PLC-γ1的多克隆抗體制備及對(duì)綿羊早期胚胎發(fā)育作用的初步研究

劉欣杰，吳曉雪，劉素平，袁利明，陳 寧，賽務(wù)加甫

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003)

磷脂酰肌醇特異的磷脂酶C(phospholipase C，PLC)可使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)水解為第二信使肌醇-1，4，5-三磷酸(PIP3)和二酰甘油(DAG)[1-3]，在調(diào)節(jié)各種受體分子的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。PIP3可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)釋放出Ca2+[4-5]，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度升高[6-8]；DAG可激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，繼而引發(fā)下一步的信號(hào)傳遞[9-10]。PLC普遍存在于機(jī)體的各組織中，對(duì)機(jī)體多種生理活動(dòng)做出了重要的調(diào)控[11-12]。PLCγ可作為一種傳遞信號(hào)參與受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)介導(dǎo)的細(xì)胞分裂、抗原抗體結(jié)合引起免疫反應(yīng)及卵細(xì)胞受精[13]等過(guò)程。磷脂酶Cγ1(phospholipase C-γ1,PLC-γ1)作為PLC家族的成員，至今已發(fā)現(xiàn)13種哺乳動(dòng)物PLC的同工酶，分為β、γ、ε和δ四大類(lèi)型[14]，每一類(lèi)型還有不同的亞型分支。PLC-γ1屬于PLCγ的一個(gè)亞型[15]。除參與細(xì)胞分裂外，RTK介導(dǎo)的PLC-γ1信號(hào)通路在細(xì)胞遷移、運(yùn)動(dòng)和分化中也有重要作用。通常過(guò)度表達(dá)RTK下游分子會(huì)引起腫瘤轉(zhuǎn)移，PLC-γ1也有這種作用[16-17]；一般認(rèn)為，RTK的下游分子能刺激或抑制細(xì)胞分化，也有報(bào)道證明PLC-γ1能誘導(dǎo)培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化[18-20]。Dittmar等[21]報(bào)道，表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的遷移是由于PLC-γ1的短暫激活引起的。Smith等[22]報(bào)道，在小鼠3YI的纖維原細(xì)胞中PLC-γ1的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。Zhang等[23]運(yùn)用基因敲除技術(shù)，通過(guò)降低PLC-γ1活性來(lái)抑制胚胎血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的下游轉(zhuǎn)導(dǎo)，證明其對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程中血細(xì)胞的生成及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子具有非常重要的調(diào)控作用。PLC-γ1蛋白在不同家畜、物種及進(jìn)化過(guò)程中具有較高的序列保守性，對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、胚胎發(fā)育等都有著重要影響[24-25]。

本研究旨在獲得真核過(guò)表達(dá)蛋白PLC-γ1，并通過(guò)注射純化PLC-γ1蛋白制備多克隆抗體，以綿羊早期胚胎為模型研究PLC-γ1在其發(fā)育中的信號(hào)通路機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本研究通過(guò)常規(guī)分子克隆技術(shù)擴(kuò)增獲得PLC-γ1基因，構(gòu)建pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1真核過(guò)表達(dá)載體后轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞表達(dá)，高質(zhì)量的鼠源IgG1重組抗體與納米磁珠共價(jià)偶聯(lián)制備的Anti-Flag免疫磁珠對(duì)PLC-γ1蛋白進(jìn)行純化后混入弗氏佐劑免疫試驗(yàn)兔，使用間接ELISA確定血清的效價(jià)，WB檢測(cè)抗體的特異性，飽和過(guò)硫酸銨對(duì)多克隆抗體進(jìn)行純化。將已構(gòu)建的綿羊PLC-γ1基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒顯微注射到綿羊MⅡ期卵母細(xì)胞胞質(zhì)中以驗(yàn)證PLC-γ1基因是否對(duì)綿羊胚胎發(fā)育具有影響，孤雌激活卵裂后分別在mRNA及蛋白水平上進(jìn)行PLC-γ1表達(dá)檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株、載體、細(xì)胞及試驗(yàn)動(dòng)物：E.coliDH5α Electro-Cells購(gòu)自TaKaRa有限公司，pcDNA3.1-EGFP(+)載體、Puc57-P2A-Flag-PLC-γ1菌株、HEK-293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供；試驗(yàn)兔(新西蘭大白兔)由石河子大學(xué)動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

