骨髓源肥大細(xì)胞通過甘露糖受體識別FMDV-VLPs的細(xì)胞因子應(yīng)答

韓偉建，張俊娟，張義明，王家鑫，李麗敏

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，保定 071000)

肥大細(xì)胞(mast cells，MCs)廣泛分布于皮膚與黏膜等部位的結(jié)締組織中，與樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共同構(gòu)成機(jī)體抵御病原體的第一道防線，并構(gòu)成固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答之間的橋梁[1]。MCs可以快速識別入侵的病原體并協(xié)助啟動免疫應(yīng)答。一旦活化， MCs可以迅速釋放大量的免疫介質(zhì)，包括細(xì)胞因子、趨化因子、蛋白酶和抗菌肽[2]，例如干擾素、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、CCL2、CCL3、CCL5等[3]。這些介質(zhì)可以激活免疫和非免疫細(xì)胞，并對其周圍的細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)節(jié)[4]。

MCs分泌細(xì)胞因子需要其表面的識別受體識別相應(yīng)的配體。MCs可通過多種模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)識別病原體，包括TLR樣受體(toll-like receptors, TLRs)[5]、甘露糖受體(mannose receptors, MR)、NOD樣受體(nod-like receptors, NLR)、清道夫受體(scavenger receptor, SR)和CD48等受體[6]。MCs可以通過TLRs和RIG-I受體識別病原體，分泌細(xì)胞因子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用及抗病毒作用[7-8]。MR是C型凝集素受體家族重要成員之一，不僅可以識別病原體表面的甘露糖、巖藻糖等，還可以識別病毒的結(jié)構(gòu)蛋白[9]，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗微生物免疫應(yīng)答。有研究表明，MCs可以通過MR識別百日咳桿菌并分泌TNF-α、IL-6和IFN-γ[10]。MCs分泌的TNF-α 在細(xì)菌感染過程中可以招募DC及T細(xì)胞至引流淋巴結(jié)，從而促進(jìn)抗原特異性免疫應(yīng)答[4，11]，而MCs分泌的IL-6以及MCs與B細(xì)胞的相互作用是機(jī)體分泌IgA的主要機(jī)制[12]。那么，MCs通過MR識別FMDV-VLPs 分泌的細(xì)胞因子表達(dá)情況如何？

口蹄疫病毒樣顆粒(foot-and-mouth disease virus-like particles, FMDV-VLPs)目前已成為FMD的主要候選疫苗之一[13]。在FMDV衣殼的4個結(jié)構(gòu)蛋白中，VP1可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體[14]，而VP4是一種高度保守的結(jié)構(gòu)蛋白，雖然位于病毒粒子的內(nèi)部，但是在病毒的侵入過程中起了重要的作用[15]，牛的多種單體型MHC分子都可以識別VP4蛋白的20-34位氨基酸序列[16]。因此，VP1和VP4被認(rèn)為是研制通用型口蹄疫疫苗的理想后備抗原[17]。本實(shí)驗(yàn)室將VP1-VP4連接在HBcAg分子α螺旋上，構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒pCMV-HA-HBcAg-VP1-VP4，并成功制備了FMDV-VLPs。因此，作為黏膜免疫主要成員的MCs識別FMDV-VLPs 分泌的細(xì)胞因子表達(dá)情況如何需要進(jìn)行研究。

前期研究表明，重組FMDV VP1-VP4蛋白可以抑制腹腔肥大細(xì)胞(peritoneal mast cells, PMCs)分泌一系列細(xì)胞因子[18]。近年來，骨髓源肥大細(xì)胞(bone marrow-derived mast cells, BMMCs)被作為肥大細(xì)胞體外模型用于許多研究中，但BMMCs能否通過MR識別FMDV-VLPs產(chǎn)生免疫應(yīng)答尚不清晰。所以，本研究用IL-3和SCF體外誘導(dǎo)得到高純度的BMMCs，將其分為BMMCs組、MR抑制劑處理組，并負(fù)載FMDV-VLPs，利用蛋白芯片檢測BMMCs上清中細(xì)胞因子表達(dá)，以揭示甘露糖受體在肥大細(xì)胞識別FMDV-VLPs 過程中發(fā)揮的作用，從而為新型口蹄疫疫苗研制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

