基于轉(zhuǎn)錄組測序分析細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴與巨噬細(xì)胞RAW264.7免疫互作相關(guān)基因

王正榮，馬 勛，張艷艷，孟季蒙，薄新文*

(1.省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室,石河子 832000;2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，石河子 832000；3.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832000)

細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)是囊型包蟲病的主要病原，該病是一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，是一種被世界衛(wèi)生組織嚴(yán)重忽視的疾病之一。這種疾病與貧窮和不良的衛(wèi)生習(xí)慣有關(guān)，特別是在畜牧業(yè)養(yǎng)殖地區(qū)[1]。同時，包蟲病也是導(dǎo)致我國西部農(nóng)牧區(qū)牧民因病致貧、因病返貧的主要原因之一。目前，該病已在全國20個省份發(fā)生，主要分布在西北部分牧區(qū)，包括青海、西藏、新疆等地。據(jù)估計，我國包蟲病患者人數(shù)約為100萬，受威脅人口近6 600萬，患者數(shù)量巨大。與現(xiàn)有的全球包蟲病流行數(shù)據(jù)相比，中國包蟲病受威脅人口數(shù)和患者人數(shù)仍居世界首位[1-2]。然而，包蟲病病原與宿主的免疫互作的發(fā)病機制尚未明確，終末宿主疫苗的研究也相對滯后，這些都是影響該病徹底根除的主要因素和瓶頸問題。

巨噬細(xì)胞是一種重要的免疫細(xì)胞，是主要的抗原遞呈細(xì)胞。在機體先天免疫和適應(yīng)性免疫過程中具有重要的作用?，F(xiàn)有的研究表明，巨噬細(xì)胞在宿主抗蠕蟲感染中具有重要的調(diào)控作用[3]?，F(xiàn)已有很多有關(guān)巨噬細(xì)胞在抗棘球絳蟲感染中免疫功能研究的文獻報道，研究的內(nèi)容涉及巨噬細(xì)胞表達的一些功能分子[4-7]以及非編碼的miRNA分子[8-10]和lncRNA分子[11-12]等。同時，也有一些研究棘球絳蟲功能分子在調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)方面的研究報道[13-15]，但截至目前有關(guān)棘球絳蟲應(yīng)對宿主免疫反應(yīng)時，反映蟲體整體基因差異表達的研究報道依然較少，致使人們對其缺乏系統(tǒng)的認(rèn)識?；诖?，本研究采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析了細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴應(yīng)對巨噬細(xì)胞免疫壓力時，其基因的差異表達情況，以期系統(tǒng)解析其應(yīng)對宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)時潛在的免疫調(diào)控機制，同時為疫苗和藥物的研發(fā)挖掘新的靶標(biāo)分子。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑及主要儀器

在屠宰場收集被細(xì)粒棘球絳蟲感染的帶有包囊的羊肝，帶回實驗室，無菌條件下抽取含有原頭蚴的包囊液，離心收集原頭蚴，用加有雙抗的PBS洗滌3～5次，最后將收集的原頭蚴置于含有10%胎牛血清以及雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)RAW 264.7細(xì)胞，待細(xì)胞生長穩(wěn)定時將其傳代培養(yǎng)至新的培養(yǎng)瓶，當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞交匯率達到80%時，接種細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴，接種濃度為每毫升2 000個，設(shè)PBS為對照組，每組3個生物學(xué)重復(fù)，共培養(yǎng)24 h后，分別收集培養(yǎng)上清液中原頭蚴以及RAW264.7細(xì)胞，用PBS洗滌3次，最后將收集的原頭蚴保存于-80 ℃冰柜備用，建庫測序時采用混池測序。

胎牛血清購自Gibco公司(美國)；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液購自Sigma公司(美國)；小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7購自ATCC細(xì)胞庫(中國)；SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing試劑盒購自Clontech公司(美國)；AMPure XP beads試劑盒購自Beckman公司(美國)；Invitrogen Trizol Reagent購自Invitrogen公司(美國)；CW2582 cDNA合成試劑盒購自康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司(中國)；SYBR PremixExTaqMix購自TaKaRa公司(日本)；實時熒光定量PCR儀Lightcycle 2.0購自羅氏公司(德國)。