主要試劑：T4DNA連接酶、Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶、pMD19-T載體、Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；Anti-Flag免疫磁珠、磁力架、SYBR購(gòu)自Bimake公司；Trizol、AgeⅠ限制性內(nèi)切酶、聚偏二氟乙烯膜、預(yù)染蛋白Marker、Ipofectamin TM2000 Reagent、Diethyl Pyrocar bonate均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；Super DNA Marker、2xTaq PCR MasterMix、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、氨芐青霉素(Amp+)、卡那霉素(Kan+)、DAB顯色液、高純度無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；脫脂奶粉購(gòu)自美國(guó)BD公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液、PMSF均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Flag標(biāo)簽一抗、β-actin一抗、羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)二抗均購(gòu)自Abcam公司。

綿羊用割卵液、成熟培養(yǎng)液、SoFaa胚胎培養(yǎng)液配方(所用試劑均購(gòu)自Sigma公司)：割卵液：PBS 95 mL、Heperin 0.005 g、Penicillin 0.008 g、Streptomycin 0.005 5 g、Phenol red 0.001 g、FBS 5 mL。成熟培養(yǎng)液：TCM199 0.92 g、NaHCO30.25 g、Hepes 0.246 3 g、Na-Py 0.033 g、Glutamine 0.005 g、0.075 IU·mL-1HMG 1 mL、1 μg·mL-117 β-雌二醇 1 mL、S/N 0.007 g、Phenol red 0.001 g、FBS 10 mL、無(wú)菌去離子水88 mL。SoFaa胚胎培養(yǎng)液：NaCl 0.632 5 g、KCl 0.048 2 g、KH2PO40.012 3 g、NaHCO30.265 1 g、Na-Py 0.003 6 g、L-Glutamine 0.015 8 g、BSA 0.8 g、CaCl2·2H2O 0.024 8 g、MgCl2·6H2O 0.01 g、BME(amino acids) 2 mL、MEM(amino acids) 1 mL、Sodium lactate 28.22 μL、Pencillin 0.008 g、Strep 0.005 5 g、Phenol red 0.001 g、無(wú)菌去離子水96.97 mL。

主要儀器：FormaTMSteri-CultTMCO2Incubators(SANYO)；PCR儀(TC400)；電泳儀(北京六一DYY-8C)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)；凝膠成像儀(英國(guó)Clearer公司)；紫外分光光度計(jì)(美國(guó)BioTek公司)；Protein simple成像儀(美國(guó)Protein Simple公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 利用Primer Premier 5.0軟件以Puc57-P2A-Flag-PLC-γ1菌株為模板對(duì)所設(shè)計(jì)的引物上、下游分別引入Hind Ⅲ、AgeⅠ酶切位點(diǎn)。根據(jù)綿羊P2A-Flag-PLC-γ1基因序列和綿羊β-actin基因(登錄號(hào)：443052)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量qPCR引物(表1)。由生工(上海)生物技術(shù)有限責(zé)任公司對(duì)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行合成。

表1 引物序列

1.2.2 pMD19-T-P2A-Flag-PLC-γ1克隆載體的構(gòu)建 使用設(shè)計(jì)好的引物以Puc57-P2A-Flag-PLC-γ1為模板進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，擴(kuò)增體系(25 μL)：2×GC Buffer Ⅰ 12.5 μL，ddH2O 6 μL，dNTP Mixture 4 μL，模板1 μL，上、下游引物(PLC-γ1)各0.5 μL，LA Taq酶0.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s，58 ℃退火1 min，68 ℃延伸4 min，30個(gè)循環(huán)；68 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。1.0%瓊脂糖凝膠電泳(120 V 90 mA，45 min)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證。