CHO-K1細(xì)胞購自普諾賽生命科技有限公司；pCMV-HA質(zhì)粒由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院趙款老師提供；6～8周齡C57BL/6N小鼠購自維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司； RPMI 1640購自美國Gibco公司；小鼠IL-3和SCF購自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；非必需氨基酸、L-谷氨酰胺和甲苯胺藍(lán)染液購自北京索萊寶科技有限公司；Mannan購自北京索萊寶科技有限公司；APC anti-mouse FcεRIα Antibody、APC Armenian Hamster IgG Isotype Ctrl Antibody、FITC anti-mouse CD117 (c-Kit) Antibody和FITC Rat IgG2b κ Isotype Ctrl Antibody購自美國BioLegend公司；Mouse Cytokine Array C6購自美國RayBiotech公司； T4 DNA Ligase購自美國Promega公司；PrimeSTAR?Max DNA Polymerase 2×、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ購自日本TaKaRa公司；2×Es Taq MasterMix(Dye)購自北京康為世紀(jì)科技有限公司；Trans5α 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠體金標(biāo)記羊抗兔IgG購自北京博奧森生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pCMV-HA-HBcAg-VP1-VP4的構(gòu)建 以pcDNA3.1(+)-HBcAg-VP1-VP4為模板(該質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，具體的構(gòu)建策略請參見文獻(xiàn)[19])，使用引物F:5′-CCGGAATTCACCATGGACATTGAC-3′，R：5′-CCGCTC-GAGTCAATGGTGATGGTG-3′，擴(kuò)增目的片段HBcAg-VP1-VP4；用XhoⅠ和EcoRⅠ將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，使用T4 DNA Ligase將純化后的酶切產(chǎn)物連接至pCMV-HA質(zhì)粒(16 ℃連接過夜)。將重組質(zhì)粒pCMV-HA-HBcAg-VP1-VP4轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Trans5α，將PCR鑒定陽性的菌送至中科希林生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行測序。

1.2.2 重組質(zhì)粒pCMV-HA-HBcAg-VP1-VP4的表達(dá)與鑒定 按照重組質(zhì)粒pCMV-HA-HBcAg-VP1-VP4與Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)的質(zhì)量體積比為2∶1、1∶1、1∶2、1∶3配比，轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞后72、60、48和24 h，并以1∶10稀釋的兔抗FMDV VP1-VP4多克隆抗體(以重組VP1-VP4蛋白制備的兔源多克隆抗體)為一抗37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次后，用1∶100稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG 37 ℃孵育40 min，進(jìn)行間接免疫熒光鑒定。

按照間接免疫熒光鑒定結(jié)果，使用重組質(zhì)粒與Lipo 2000的質(zhì)量體積比1∶1進(jìn)行轉(zhuǎn)染，收集轉(zhuǎn)染后24、36、48和60 h的上清進(jìn)行Western blot鑒定。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；5% 脫脂牛奶4 ℃封閉過夜；使用1∶3 000稀釋的His標(biāo)簽的單克隆抗體為一抗室溫孵育3 h；TBST洗滌5次后，以1∶40 000稀釋的山羊抗鼠IgG(辣根過氧化物酶標(biāo)記)作為二抗，室溫孵育1.5 h，TBST洗滌5次后，使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒室溫避光顯色3 min，使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀進(jìn)行成像。

1.2.3 FMDV-VLPs的表達(dá)與鑒定 按照重組質(zhì)粒pCMV-HA-HBcAg-VP1-VP4與Lipo 2000的質(zhì)量體積比為1∶1進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h收集細(xì)胞上清，使用KTATMepure 蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行 Ni 柱親合層析純化重組蛋白。純化后的FMDV-VLPs保存于-80 ℃?zhèn)溆谩⒌鞍鬃冃院?，進(jìn)行SDS-PAGE電泳試驗(yàn)鑒定純化效果。為了進(jìn)一步驗(yàn)證純化后的蛋白是否為目標(biāo)蛋白，進(jìn)行了Western blot鑒定：取純化后的蛋白懸液 20 μL進(jìn)行SDS-PAGE；轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% 脫脂牛奶4 ℃封閉過夜；使用1∶1 000稀釋的兔抗FMDV VP1-VP4多克隆抗體為一抗室溫孵育3 h；TBST洗滌5次后以1∶40 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為二抗，室溫孵育1.5 h，TBST洗滌5次后用DAB避光顯色5 min。