1.2 總RNA的提取、轉(zhuǎn)錄組文庫的建立以及測序

使用SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing試劑盒進行細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴和RAW264.7細(xì)胞的裂解和第一條cDNA鏈的合成，使用AMPure XP beads試劑盒純化后，用Advantage 2 PCR kit試劑盒擴增第一條cDNA鏈，并再次純化，最終得到雙鏈cDNA。Qubit 2.0定量檢測，合格后,用Covaris系統(tǒng)超聲打斷雙鏈cDNA短片段進行末端修復(fù)，加A尾并連接測序接頭后，純化，選擇片段大小在200 bp左右的文庫進行PCR富集得到最終的cDNA文庫。先使用Qubit 2.0進行文庫的初步定量，稀釋文庫至2 ng·μL-1，隨后用Agilent 2100對文庫的insert size進行檢測，符合預(yù)期后，使用qPCR方法對文庫的有效濃度進行準(zhǔn)確定量(文庫有效濃度>2 nmol·μL-1)，以保證文庫質(zhì)量。文庫檢驗合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標(biāo)數(shù)據(jù)量的需求，進行Hiseq測序。

1.3 差異基因的表達分析

使用Stringtie軟件對基因在轉(zhuǎn)錄水平上進行表達量分析，皮爾遜相關(guān)系數(shù)表示樣品間基因的表達水平相關(guān)性，使用R語言的procmp函數(shù)，根據(jù)表達量對各樣品進行PCA主成分分析。采用DESeq對基因表達進行差異分析，篩選條件為表達差異倍數(shù)|log2(Fold Change)|>1，顯著性Pvalue<0.05。

使用R語言ggplots 2軟件包繪制差異表達基因的火山圖，Pheatmap軟件包根據(jù)同一基因在不同樣品中的表達水平和同一樣品中不同基因的表達模式進行聚類，采用Euclidan方法計算距離，使用層次聚類最長距離法進行聚類。

1.4 差異表達基因的GO分析

利用GO(gene ontology)對差異表達基因進行功能聚類分析。GO分為分子功能(molecular function)、生物過程(biological process)和細(xì)胞組成(cellular component)3個部分。差異表達的基因可以通過ID對應(yīng)或者序列注釋的方法找到與之對應(yīng)的GO編號，而GO編號可用于對應(yīng)到TERM，即功能類別或者細(xì)胞定位。如P-value≤0.05，則表示顯著性富集。

1.5 差異表達基因的KEGG分析

采用KEGG(kyoto encyclopedie of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫對差異表達的基因進行了信號通路分析，通過Pathway顯著性富集能確定特異基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。具體方法以KEGG Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在特異基因中顯著性富集的Pathway，最終將FDR≤0.05的Pathway定義為在差異表達基因中顯著富集的Pathway。

1.6 部分差異表達基因的轉(zhuǎn)錄水平分析

將無菌采集的細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴保存于液氮中，備用?？俁NA提取采用Invitrogen Trizol Reagent試劑，提取方法參照試劑說明書步驟進行。反轉(zhuǎn)錄采用康為世紀(jì)公司10 μL反轉(zhuǎn)錄體系的CW2582 cDNA合成試劑盒。

以上述cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參基因，對隨機篩選的差異表達基因(引物見表1)進行qRT-PCR擴增，反應(yīng)體系：SYBR PremixExTaqMix(2×) 10 μL，上下游引物(10 mmol·L-1)各0.4 μL，cDNA 1 μL，加ddH2O 至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。每個基因做3個生物學(xué)重復(fù)，采用相對比較ΔCt(Qr=2-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達量。

表1 實時定量PCR試驗相關(guān)引物

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴差異基因表達分析

當(dāng)細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴與巨噬細(xì)胞RAW264.7共培養(yǎng)24 h后，與0 h相比，共培養(yǎng)24 h后的原頭蚴共有435個基因的表達出現(xiàn)顯著變化，其中，227個基因呈上調(diào)表達，208個基因呈下調(diào)表達。對差異表達基因進行火山圖以及前20位(top20)聚類熱圖可視化分析，本研究將-lg(FDR)>1的差異表達定義為顯著差異表達基因(圖1)。