根據(jù)DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒產(chǎn)品的操作規(guī)范和說(shuō)明書(shū)對(duì)符合目的片段大小的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收試驗(yàn)操作，膠回收產(chǎn)物通過(guò)核酸定量?jī)xNanoDrop 2000c測(cè)定濃度，驗(yàn)證合格的產(chǎn)物與T載體16 ℃過(guò)夜連接，連接體系(10 μL)：10×ligation buffer*12 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，T載體2 μL，插入DNA片段2 μL，ddH2O 3 μL。將過(guò)夜連接后的pMD19-T-P2A-Flag-PLC-γ1克隆載體轉(zhuǎn)入E.coliDH5α Electro-Cells后涂布于帶有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上，挑取單菌株進(jìn)行PCR鑒定(反應(yīng)所需體系同上，退火溫度為56 ℃，上、下游引物為PLC-γ1-Yiyuan)，提取PCR鑒定的陽(yáng)性克隆菌株的質(zhì)粒，使用Hind Ⅲ和AgeⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定后測(cè)序。

1.2.3 pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1真核過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建 使用Hind Ⅲ、AgeⅠ限制性內(nèi)切酶酶切測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒pMD19-T-P2A-Flag-PLC-γ1及pcDNA3.1-EGFP(+)載體，回收P2A-Flag-PLC-γ1基因片段及載體片段，兩者16 ℃過(guò)夜連接，構(gòu)建pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1真核過(guò)表達(dá)載體，在冰上轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞后涂布于帶有載體抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，陽(yáng)性菌株提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定后進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞 將含有重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1的菌液接種于3 000 mL氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩過(guò)夜培養(yǎng)，然后根據(jù)天根公司無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒產(chǎn)品的操作規(guī)范和說(shuō)明書(shū)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行提取試驗(yàn)操作。Lipofectamin TM2000 Reagent包裹真核過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后37 ℃、5%CO2孵育4～6 h后更換新鮮培養(yǎng)液去除細(xì)胞毒性，24 h后，熒光顯微鏡觀測(cè)試驗(yàn)結(jié)果，確定轉(zhuǎn)染效果以及PLC-γ1表達(dá)情況。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PLC-γ1 mRNA表達(dá)情況 在冰上對(duì)轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，對(duì)反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物進(jìn)行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)體系(20 μL)：50×ROX Reference Dye(low Donc) 0.5 μL，ddH2O 6.5 μL，2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物(PLC-γ1-qPCR/β-actin-qPCR)各1 μL。qPCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，55個(gè)循環(huán)。每組樣品均重復(fù)3次試驗(yàn)，反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算mRNA水平上PLC-γ1表達(dá)情況。

1.2.6 免疫印跡法檢測(cè)HEK-293T細(xì)胞中PLC-γ1蛋白表達(dá) 根據(jù)RIPA裂解液以及PMSF使用說(shuō)明書(shū)提取轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞的總蛋白，對(duì)所提取的細(xì)胞總蛋白使用BCA試劑盒進(jìn)行濃度測(cè)定，5×SDS蛋白上樣液煮沸變性，免疫印跡法(Flag抗體為一抗，羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)二抗)檢測(cè)PLC-γ1蛋白表達(dá)。

1.2.7 Anti-Flag免疫磁珠對(duì)PLC-γ1蛋白進(jìn)行純化 取20 μL磁珠懸液至新離心管，500 μL TBS吹打重懸3次后移除上清；加入200 μL細(xì)胞裂解液，室溫孵育2.5 h后進(jìn)行磁性分離，留取沉淀磁珠，移除上清用于陰性對(duì)照檢測(cè)；500 μL PBST吹打重懸，上下翻轉(zhuǎn)樣品5 min，磁性分離后移除上清，該過(guò)程進(jìn)行3次；取pH為3的0.1 mol·L-1glycine HCl 100 μL在搖床上洗脫15 min；洗脫產(chǎn)物加入pH為8的1 mol·L-1Tris-HCL調(diào)節(jié)pH直至中性。

