(yǎng)結(jié)束后，按照高靈敏性雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)；首先利用1×Luc-Lysis II Buffer裂解細(xì)胞；再利用Spark多功能酶標(biāo)儀(Tecan，瑞士)，以Fluc工作液檢測(cè)螢火蟲熒光素酶的發(fā)光值，Rluc工作液檢測(cè)海腎熒光素酶發(fā)光值；最后計(jì)算出螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的發(fā)光比值。

1.10 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)

RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白樣品；按照30 μg·孔-1樣品上樣量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳；電泳結(jié)束后將膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，利用5%的脫脂奶粉溶液封閉PVDF膜，室溫1 h；4 ℃過夜孵育LC3B(1∶1 000，Abways，上海)、p62(1∶1 000，Abways，上海)和GAPDH(1∶500 000，ABclonal，武漢)抗體；次日孵育HRP標(biāo)記二抗(1∶5 000，生工，上海)；孵育結(jié)束后進(jìn)行ECL發(fā)光成像；Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行蛋白灰度分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

利用Student’st和IBM SPSS statistics 22.0檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析，采用Graphpad Prism V 6.07作圖；*.P<0.05表示差異顯著，**.P<0.01表示差異極顯著，***.P<0.001表示差異極極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 C. parvum感染對(duì)HCT-8細(xì)胞自噬的影響

利用Western blot檢測(cè)C.parvum感染HCT-8細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的自噬相關(guān)蛋白LC3B-II和p62的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與未感染對(duì)照相比，LC3B-II和p62蛋白質(zhì)的表達(dá)量在C.parvum感染HCT-8細(xì)胞8、12、24、36和48 h均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)與極極顯著(P<0.001)升高(圖1)。

A. Western bolt分析LC3B-II和p62蛋白質(zhì)在C. parvum感染HCT-8細(xì)胞中的表達(dá)；B. 對(duì)A圖中LC3B-II的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平的灰度分析結(jié)果；C. 對(duì)A圖中p62的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平的灰度分析結(jié)果。*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001，下同

2.2 ciRS-7對(duì)C. parvum感染誘發(fā)HCT-8細(xì)胞自噬的影響

為分析ciRS-7對(duì)C.parvum感染誘發(fā)的HCT-8細(xì)胞自噬的影響，通過過表達(dá)或干擾ciRS-7的表達(dá)后，檢測(cè)C.parvum感染HCT-8細(xì)胞中LC3B-II和p62的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，過表達(dá)ciRS-7顯著降低了C.parvum感染HCT-8細(xì)胞中的LC3B-II的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，但增加了p62的蛋白質(zhì)表達(dá)水平(圖2A、2B)；而干擾ciRS-7的表達(dá)顯著促進(jìn)了C.parvum感染HCT-8細(xì)胞中的LC3B-II的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，但抑制了p62的蛋白質(zhì)表達(dá)水平(圖2C、2D)。

A. Western bolt分析轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-ciRS-7質(zhì)粒對(duì)感染細(xì)胞中的LC3B-II和p62蛋白質(zhì)表達(dá)的影響；B. 對(duì)A圖中LC3B-II和p62的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平的灰度分析；C. Western bolt分析轉(zhuǎn)染si-ciRS-7對(duì)感染細(xì)胞中的LC3B-II和p62蛋白質(zhì)表達(dá)的影響；D. 對(duì)C圖中LC3B-II和p62的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平的灰度分析