對FMDV VLP進(jìn)行膠體金免疫電鏡鑒定，具體步驟如下：取0.5 mg·mL-1FMDV-VLPs 100 μL，加入100 μL 1∶1 000稀釋的兔抗FMDV VP1-VP4 IgG， 37 ℃作用30 min； 加入0.01 mol·L-1PBS緩沖液1 mL，4 ℃，13 000 r·min-1離心20 min， 棄上清， 反復(fù)兩次。最后一次離心棄去上清，用0.01 mol·L-1PBS緩沖液100 μL將沉淀重懸；懸液中加入50 μL 1∶50稀釋的膠體金抗體，37 ℃孵育30 min；取0.01 mol·L-1PBS緩沖液1 mL加入混合物中，離心20 min，棄上清，重復(fù)此步驟一次，棄上清，用100 μL去離子水將沉淀重懸；將懸液加入到15 mL超濾管中，加12 mL去離子水混勻，4 000 r·min-1離心至500 μL，重復(fù)兩次，最后一次離心至200 μL。將樣品進(jìn)行磷鎢酸負(fù)染色，并在透射電子顯微鏡下觀察。

1.2.4 小鼠BMMCs的制備及鑒定 小鼠BMMCs的收取及培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行：無菌條件下取骨髓細(xì)胞，用培養(yǎng)液(含10% FBS RPMI 1640培養(yǎng)基、0.1 mmol·L-1非必需氨基酸、2 mmol·L-1谷氨酰胺、10 ng·mL-1IL-3、20 ng·mL-1SCF)重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個·mL-1，鋪到直徑10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔7 d更換培養(yǎng)液，每次收集上清中的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

收集BMMCs懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個·mL-1，取20 μL的細(xì)胞懸液進(jìn)行涂片；用4%多聚甲醛固定細(xì)胞3 min，然后用PBS(pH7.2)沖洗3次；滴1 mL 0.1%甲苯胺藍(lán)染色30 s，用蒸餾水沖掉甲苯胺藍(lán)溶液；300 mL·L-1乙醇-PBS(pH 7.2)分色至細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)藍(lán)色，細(xì)胞核為紫紅色，立即用蒸餾水沖洗；中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

取在體外培養(yǎng)了8周的BMMCs進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)鑒定。將BMMCs調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個·mL-1。每個1.5 mL離心管中加入100 μL細(xì)胞懸液，加入含3% BSA的PBS稀釋的抗體[終濃度為0.1 μg·mL-1的APC anti-mouse FcεRIα Antibody和FITC anti-mouse CD117 (c-Kit) Antibody，并用APC Armenian Hamster IgG Isotype Ctrl Antibody和FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody作同種型對照]。4 ℃避光孵育30 min。1 700 r·min-1離心5 min，棄掉上清，用含3% BSA、1%疊氮化鈉的冰冷PBS溶液1 mL重懸，1 700 r·min-1離心5 min重復(fù)3次。使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 細(xì)胞因子芯片檢測 將鑒定后的BMMCs按1×106·mL-1鋪到24孔板中，每孔500 μL細(xì)胞懸液。將BMMCs分為3組，分別為MR抑制組(iMR-VLP組)、MR未抑制組(VLP組)和空白對照組(Control組)，每組3個重復(fù)。MR抑制組的培養(yǎng)孔中加入終濃度為3 mg·mL-1的Mannan[19]，2 h后，給MR體抑制組和MR未抑制組加入終濃度為20 μg·mL-1的FMDV-VLPs，空白對照組不做處理。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后收集細(xì)胞上清使用Mouse Cytokine Array C6試劑盒對細(xì)胞因子進(jìn)行檢測。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 使用Graphpad Prism 5對掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行One-way ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，并做差異分析柱狀圖和熱圖。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pCMV-HA-HBcAg-VP1-VP4表達(dá)與鑒定