1.2.8 純化后的PLC-γ1蛋白進(jìn)行SDS凝膠電泳及免疫印跡檢測(cè) SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及WB(Flag抗體為一抗，稀釋后的羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)二抗為二抗)檢測(cè)純化后的PLC-γ1蛋白表達(dá)情況。

1.2.9 PLC-γ1多克隆抗體的制備 將純化的PLC-γ1蛋白混入弗氏佐劑免疫健康狀態(tài)良好的試驗(yàn)兔，免疫程序：免疫前對(duì)2只健康且狀態(tài)良好的試驗(yàn)兔耳緣靜脈抽血2 mL留作陰性對(duì)照；免疫第1天(第一次免疫)，純化的800 μg蛋白與完全佐劑等體積混合后形成穩(wěn)定的乳化劑，在試驗(yàn)兔皮下采用五點(diǎn)法進(jìn)行注射；第15天(第二次免疫)純化的800 μg蛋白與完全佐劑等體積混合注射；第29天(第三次免疫)純化的500 μg蛋白與不完全佐劑等體積混合注射；第36天耳動(dòng)脈抽血2 mL，WB鑒定多克隆抗體產(chǎn)生情況，ELISA測(cè)其血清效價(jià)；第43天(第四次免疫)純化的500 μg蛋白與不完全佐劑等體積混合注射；第50天耳動(dòng)脈抽血2 mL，WB鑒定克隆抗體產(chǎn)生情況，ELISA測(cè)其血清效價(jià)；第53天心動(dòng)脈采血50 mL。

1.2.10 間接ELISA法檢測(cè)多抗血清效價(jià) 以純化后的PLC-γ1蛋白作為抗原，以100 μL·孔-1包被于96孔的ELISA反應(yīng)板，4 ℃過(guò)夜；PBST洗板3次后5%脫脂奶粉封閉1 h；PBST洗板3次，以免疫前的兔血清為陰性對(duì)照，其余的加入梯度倍比稀釋的兔血清100 μL·孔-1，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h，PBST洗板3次后100 μL·孔-1加入稀釋后的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，PBST洗板3次；在避光環(huán)境下每孔100 μL的TMB底物顯色液孵育20 min后1.5 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，在OD450 nm條件下檢測(cè)吸光值，若陰性對(duì)照的吸光值小于或等于所測(cè)孔吸光值的2.1倍，則為陽(yáng)性，重復(fù)試驗(yàn)3次；并分別對(duì)每試驗(yàn)組免疫后第0、36、50、53天的兔血清按上述方法進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。

1.2.11 使用飽和硫酸銨法純化多克隆抗體 試驗(yàn)兔的心動(dòng)脈血在4 ℃離心機(jī)內(nèi)13 000 r·min-1離心30 min；收集血清后與生理鹽水1∶1混合，緩慢滴加飽和硫酸銨(SAS)，并不斷攪拌下，4 ℃靜置10 h，使蛋白充分沉淀；13 000 r·min-1離心10 min后棄上清；沉淀中緩慢加入生理鹽水使其充分溶解后滴加SAS，4 ℃放置1 h；生理鹽水溶解沉淀并裝入透析袋放入盛有PBS的燒杯，于4 ℃冰箱數(shù)次更換透析液，-20 ℃保存。

1.2.12 WB鑒定多克隆抗體特異性 以稀釋后的兔血清為一抗，WB鑒定多克隆抗體特異性，DAB顯色后拍照留存。

1.2.13 卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng) 綿羊卵巢采自新疆石河子市屠宰場(chǎng)，在添加青鏈霉素(100 IU·mL-1)的38.5 ℃生理鹽水中保溫，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。清理綿羊卵巢結(jié)締組織后用生理鹽水洗滌3次，在含2 mL割卵液的60 mm培養(yǎng)皿中收集胞質(zhì)均勻、卵丘細(xì)胞包裹完整的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，在成熟培養(yǎng)液潤(rùn)洗3次后成熟培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為38.5 ℃、5% CO2飽和濕度。將卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)體外成熟培養(yǎng)24 h后，在透明質(zhì)酸酶(Sigma)中作用5 min除去顆粒細(xì)胞，然后在體視顯微鏡下挑選排出第一極體的成熟卵母細(xì)胞分組備用。