圖1 原頭蚴與RAW264.7共培養(yǎng)24 h后差異表達基因的火山圖(A)、top20熱圖(B)分析

其中,上調(diào)表達前10的基因包括Novel00223、EgrG_000549200、EgrG_001026200(NHRF3)、EgrG_000207400、EgrG_000381700、Novel01656、Novel00517、Novel00271(EGR_00497)、EgrG_000464200和Novel01519(EG95 protein precursor)。下調(diào)表達前10的基因包括EgrG_000155900(ALDR)、EgrG_001072700(DPYD)、EgrG_002026800(SYNC)、EgrG_001085050(HSP70)、EgrG_000654600(CATL)、EgrG_000355900、Novel00327(EF-hand domain-containing protein)、EgrG_002320300、pathogen_EgG_scaffold_0325_ncRNA_4499-4601(LORF2)和EgrG_002059100(表2)。

表2 感染后24 h Top10差異表達基因

此外，在上調(diào)表達的基因中還有EgrG_000320800(HSP10)、EgrG_000515900(AgB)、EgrG_000550000(FABP1)、EgrG_000253300(囊泡運輸?shù)鞍譙C22B)、EgrG_000460300(鈣結(jié)合蛋白SM16)和EgrG_000715700(PDCD6)等。下調(diào)表達的基因中還包括EgrG_001018500(跨膜蛋白TM144)、EgrG_000802400(內(nèi)固醇類受體)、Novel01542(MAPK7)、EgrG_000317500(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶2，ALAT2)、EgrG_000589100(谷氨酸脫氫酶2，GLUD2)和EgrG_000644000(谷氨酸合酶，NADH)等。

2.2 細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴差異表達基因的GO分析

GO分析的結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴與巨噬細(xì)胞RAW264.7共培養(yǎng)24 h后，其差異表達基因的功能主要富集在生物學(xué)過程(BP)的血紅素轉(zhuǎn)運、鐵配位實體運輸、輔因子輸送、α-氨基酸生物合成過程以及細(xì)胞形態(tài)發(fā)生等。細(xì)胞組分(CC)的細(xì)胞外間質(zhì)、核糖核酸酶MRP復(fù)合物、核糖核酸酶P復(fù)合物以及胞內(nèi)核糖核酸復(fù)合體等。分子功能(MF)的絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性、α-半乳糖苷酶活性、輔因子結(jié)合以及磷脂酰肌醇乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶活性等過程(圖2，表3)。

圖2 與RAW264.7共培養(yǎng)24 h后原頭蚴中差異表達基因的GO分析

2.3 細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴差異表達基因的KEGG分析

KEGG分析的結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴與巨噬細(xì)胞RAW264.7共培養(yǎng)24 h后，原頭蚴中差異表達的基因主要參與剪接體、內(nèi)吞作用、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)處理、吞噬體、MAPK信號通路以及鈣信號通路等。其中，上調(diào)表達的基因主要參與剪接體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)處理、核糖體、吞噬體以及MAPK等信號通路。下調(diào)表達的基因主要參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、鈣信號通路、氨基酸生物合成以及內(nèi)吞作用等信號通路(圖3，表4)。

圖3 與RAW264.7共培養(yǎng)24 h后原頭蚴中差異表達基因的KEGG分析

2.4 原頭蚴差異表達基因中各種酶相關(guān)基因的表達譜

分析發(fā)現(xiàn)，在435個差異表達的基因中，有79個各種酶相關(guān)的基因，其中，上調(diào)表達的26個，主要包括乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶、神經(jīng)鞘脂脫飽和酶、特異性二酰甘油脂肪酶、線粒體輸入性內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸半胱氨酸連接酶、胞苷脫氨酶、L-天冬酰胺酶、組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)糖基轉(zhuǎn)移酶、信號肽酶、甘露糖-1-磷酸鳥苷轉(zhuǎn)移酶、甘油激酶、脫氧胞嘧啶合酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶、精氨酸轉(zhuǎn)氨酶、蛋白轉(zhuǎn)移酶、甲戊二酸單酰輔酶A合酶、磷脂促翻轉(zhuǎn)酶以及亞精胺合成酶。同時還包括3個抑制劑相關(guān)的基因，分別為Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑6、Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑Bt-KTI以及蛋白酶抑制劑I2(表3)。下調(diào)表達有53個，主要包括天冬酰胺-tRNA連接酶、二氫嘧啶脫氫酶、醛糖還原酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、谷氨酸脫氫酶2、谷氨酸合酶(NADH)、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶、L-蘇氨酸3-脫氫酶、L-乳酸脫氫酶A、尿苷磷酸化酶1等，圖4顯示了各種酶相關(guān)的基因差異表達top20的分析結(jié)果。