2.3 C. parvum感染HCT-8細(xì)胞中ciRS-7對(duì)miR-219-5p的靶向調(diào)節(jié)作用

利用qRT-PCR檢測(cè)到ciRS-7的靶miRNA miR-219a-5p的表達(dá)在C.parvum感染HCT-8細(xì)胞24 h時(shí)顯著下調(diào)(圖3A)；過表達(dá)ciRS-7顯著抑制了C.parvum感染HCT-8細(xì)胞中miR-219a-5p的表達(dá)，而干擾ciRS-7表達(dá)的作用相反(圖3A)；雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，在HCT-8細(xì)胞中，miR-219a-5p mimics顯著降低了pmirGLO-ciRS-7-WT載體的熒光素酶活性，且不影響pmirGLO-ciRS-7-MUT載體和pmirGLO空載體的熒光素酶活性；上述結(jié)果表明，在C.parvum感染的HCT-8細(xì)胞中，ciRS-7對(duì)miR-219a-5p存在靶向調(diào)節(jié)作用(圖3B、3C)。

2.4 miR-219a-5p對(duì)C. parvum感染誘發(fā)HCT-8細(xì)胞自噬的影響

為了檢測(cè)miR-219a-5p對(duì)C.parvum感染誘發(fā)HCT-8細(xì)胞自噬的影響，通過轉(zhuǎn)染miR-219a-5p mimics或miR-219a-5p inhibitor后，檢測(cè)C.parvum感染HCT-8細(xì)胞中LC3B-II和p62的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-219a-5p mimics顯著增加了HCT-8細(xì)胞中miR-219a-5p的表達(dá)量，而轉(zhuǎn)染miR-219a-5p inhibitor顯著降低其表達(dá)量(圖4A)；miR-219a-5p mimics顯著促進(jìn)了C.parvum感染HCT-8細(xì)胞中的LC3B-II的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，但抑制了p62的蛋白質(zhì)表達(dá)水平(圖4B、4C)；而miR-219a-5p inhibitor顯著抑制了C.parvum感染HCT-8細(xì)胞中的LC3B-II的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，但促進(jìn)了p62的蛋白質(zhì)表達(dá)水平(圖4D、4E)。

A. miR-219a-5p mimics和miR-219a-5p inhibitor的效果鑒定；B. Western bolt分析轉(zhuǎn)染miR-219a-5p mimics對(duì)感染細(xì)胞中的LC3B-II和p62蛋白質(zhì)表達(dá)的影響；C. 對(duì)B圖中LC3B-II和p62的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平的灰度分析；D. Western bolt分析轉(zhuǎn)染miR-219a-5p inhibitor對(duì)感染細(xì)胞中的LC3B-II和p62蛋白質(zhì)表達(dá)的影響；E. 對(duì)D圖中LC3B-II和p62的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平的灰度分析

2.5 ciRS-7/miR-219a-5p軸對(duì)C. parvum感染誘發(fā)HCT-8細(xì)胞自噬的影響

為確定ciRS-7是否通過靶向miR-219a-5p調(diào)節(jié)C.parvum感染誘發(fā)的HCT-8細(xì)胞自噬，通過共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-ciRS-7質(zhì)粒和miR-219a-5p mimics后，檢測(cè)C.parvum感染HCT-8細(xì)胞中LC3B-II和p62的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在C.parvum感染的HCT-8細(xì)胞中，miR-219a-5p mimics逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)ciRS-7對(duì)LC3B-II的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的抑制作用和p62的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的促進(jìn)作用(圖5)。

A. Western bolt分析轉(zhuǎn)染miR-219a-5p mimics或/和pcDNA3.1(+)-ciRS-7質(zhì)粒對(duì)感染細(xì)胞中的LC3B-II和p62蛋白質(zhì)表達(dá)的影響；B. 對(duì)A圖中LC3B-II的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平的灰度分析；C. 對(duì)A圖中p62的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平的灰度分析

2.6 ciRS-7/miR-219a-5p軸對(duì)C. parvum體外增殖的影響

由于自噬在清除寄生蟲感染的防御反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用，本研究利用qRT-PCR檢測(cè)了ciRS-7/miR-219a-5p軸對(duì)C.parvum在HCT-8細(xì)胞中增殖的影響。結(jié)果表明，miR-219a-5p mimics顯著降低了感染細(xì)胞中C.parvumhsp70基因的mRNA表達(dá)水平，而miR-219a-5p inhibitor顯著升高了感染細(xì)胞中C.parvumhsp70基因的mRNA表達(dá)水平(圖6)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-219a-5p mimics逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)ciRS-7對(duì)感染細(xì)胞中C.parvumhsp70基因的mRNA表達(dá)水平的促進(jìn)作用(圖6)。