1.2.14 卵母細(xì)胞的孤雌激活 將成熟的卵母細(xì)胞隨機(jī)分為Ion-6D組、PLC-γ1組、空載組3組。PLC-γ1組的卵母細(xì)胞采用顯微注射pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1重組質(zhì)粒的方式進(jìn)行孤雌激活，空載組的卵母細(xì)胞進(jìn)行顯微注射pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒。將PLC-γ1組的卵母細(xì)胞置于100 μL操作溶液(CB)中，用1 mL石蠟油覆蓋制成微滴。在倒置熒光顯微操作儀上用內(nèi)徑100 μm、外徑為120 μm的固定針固定卵母細(xì)胞，用內(nèi)徑為5～7 μm的注入針吸取4 pL的[26]重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1，注入針經(jīng)透明帶進(jìn)入卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，緩慢將重組質(zhì)粒注入胞質(zhì)內(nèi)，輕輕退出注入針完成顯微注射，全部卵母細(xì)胞的顯微注射操作于1 h內(nèi)結(jié)束(圖1)；以相同的顯微注射方法，實(shí)現(xiàn)空載組卵母細(xì)胞的注入；Ion-6D組以離子霉素(Ion)結(jié)合6-DMAP發(fā)生孤雌激活，Ion-6D組的卵母細(xì)胞在離子霉素微滴中作用約5 min，后置于6-DMAP微滴中作用4 h。激活后將3組卵母細(xì)胞分別置于100 μL SoFaa培養(yǎng)液(自配，成分來(lái)自Sigma)微滴中培養(yǎng)48 h，后每隔48 h更換50 μL SoFaa培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。參考李昊[27]對(duì)不同時(shí)期綿羊早期胚胎的研究方法，對(duì)3組不同處理方式的卵母細(xì)胞在卵裂后不同時(shí)期(2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期、桑椹胚期)的綿羊早期胚胎進(jìn)行收集，各時(shí)期100個(gè)細(xì)胞，重復(fù)試驗(yàn)3次，對(duì)收集到的細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取及全蛋白提取。

A. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1質(zhì)粒；B. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒

1.2.15 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)綿羊早期胚胎發(fā)育各時(shí)期PLC-γ1 mRNA表達(dá)情況 使用GenEluteTM單細(xì)胞RNA純化試劑盒(Sigma)對(duì)綿羊早期胚胎發(fā)育各時(shí)期細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，對(duì)反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物進(jìn)行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)體系、條件同“1.2.5”，反應(yīng)結(jié)束后，計(jì)算mRNA水平上PLC-γ1表達(dá)情況。

1.2.16 WB檢測(cè)綿羊早期胚胎發(fā)育各時(shí)期PLC-γ1蛋白表達(dá)情況 使用全蛋白提取試劑盒(Solarbio)對(duì)綿羊早期胚胎發(fā)育各時(shí)期細(xì)胞進(jìn)行總蛋白提取，5×SDS蛋白上樣液煮沸變性，免疫印跡法(稀釋后的兔血清為一抗，稀釋后的羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)二抗為二抗)檢測(cè)PLC-γ1蛋白表達(dá)。

1.2.17 統(tǒng)計(jì)分析 采用GraphPad Prism 8.0繪制結(jié)果圖形。并采用IBM SPSS Statistics 26軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行解析。各組之間的多重因素比較可以通過(guò)鄧肯檢驗(yàn)加以評(píng)定。單因素方差分析(ANOVA)可以用來(lái)確定各組間的差異性。而兩組間差異性可以使用學(xué)生t檢測(cè)。數(shù)據(jù)以“平均值±SEM”表示。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每組數(shù)據(jù)中不同字母表示其平均值間有顯著差異(P<0.05)。