圖4 與RAW264.7共培養(yǎng)24 h后原頭蚴中差異表達酶相關(guān)基因top20的表達譜分析

表3 與巨噬細(xì)胞RAW264.7共培養(yǎng)24 h后原頭蚴中上調(diào)表達的各種酶相關(guān)基因

2.5 巨噬細(xì)胞RAW264.7基因差異表達分析

當(dāng)巨噬細(xì)胞RAW264.7與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴共培養(yǎng)24 h時，和PBS對照組相比，原頭蚴處理組的RAW264.7細(xì)胞共有3 745個基因的表達出現(xiàn)顯著變化，其中，1 159個基因出現(xiàn)上調(diào)表達，2 586個基因出現(xiàn)下調(diào)表達(圖5)。

圖5 RAW264.7與原頭蚴共培養(yǎng)24 h后差異表達基因的火山圖(A)、top20熱圖(B)分析

其中，表達上調(diào)前10的基因包括ENSMUSG0011463(Cpb1)、ENSMUSG0058579(Cela2a)、ENSMUSG0029882(2210010C04Rik)、ENSMUSG0036938(Try5)、ENSMUSG0035896 (Rnase1)、ENSMUSG0062478(Ctrc)、ENSMUSG0084174(Sycn)、ENSMUSG0031896(Ctrl)、ENSMUSG0031957(Ctrb1)和ENSMUSG0074268(Amy2a5)；下調(diào)表達前10的基因包括ENSMUSG0022678(Nde1)、ENSMUSG0067367(Lyar)、ENSMUSG00110686、ENSMUSG0057657、ENSMUSG0041506(Rrp9)、ENSMUSG0031527(Eri1)、ENSMUSG0018040(Rrp7a)、ENSMUSG0069682、ENSMUSG0046330(Rpl37a)和ENSMUSG0078965(表4)。

表4 共培養(yǎng)24 h后 RAW264.7 Top10差異表達基因

2.6 巨噬細(xì)胞RAW264.7差異基因表達的GO分析

當(dāng)巨噬細(xì)胞RAW264.7與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴共培養(yǎng)24 h時，與PBS對照組相比，GO分析結(jié)果顯示，差異表達基因主要富集在GO功能聚類的生物過程(BP)中的代謝過程、初級代謝過程、有機物代謝過程以及細(xì)胞代謝過程等。細(xì)胞組分(CC)中的細(xì)胞內(nèi)組分、細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞器以及膜結(jié)構(gòu)細(xì)胞器等(圖6)。

圖6 與原頭蚴共培養(yǎng)24 h后RAW264.7中差異表達基因的GO分析

2.7 巨噬細(xì)胞RAW264.7差異基因表達的KEGG分析

當(dāng)巨噬細(xì)胞RAW264.7與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴共培養(yǎng)24 h時，與PBS對照組相比，KEGG信號通路的分析結(jié)果表明，差異表達的基因主要參與代謝通路、核糖體通路、剪接體通路、RNA轉(zhuǎn)運以及泛素介導(dǎo)的蛋白水解等通路(圖7)。

圖7 與原頭蚴共培養(yǎng)24 h后RAW264.7中差異表達基因的KEGG分析

2.8 差異表達基因的qRT-PCR驗證

為了驗證從轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中獲得差異基因結(jié)果的可靠性，隨機選取10個差異表達的基因進行qRT-PCR驗證，其中，包括6個上調(diào)表達基因，以及4個下調(diào)表達基因，結(jié)果顯示，qRT-PCR驗證結(jié)果與RNA-seq測序結(jié)果一致，進一步說明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可信(圖8)。