2.1.1 表達(dá)與鑒定 將測序成功的重組質(zhì)粒pCMV-HA-HBcAg-VP1-VP4按照不同條件染轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，并進(jìn)行間接免疫熒光和Western blot鑒定。結(jié)果顯示：在轉(zhuǎn)染后24 h，重組質(zhì)粒與Lipo 2000質(zhì)量體積比為1∶1的條件下重組質(zhì)粒pCMV-HA-HBcAg-VP1-VP4的表達(dá)效率最高(圖1)；在48 h左右并且重組質(zhì)粒與Lipo 2000質(zhì)量體積比為1∶1的條件下，細(xì)胞上清中目的蛋白表達(dá)效率最高(圖2)。

圖1中a、b、c和d分別為質(zhì)粒與Lipo 2000質(zhì)量體積比為2∶1、1∶1、1∶2和1∶3的條件下，在24 h時細(xì)胞的間接免疫熒光鑒定結(jié)果

不同時相細(xì)胞上清的Western blot鑒定結(jié)果(重組質(zhì)粒與Lipo 2000質(zhì)量體積比為1∶1)。M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、3、4分別為轉(zhuǎn)染后24、36、48、60 h的細(xì)胞上清；5.未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清

2.1.2 純化與鑒定 將重組質(zhì)粒pCMV-HA-HBcAg-VP1-VP4按照與Lipo 2000質(zhì)量體積比為1∶1轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，在48 h收集細(xì)胞上清用鎳柱進(jìn)行純化，然后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定和Western blot鑒定。SDS-PAGE的結(jié)果顯示，在49.5 ku左右處出現(xiàn)了單一條帶，與預(yù)期的大小相符，表明純化效果較好(圖3a)；Western blot鑒定結(jié)果顯示在49.5 ku左右處出現(xiàn)了一條特異性條帶，提示純化后的蛋白是目標(biāo)條帶(圖3b)。為了鑒定重組質(zhì)粒表達(dá)后是否自我組裝成VLPs，進(jìn)行了免疫透射電鏡觀察。結(jié)果顯示，透射電鏡下可以看到重組蛋白形成了顆粒，粒子直徑大約為30 nm，并且在粒子周圍，有直徑10 nm左右膠體金顆粒附著(圖3c)，表明重組質(zhì)粒成功組裝成FMDV-VLPs。

a.SDS-PAGE鑒定結(jié)果(M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化前的細(xì)胞上清；2.純化后的重組蛋白)； b.Western blot鑒定結(jié)果(M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；3.純化后的重組蛋白)；c.膠體金免疫電鏡鑒定結(jié)果，黑色箭頭為口蹄疫病毒樣顆粒(約30 nm)，紅色箭頭為膠體金顆粒(約10 nm)

2.2 小鼠BMMCs的甲苯胺藍(lán)染色及流式細(xì)胞術(shù)鑒定

BMMCs通過甲苯胺藍(lán)染色后，可見細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)色，細(xì)胞核呈紫紅色，無脫顆?，F(xiàn)象(圖4a)；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，F(xiàn)cεRIα和CD117雙陽性的細(xì)胞占97.9%左右，表明制備的BMMCs純度良好，符合試驗(yàn)要求(圖4b)。

圖4a為BMMCs甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果；圖4b為BMMCs流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果[A、B.使用FSC(正向散射)和SSC(側(cè)散射)作為參數(shù)對BMMCs進(jìn)行分析; C.使用APC Armenian Hamster IgG Isotype Ctrl 抗體和κ Isotype Ctrl 抗體作為同型對照；D.使用APC anti-mouse FcεRIα抗體和FITC anti-mouse CD117 (c-Kit) 抗體標(biāo)記BMMCs，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)鑒定]

2.3 不同處理組BMMCs表達(dá)的細(xì)胞因子差異分析

為了分析細(xì)胞因子的差異變化，使用Image J軟件對芯片檢測結(jié)果進(jìn)行灰度值(gray values)分析。結(jié)果顯示，相比于control組，VLP組BMMCs分泌的CCL21、IL-9、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-15、IL-17A、IL-21、IL-12p70、TNF-α、IL-1α、CCL17和L-selectin顯著上調(diào)(P<0.05)；iMR-VLP組相比于VLP組，BMMCs分泌的IL-9、IL-10、CCL19和CCL21顯著上調(diào)(P<0.05)，而IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-15、IL-21、IL-12 p70、IL-1α、CCL17和 TNF-α顯著下調(diào)(P<0.05)(圖5)。