2 結(jié) 果

2.1 pMD19-T-P2A-Flag-PLC-γ1克隆載體的構(gòu)建

以實(shí)驗(yàn)室保存的Puc57-P2A-Flag-PLC-γ1菌株為模板，成功擴(kuò)增出約3 960 bp的目的片段(圖2)，以PLC-γ1-Yiyuan為引物，經(jīng)過(guò)菌液PCR驗(yàn)證，成功擴(kuò)增出約330 bp基因片段(圖3)。篩選出陽(yáng)性克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果Blast后與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示與綿羊羊磷脂酶C γ1(PLCG1)轉(zhuǎn)錄本變體X3(登錄號(hào):XM_027977197.2)基因同源性為100%，X1(登錄號(hào):XM_027977196.2)的同源性達(dá)到98.56%，與轉(zhuǎn)錄本變體X2(登錄號(hào):XM_042230134.1)的同源性達(dá)到98.35%。表明成功構(gòu)建pMD19-T-P2A-Flag-PLC-γ1克隆載體。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2.PCR產(chǎn)物；N.陰性對(duì)照

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) (50～1 031 bp)；1～6. 菌液PCR產(chǎn)物；N. 陰性對(duì)照

2.2 pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

將克隆后的基因片段連接至pcDNA3.1-EGFP載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α后，以PLC-γ1-Yiyuan為引物，經(jīng)過(guò)菌液PCR驗(yàn)證，成功擴(kuò)增出約330 bp基因片段(圖4)，雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果證實(shí)成功切出目的基因片段(圖5)，測(cè)序結(jié)果正確，以上結(jié)果均表明，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1過(guò)表達(dá)載體。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(50～1 031 bp)；1～3. 菌液PCR產(chǎn)物；N. 陰性對(duì)照；4. pcDNA3.1-EGFP空載

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、3. pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1 Hind Ⅲ、Age Ⅰ雙酶切產(chǎn)物；N. 陰性對(duì)照

2.3 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞

轉(zhuǎn)染24 h后在熒光顯微鏡下觀察HEK-293T細(xì)胞，成功觀測(cè)到綠色熒光(圖6)。

A. 正常HEK-293T細(xì)胞(明場(chǎng))；B. 正常HEK-293T細(xì)胞(暗場(chǎng))；C. 正常HEK-293T細(xì)胞Merge圖；D. pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞(明場(chǎng))；E. pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞(暗場(chǎng))；F. pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞Merge圖；G. pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞(明場(chǎng))；H. pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞(暗場(chǎng))；I. pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞Merge圖

2.4 HEK-293T細(xì)胞PLC-γ1基因水平表達(dá)

轉(zhuǎn)染成功的HEK-293T細(xì)胞采用RT-qPCR檢測(cè)方法對(duì)細(xì)胞的PLC-γ1基因進(jìn)行mRNA表達(dá)量的檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)組mRNA水平上PLC-γ1基因與Control組及空載組相比表達(dá)量明顯升高，差異極顯著(P< 0.01)。而空載組其表達(dá)量接近于Control組，因此兩者之間沒(méi)有差異(P> 0.05)(圖7)。

1.Control組；2.空載組；3.過(guò)表達(dá)組。*. P>0.05；**.P<0.05；***.P<0.01。下同

2.5 HEK-293T細(xì)胞PLC-γ1蛋白水平表達(dá)

對(duì)轉(zhuǎn)染成功后的HEK-293T細(xì)胞裂解收集總蛋白，同時(shí)設(shè)置正常HEK-293T細(xì)胞、空載體對(duì)照，進(jìn)行WB分析。WB結(jié)果顯示在149 ku大小處有目標(biāo)條帶(圖8)，分析結(jié)果顯示檢測(cè)目的蛋白大小與PLC-γ1蛋白一致，且蛋白表達(dá)量存在差異(圖9)。

1. HEK-293T細(xì)胞總蛋白；2. pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞總蛋白；3. pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞總蛋白

1. HEK-293T細(xì)胞總蛋白；2. pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞總蛋白；3. pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞總蛋白

2.6 重組蛋白pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1的純化及鑒定

經(jīng)Anti-Flag免疫磁珠純化后的蛋白及Flag-tag蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及WB檢測(cè)，結(jié)果顯示使用Anti-Flag免疫磁珠成功純化出目的蛋白(149 ku)(圖10)。