圖8 差異表達基因的qRT-PCR驗證分析

3 討 論

原頭蚴是細(xì)粒棘球絳蟲的重要發(fā)育階段，具有雙向發(fā)育的特征，即在中間宿主體內(nèi)可以經(jīng)無性繁殖發(fā)育為新的包囊，在終末宿主體內(nèi)可以經(jīng)有性繁殖發(fā)育為成蟲[16]。原頭蚴也是中間宿主形成二次感染的重要原因，同時還是細(xì)粒棘球絳蟲感染終末宿主，在其腸道定植發(fā)育為成蟲的最初形態(tài)?？梢钥闯觯^蚴不僅是細(xì)粒棘球絳蟲生長發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，同時也是感染宿主的重要階段。因此研究細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴生長發(fā)育關(guān)鍵分子以及原頭蚴與終末宿主免疫互作關(guān)鍵分子均具有重要意義，研究結(jié)果將不僅揭示其獨特的發(fā)育現(xiàn)象，同時還可能挖掘出潛在疫苗候選靶標(biāo)，進而為疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)?；谝陨显颍狙芯客ㄟ^轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)解析了細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴與重要免疫細(xì)胞-巨噬細(xì)胞的免疫互作關(guān)鍵分子，以期初步闡明其免疫互作機制，同時發(fā)掘疫苗候選抗原。

本研究的結(jié)果表明，當(dāng)細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴與巨噬細(xì)胞RAW264.7共培養(yǎng)24 h后，和0 h相比，共培養(yǎng)24 h后的原頭蚴共有435個基因的表達出現(xiàn)顯著變化，其中227個基因出現(xiàn)上調(diào)表達，208個基因出現(xiàn)下調(diào)表達。由此可見，當(dāng)原頭蚴在面對巨噬細(xì)胞RAW264.7免疫壓力時，其自身基因表達會發(fā)生變化，包括與抗逆反應(yīng)相關(guān)的熱激蛋白HSP70、HSP10，與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的AgB、FABP1和Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑，還有與胞外囊泡運輸相關(guān)的蛋白SC22B，這些基因的表達都出現(xiàn)顯著上調(diào)，由此推測其可能在原頭蚴抗巨噬細(xì)胞RAW264.7免疫壓力過程中起到重要的調(diào)控作用，但其具體的調(diào)控機制還有待進一步研究。反觀巨噬細(xì)胞RAW264.7的基因表達情況，當(dāng)巨噬細(xì)胞RAW264.7與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴共培養(yǎng)24 h后，和PBS對照組相比，原頭蚴處理組的RAW264.7細(xì)胞共有3 745個基因的表達出現(xiàn)顯著變化，其中，1 159個基因出現(xiàn)上調(diào)表達，2 586個基因出現(xiàn)下調(diào)表達。在這些差異表達的基因中，作者發(fā)現(xiàn)大量與天然免疫相關(guān)的基因的表達也發(fā)生了變化，諸如C型凝集素受體Reg1、Reg2、Reg3b、Reg3d、Reg3a和Reg3g的表達出現(xiàn)上調(diào)。病原模式識別受體下游相關(guān)效應(yīng)分子Fam132a、Cbln2、和Tnfrsf12a的表達也出現(xiàn)上調(diào)，其中，F(xiàn)am132a和Cbln2屬于腫瘤壞死因子樣的結(jié)構(gòu)域，而Tnfrsf12a屬于腫瘤壞死因子受體12，都屬于炎型細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子。并且在表達上調(diào)前10的分子中有6個屬于絲氨酸蛋白酶家族，包括Cela2a、2210010C04Rik、Try5、Ctrc、Ctrl和Ctrb1[7]。提示這些基因可能在巨噬細(xì)胞RAW264.7抗原頭蚴感染過程中發(fā)揮重要功能。

在這些差異表達的基因中，AgB基因的表達出現(xiàn)上調(diào)，AgB是棘球絳蟲中研究最為廣泛的抗原之一[17]，其在細(xì)粒棘球絳蟲包囊液中普遍存在，是目前人類包蟲病診斷的主要抗原之一。已有的研究證實，細(xì)粒棘球絳蟲分泌的AgB可以通過中性粒細(xì)胞分泌的彈性蛋白酶干擾中性粒細(xì)胞的活性，進而有利于寄生蟲逃避宿主的免疫反應(yīng)。另外，AgB可以通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的活性和抑制有效細(xì)胞因子的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng)[18]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)FABP1基因的表達同樣出現(xiàn)上調(diào)。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，F(xiàn)ABP對于寄生的扁形動物具有重要的意義，因為這些寄生蟲不能合成它們自身所需的大部分脂質(zhì)，特別是長鏈脂肪酸和膽固醇[19-20]。因此，這種脂質(zhì)必須從其寄生宿主體內(nèi)獲得，然后通過載體蛋白質(zhì)運送到寄生蟲體內(nèi)的特定部位。FABP蛋白可能參與了其細(xì)胞外脂質(zhì)的獲取，以及傳遞到宿主細(xì)胞的過程。同時FABP蛋白家族也是極具潛力的藥物傳遞以及疫苗候選靶標(biāo)[21-24]。研究者在棘球蚴囊液和原頭節(jié)分泌物中發(fā)現(xiàn)了FABP1分子[24-25]。細(xì)粒棘球絳蟲的FABP1被認(rèn)為是其亞家族的重要成員之一[26]，其成員參與脂質(zhì)氧化過程。研究表明，細(xì)粒棘球絳蟲的FABP1通過一種機制與膜相互作用，這種機制涉及到與膜直接接觸以它們的物質(zhì)交換[27]。由此推斷，以上分子可能在細(xì)粒棘球絳蟲應(yīng)對巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)時起到重要免疫調(diào)控作用，以創(chuàng)造有利于蟲體寄生的免疫微環(huán)境。