*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001

2.4 不同處理組BMMCs的蛋白質(zhì)表達(dá)譜檢測結(jié)果

使用MeV軟件對“2.3”得出的不同處理組BMMCs分泌的細(xì)胞因子的表達(dá)量進(jìn)行聚類分析，作聚類熱圖(圖6)。VLP組相比于Control組，IL-1、IL-2、TNF-α、IFN-γ和IL-12等Th1細(xì)胞因子以及IL-21、IL-4等Th2型細(xì)胞因子表達(dá)均發(fā)生了上調(diào)，而iMR-VLP組與VLP組相比，抑制MR后，IL-1、IL-2、TNF-α、IFN-γ和IL-12等Th1細(xì)胞因子以及IL-21、IL-4等Th2型細(xì)胞因子表達(dá)呈下調(diào)變化，CCL19、IL-9等卻發(fā)生上調(diào)。結(jié)果表明，BMMCs的 MR受體在識別FMDV-VLPs過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。

圖6 不同處理組BMMCs的蛋白質(zhì)表達(dá)差異熱圖

3 討 論

MR作為肥大細(xì)胞表面重要的模式識別受體，在肥大細(xì)胞執(zhí)行其免疫調(diào)節(jié)功能中起著非常重要的作用[10,20]。因此，作者構(gòu)建了重組pCMV-HA-HBcAg-VP1-VP4質(zhì)粒，并且成功制備了FMDV-VLPs，用FMDV-VLPs負(fù)載經(jīng)過甘露糖受體抑制劑處理的BMMCs，檢測上清中細(xì)胞因子的表達(dá)，以此來闡釋甘露糖受體在骨髓源肥大細(xì)胞識別FMDV-VLPs過程中的作用。

在抗FMDV感染的過程中，IFN-γ和TNF-α發(fā)揮重要的作用。IFN-γ負(fù)責(zé)調(diào)控FMDV感染的免疫應(yīng)答和抑制FMDV的復(fù)制，而TNF-α能夠促進(jìn)固有免疫向適應(yīng)性免疫的轉(zhuǎn)變，可以通過Th1通路激活T細(xì)胞，促使細(xì)胞免疫應(yīng)答的發(fā)生[21]；IL-10是主要的抑制炎癥的細(xì)胞因子，在FMDV感染的過程中，豬血清中的IL-10逐漸升高，在3、4 d達(dá)到頂峰，抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖，因此，IL-10升高被認(rèn)為與FMDV感染時的免疫抑制有關(guān)[22]；IL-6是一種多效細(xì)胞因子，在激活和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中起重要的作用，研究表明，在FMDV感染的過程中，仔豬外周血IL-6會有明顯的升高，推測其可能與不同年齡FMDV致病性差異有關(guān)[21]。