M.蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、4. pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞總蛋白；2、5.經(jīng)Anti-Flag免疫磁珠純化的PLC-γ1蛋白；3、6. Flag-tag蛋白

2.7 間接ELISA法檢測(cè)多抗血清的效價(jià)

為制備特異性抗原肽，對(duì)2只新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，使用間接ELISA法檢測(cè)血清效價(jià)，重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值(表2、圖11)。當(dāng)制備的PLC-γ1多抗稀釋比例至1∶12 800時(shí)，Rabbit1的OD450 nm值為0.394，Rabbit2的OD450 nm值為0.262，其與陰性對(duì)照孔相比仍然都大于2.1倍，因此多抗血清效價(jià)為1∶12 800。

表2 ELISA初步檢測(cè)血清效價(jià)

圖11 多抗血清的ELISA效價(jià)檢測(cè)

2.8 多克隆抗體的鑒定

WB結(jié)果顯示，在約149 ku區(qū)域，PLC-γ1蛋白與制備的多克隆抗體成功結(jié)合(圖12)，這表明所制備的兔多克隆抗體具有很好的特異性。

1、2、4、5. pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞總蛋白；3、6. pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞總蛋白

2.9 孤雌激活后觀察胚胎發(fā)育狀況

Ion-6D孤雌激活的卵母細(xì)胞在激活后48 h開(kāi)始卵裂；顯微注射pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1載體的卵母細(xì)胞在注射后48 h開(kāi)始卵裂，熒光顯微鏡下觀察可成功觀測(cè)到綠色熒光(圖13)；注射空載體組的卵母細(xì)胞沒(méi)有卵裂現(xiàn)象，排除了顯微注射過(guò)程中機(jī)械刺激與pcDNA3.1-EGFP空載激活卵母細(xì)胞的可能性。綜上所述，說(shuō)明PLC-γ1重組質(zhì)?？稍诼涯讣?xì)胞中發(fā)揮作用，且具有作為新的卵母細(xì)胞激活因子的潛能。

A. Ion-6D孤雌激活(明場(chǎng))；B. Ion-6D孤雌激活(暗場(chǎng))；C. Ion-6D孤雌激活Merge圖；D. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1載體(明場(chǎng))；E. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1載體(暗場(chǎng))；F. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1載體Merge圖；G. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP載體(明場(chǎng))；H. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP載體(暗場(chǎng))；I. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP載體Merge圖

2.10 綿羊早期胚胎發(fā)育各時(shí)期PLC-γ1基因水平表達(dá)

對(duì)Ion-6D激活及顯微注射處理后的兩組綿羊早期胚胎采用RT-qPCR方法檢測(cè)其發(fā)育過(guò)程中各細(xì)胞時(shí)期的PLC-γ1基因mRNA表達(dá)量，試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組早期胚胎在發(fā)育過(guò)程中PLC-γ1基因mRNA表達(dá)量都存在先下降后上升的趨勢(shì)，且在桑葚胚時(shí)期表達(dá)量劇增；顯微注射組與Ion-6D激活組相比，除2細(xì)胞期外，其他時(shí)期表達(dá)量不斷升高，差異顯著性不斷增強(qiáng)(圖14)。

圖14 激活后綿羊早期胚胎發(fā)育各時(shí)期PLC-γ1基因mRNA表達(dá)量

2.11 綿羊早期胚胎發(fā)育各時(shí)期PLC-γ1蛋白水平表達(dá)

對(duì)孤雌激活后胚胎發(fā)育至2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期、桑椹胚期的細(xì)胞裂解收集總蛋白，進(jìn)行WB分析。分析結(jié)果顯示，在149 ku處不同處理方式下不同時(shí)期的早期胚胎其蛋白表達(dá)量存在差異(圖15、圖16)。

1.成熟卵母細(xì)胞；2、4、6、8. Ion-6D激活后綿羊早期胚胎發(fā)育至2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期、桑葚胚期；3、5、7、9. 顯微注射后綿羊早期胚胎發(fā)育至2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期、桑葚胚期