圖6 ciRS-7/miR-219a-5p軸對(duì)HCT-8細(xì)胞中C. parvum hsp70基因的mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

細(xì)胞自噬在宿主抗寄生蟲感染的防御反應(yīng)中起重要的作用。宿主通過自噬的降解作用可清除入侵細(xì)胞的寄生蟲，如細(xì)胞受到弓形蟲感染時(shí)通過啟動(dòng)自噬來(lái)破壞弓形蟲的納蟲空泡膜(parasitophorous vacuole membrane，PVM)，從而清除弓形蟲的速殖子[24]；伯氏瘧原蟲(Plasmodiumberghei)早期感染細(xì)胞內(nèi)脂化的LC3B-II直接結(jié)合在PVM上，并通過募集自噬受體p62、NBR1和NDP52以及泛素等來(lái)清除瘧原蟲[25]。寄生蟲也可通過抑制細(xì)胞自噬、誘導(dǎo)細(xì)胞的不完全自噬甚至利用宿主的自噬來(lái)促進(jìn)自身的增殖，如弓形蟲可以通過激活EGFR/Akt通路，抑制LC3在其周圍的積累，從而逃避宿主自噬對(duì)其的清除[26]；伯氏瘧原蟲的UIS3蛋白通過結(jié)合PVM上的LC3來(lái)抑制肝細(xì)胞的自噬，以促進(jìn)自身的存活[27]；克氏錐蟲(Trypanomacruzi)感染時(shí)可通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生不完全自噬來(lái)逃避宿主的自噬清除作用[28]；利什曼原蟲(Leishmaniaspp.)感染可以雙相和時(shí)間依賴性的方式抑制(感染早期)或誘導(dǎo)(感染后期)宿主自噬來(lái)促進(jìn)自身的生長(zhǎng)和發(fā)育[29]。蔣衡[30]研究發(fā)現(xiàn)C.parvum在感染12～24 h時(shí)誘導(dǎo)了HCT-8細(xì)胞的不完全自噬，與本研究的結(jié)果相似，作者發(fā)現(xiàn)C.parvum感染HCT-8細(xì)胞8～48 h均顯著誘導(dǎo)了細(xì)胞的不完全自噬。但與Priyamvada等[31]的研究結(jié)果存在差異，他們發(fā)現(xiàn)C.parvum感染24 h時(shí)可顯著誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞的完全自噬，這種差異可能是由于不同的C.parvum亞型、感染方法以及細(xì)胞模型所致。