先前的研究表明， 重組FMDV VP1-VP4蛋白負(fù)載腹腔肥大細(xì)胞(PMCs)后CCL19、L-selectin、CCL17和TNF-α等34個蛋白的表達(dá)水平顯著低于對照組(P<0.01)；而抑制PMCs的MR后再負(fù)載VP1-VP4蛋白，TNF-α、IL-6、CCL19、IL-15、IL-9等功能分子的表達(dá)顯著升高[18]。而本研究結(jié)果顯示，負(fù)載VLPs后BMMCs分泌的TNF-α、IL-1、IL-4、IL-15、IFN-γ、IL-2、CCL17等細(xì)胞因子的表達(dá)顯著高于對照組(圖6)，相比于負(fù)載FMDV-VLPs且MR未抑制組(VLP組)，MR受體抑制組(iMR-VLP)的BMMCs分泌的TNF-α、IL-1、IL-4、IL-15、IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子均有明顯下降的趨勢，而IL-9、CCL19、CCL21等細(xì)胞因子的分泌則有明顯上升的趨勢(圖5、6)。其中IL-1a、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-17、IL-15等Th1細(xì)胞因子，可促進(jìn)炎癥形成，并促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答，有利于病原清除；IL-4和IL-10為Th2 細(xì)胞因子，可以抑制炎癥形成并有助于B細(xì)胞的增殖與分化；CCL17、CCL19和CCL21為趨化因子，主要功能是在炎癥和免疫應(yīng)答過程中介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的遷移。造成細(xì)胞因子分泌差異的可能原因：1)VLPs 在一定程度上可以緩解重組VP1-VP4蛋白帶來的免疫抑制。2)可能與肥大細(xì)胞本身有關(guān)。骨髓干細(xì)胞在IL-3和SCF共同誘導(dǎo)下可以分化成均質(zhì)較成熟的BMMCs，和PMCs均為結(jié)締組織型肥大細(xì)胞[23-24]。而直接從腹腔細(xì)胞中利用Percoll分離液分離的腹腔肥大細(xì)胞雖然經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色檢測純度較高，但是利用CD117及FcεRIα 抗體鑒定顯示純度較低(數(shù)據(jù)沒有列出)。研究表明，與BMMCs相比，PMCs活化后不分泌或分泌少量的新合成的促炎因子，比如TNF-α和IL-6，但是IL-4、IL-10 和IFN-γ 兩者之間沒有差異[25]。并且，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究結(jié)果表明，IL-3誘導(dǎo)形成的BMMCs與成熟的PMCs的轉(zhuǎn)錄本在促炎因子方面，PMCs明顯低于BMMCs[26]。本研究中不同處理是否會影響甘露糖受體在BMMCs的表達(dá)以及該受體在BMMCs 和PMCs上表達(dá)是否有差異有待進(jìn)行深入研究。

目前，體外培養(yǎng)MCs是研究肥大細(xì)胞生物學(xué)作用的重要方法。一般分為從腹腔分離PMCs和從骨髓中分離不成熟的MCs前體細(xì)胞，體外分化為成熟的BMMCs[26]。Akula等[23]發(fā)現(xiàn)，雖然相比于BMMCs，PMCs中一些細(xì)胞因子或者細(xì)胞因子受體幾乎不表達(dá)，包括IL-1β、IL-6、IL-10受體α鏈、IL-4受體α鏈、IL-2受體α鏈、TGF-β受體等，但是BMMCs與PMCs均表現(xiàn)出結(jié)締組織型肥大細(xì)胞的特性。并且，使用IL-3和SCF聯(lián)合誘導(dǎo)比IL-3單獨(dú)誘導(dǎo)形成的BMMCs 成熟度更高[23,27]。PMCs可以從腹腔直接分離得到，但數(shù)目很低(約1×105個·只-1小鼠)，不僅難滿足試驗(yàn)需求，而且純度變化大；腹腔細(xì)胞可以在體外繼續(xù)培養(yǎng)8周，可以得到成熟的純度較高的肥大細(xì)胞(PCMCs)[23]。骨髓干細(xì)胞在IL-3和SCF的誘導(dǎo)下可以分化成比較成熟BMMCs(5～8周)，純度很高且細(xì)胞數(shù)目可以滿足試驗(yàn)需求。鑒于不同組織中的MCs在不同組織中甚至同一組織中不同部位的表型不完全相同，體外培養(yǎng)的 BMMCs 與體內(nèi)的MCs存在的一定差異[23,28]，并且不同的刺激亦影響MCs的表型，體外研究應(yīng)該結(jié)合體內(nèi)試驗(yàn)以得出更加科學(xué)的結(jié)論。

4 結(jié) 論

BMMCs可以通過MR識別FMDV-VLPs，促進(jìn)IL-1α、IL-2、IL-4、IL-15、IL-17A、TNF-α、IFN-γ、CCL-17和L-Selectin表達(dá)，下調(diào)IL-9、IL-10、CCL19和CCL21的表達(dá)，表明FMDV-VLPs可能通過BMMCs的甘露糖受體增強(qiáng)Th1型細(xì)胞因子分泌、有效抑制能引起免疫抑制的IL-10的分泌，并降低介導(dǎo)T細(xì)胞再循環(huán)的CCL19和CCL21的形成。這為基于MCs的甘露糖受體應(yīng)答效應(yīng)的口蹄疫新型疫苗的研發(fā)提供了理論依據(jù)和新思路。