蟲體表達的各種酶相關(guān)的蛋白以及抑制劑，不僅在蟲體自身的代謝中起重要的作用，同時可以降解對其有害的宿主蛋白以及抑制宿主來源的各種酶，保護蟲體自身不受危害[28]。為此，本研究系統(tǒng)分析了細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴在應(yīng)對巨噬細(xì)胞免疫壓力時，其各種酶相關(guān)基因以及抑制劑相關(guān)分子的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有79個酶相關(guān)的基因其表達出現(xiàn)顯著差異，其中，包括3個上調(diào)表達的蛋白酶抑制劑，分別為Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑6、Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑Bt-KTI以及蛋白酶抑制劑I2。有學(xué)者在細(xì)粒棘球絳蟲中分離鑒定了2個Kunitz型蛋白酶抑制劑，其中，一種為Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑，是一種強有力的糜蛋白酶和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑，在局部炎癥中結(jié)合鈣以及減少中性粒細(xì)胞浸潤。同時也可能通過抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和組織蛋白酶G，參與宿主免疫逃避。而另一個是一種強有力的胰蛋白酶抑制劑。作為哺乳動物腸道蛋白酶的強有力抑制劑，細(xì)粒棘球絳蟲Kunitz型蛋白可能在防止蛋白水解酶攻擊方面發(fā)揮重要的保護作用，從而確保細(xì)粒棘球絳蟲在其哺乳動物宿主體內(nèi)的存活[29]。近期，有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)粒棘球絳蟲的Kunitz型蛋白酶抑制劑可以抑制巨噬細(xì)胞炎型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并且抑制巨噬細(xì)胞的增殖[15, 30]。肝片吸蟲的排泄-分泌產(chǎn)物中存在兩種Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑，這些抑制劑可以保護寄生蟲在入侵時免受宿主蛋白酶，如糜蛋白酶等有害蛋白的水解作用。同時研究還發(fā)現(xiàn)此類絲氨酸蛋白酶抑制劑可以通過干擾激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)，進而調(diào)節(jié)宿主的炎癥和通透性反應(yīng)[31]。由此作者推測，這3種蛋白酶抑制劑可能在細(xì)粒棘球絳蟲應(yīng)對巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)時起重要的作用，一方面，抑制宿主細(xì)胞釋放的蛋白酶活性，保護蟲體在寄生過程中免受宿主蛋白酶水解作用；另一方面，抑制宿主免疫細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)，達到寄生的目的。

4 結(jié) 論

本研究系統(tǒng)解析了細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴應(yīng)對巨噬細(xì)胞RAW264.7免疫壓力時其基因的差異表達譜規(guī)律及其巨噬細(xì)胞RAW264.7面對蟲體抗原刺激時其免疫相關(guān)基因的表達情況，篩選了與細(xì)粒棘球絳蟲抗宿主免疫反應(yīng)相關(guān)分子。研究結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴面對宿主巨噬細(xì)胞免疫壓力時，原頭蚴中的AgB、FABP1、Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑等具有免疫調(diào)節(jié)作用的分子表達明顯上調(diào)，進而有利于蟲體在宿主的寄生以及免疫逃避。這些數(shù)據(jù)將為進一步揭示細(xì)粒棘球絳蟲抗宿主免疫反應(yīng)以適應(yīng)寄生的機理提供理論依據(jù)，同時為包蟲病防治提供新的疫苗和藥物靶點奠定基礎(chǔ)。