前人研究證實(shí)，circRNA可通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白和自噬相關(guān)途徑來(lái)直接激活或抑制自噬，同時(shí)circRNA可通過海綿吸附miRNAs來(lái)間接調(diào)控自噬[32]。食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal cell squamous carcinoma，ESCC)細(xì)胞中顯著上調(diào)的ciRS-7可通過靶向miR-1299上調(diào)EGFR的表達(dá)，誘導(dǎo)EGFR下游Akt-mTOR通路的激活，從而抑制饑餓或雷帕霉素誘導(dǎo)的ESCC細(xì)胞自噬[33]。在骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)中，ciRS-7/miR-7軸可調(diào)節(jié)OA引起的軟骨降解和自噬抑制過程，過表達(dá)ciRS-7或干擾miR-7的表達(dá)時(shí)可誘導(dǎo)OA軟骨細(xì)胞的自噬并緩解軟骨降解，反之，干擾ciRS-7或增加miR-7的表達(dá)時(shí)則會(huì)抑制OA軟骨細(xì)胞的自噬并加重軟骨降解[34]。在本研究中，過表達(dá)ciRS-7顯著抑制了C.parvum感染誘發(fā)的HCT-8細(xì)胞自噬，而干擾ciRS-7的表達(dá)顯著促進(jìn)了C.parvum感染誘發(fā)的HCT-8細(xì)胞自噬，表明ciRS-7正調(diào)控C.parvum感染誘發(fā)的HCT-8細(xì)胞自噬。此外，ciRS-7的靶miRNA miR-219a-5p在C.parvum感染的HCT-8細(xì)胞中顯著下調(diào)，過表達(dá)ciRS-7顯著降低了C.parvum感染HCT-8細(xì)胞中的miR-219a-5p的表達(dá)，而干擾ciRS-7的表達(dá)顯著增加了C.parvum感染HCT-8細(xì)胞中的miR-219a-5p的表達(dá)，并且通過雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了ciRS-7和miR-219a-5p在HCT-8細(xì)胞中存在結(jié)合活性，表明在C.parvum感染HCT-8細(xì)胞中，ciRS-7可靶向調(diào)節(jié)miR-219a-5p。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-219a-5p mimics可顯著促進(jìn)C.parvum感染誘發(fā)的HCT-8細(xì)胞自噬，而miR-219a-5p inhibitor則顯著抑制C.parvum感染誘發(fā)的HCT-8細(xì)胞自噬，且miR-219a-5p mimics可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)ciRS-7時(shí)對(duì)C.parvum感染誘發(fā)的細(xì)胞自噬的抑制作用。綜上表明，在C.parvum感染期間，ciRS-7可通過靶向miR-219a-5p調(diào)控C.parvum感染誘發(fā)的HCT-8細(xì)胞自噬。

目前，基于基因水平檢測(cè)C.parvum在體內(nèi)和體外感染模型中荷蟲量的靶標(biāo)分子主要是18S rRNA基因和hsp70基因，其中，hsp70基因已用于檢測(cè)C.parvum在腸上皮細(xì)胞中的荷蟲量，且已證實(shí)了基于hsp70基因和18S rRNA基因的qRT-PCR方法檢測(cè)C.parvum的腸上皮細(xì)胞中的荷蟲量時(shí)的趨勢(shì)一致[35-37]。蔣衡[30]利用C.parvum18S rRNA基因的mRNA表達(dá)水平代表C.parvum在HCT-8細(xì)胞中的蟲體數(shù)量，發(fā)現(xiàn)具有抑制自噬作用的miR-30a可顯著增加C.parvum在HCT-8細(xì)胞中的蟲體數(shù)量，而具有促自噬作用的miR-26a則顯著降低C.parvum在HCT-8細(xì)胞中的蟲體數(shù)量。在本研究中，基于C.parvumhsp70基因得到的結(jié)果與之相似，作者發(fā)現(xiàn)，ciRS-7通過抑制C.parvum感染誘發(fā)的細(xì)胞自噬來(lái)促進(jìn)C.parvum在HCT-8細(xì)胞中的增殖，而miR-219a-5p通過促進(jìn)C.parvum感染誘發(fā)的細(xì)胞自噬來(lái)抑制C.parvum在HCT-8細(xì)胞中的增殖，且ciRS-7可通過靶向miR-219a-5p抑制C.parvum感染誘發(fā)的HCT-8細(xì)胞自噬，從而促進(jìn)C.parvum在HCT-8細(xì)胞中的增殖。

4 結(jié) 論

本研究揭示了C.parvum感染誘發(fā)HCT-8細(xì)胞的不完全自噬，以及宿主circRNA ciRS-7通過靶向抑制miR-219a-5p的表達(dá)來(lái)抑制C.parvum感染誘發(fā)的HCT-8細(xì)胞的自噬，以促進(jìn)C.parvum在HCT-8細(xì)胞中的增殖。