圖16 綿羊早期胚胎發(fā)育各時(shí)期PLC-γ1蛋白相對(duì)豐度

3 討 論

研究表明，PLC-γ1在許多組織中都存在廣泛表達(dá)的現(xiàn)象，尤其是在神經(jīng)細(xì)胞組織中大量表達(dá)[28-29]，且對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖，胚胎發(fā)育，癌癥的發(fā)生與凋亡[30-33]等方面起著至關(guān)重要的作用。PLC對(duì)綿羊卵母細(xì)胞胞質(zhì)鈣振蕩和早期胚胎發(fā)育影響的研究中發(fā)現(xiàn)，PLC在卵母細(xì)胞激活時(shí)啟動(dòng)Ca2+釋放，促進(jìn)胚胎發(fā)育，而且在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中也引起Ca2+波動(dòng)，說(shuō)明PLC對(duì)胚胎發(fā)育至關(guān)重要，因此PLCγ具有相同的作用，但是PLC不同亞型之間啟動(dòng)不同的調(diào)控機(jī)制，實(shí)現(xiàn)其在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中復(fù)雜、精密、各異的調(diào)控功能。在卵細(xì)胞成熟過(guò)程中，PLC-γ1對(duì)顆粒細(xì)胞的發(fā)育[34-35]有著重要影響，且在轉(zhuǎn)基因研究上表明其調(diào)控小鼠[36]和斑馬魚(yú)[37-38]的胚胎發(fā)育，說(shuō)明PLC-γ1在調(diào)控早期胚胎發(fā)育過(guò)程中有著重要作用。但其確切的作用機(jī)制仍不清楚，目前，隨著生命科學(xué)的迅速發(fā)展，PLC-γ1在生殖發(fā)育中發(fā)揮的作用逐漸引起了人們的關(guān)注，特別是其對(duì)精子的發(fā)生發(fā)育、卵子受精和胚胎發(fā)育影響的研究日益成為生殖發(fā)育領(lǐng)域的熱點(diǎn)。因此，對(duì)于PLC-γ1真核過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建以及多克隆抗體的制備，都是上述研究開(kāi)展的基礎(chǔ)。

在現(xiàn)代生物技術(shù)的支持下，很難從組織中獲取高純度可溶性、功能性蛋白質(zhì)，且天然蛋白質(zhì)來(lái)源較少，很難滿足生物試驗(yàn)的要求，因此，需要引入基因工程來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的體外過(guò)表達(dá)。為大量獲取重組蛋白，越來(lái)越多研究人員選擇使用真核和原核系統(tǒng)表達(dá)獲取目的蛋白。本試驗(yàn)為能夠快速靈活的制備高活性、多復(fù)雜修飾的純化綿羊PLC-γ1蛋白，選擇帶有綠色熒光標(biāo)記的真核過(guò)表達(dá)系統(tǒng)pcDNA3.1-EGFP。為減少重組質(zhì)粒上的熒光蛋白對(duì)目的蛋白活性的影響，在目的片段中引入P2A序列，由于綿羊PLC-γ1蛋白沒(méi)有相對(duì)應(yīng)抗體，為方便鑒定，在目的片段中引入Flag標(biāo)簽。最終構(gòu)建了pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1真核過(guò)表達(dá)載體。通過(guò)轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞成功表達(dá)PLC-γ1蛋白后使用Anti-Flag免疫磁珠純化蛋白以減少非特異吸附，將表達(dá)的PLC-γ1蛋白混入弗氏佐劑免疫試驗(yàn)兔，ELISA測(cè)得血清效價(jià)可達(dá)1∶12 800。試驗(yàn)所制備的多克隆抗體會(huì)對(duì)PLC-γ1蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)，表明筆者所用的高質(zhì)量的鼠源IgG1重組抗體與納米磁珠共價(jià)偶聯(lián)制備的Anti-Flag免疫磁珠所純化的蛋白質(zhì)具有良好的免疫原性，可誘導(dǎo)發(fā)生良好的體液免疫反應(yīng)。通過(guò)與馬忠臣等[39]、楊義[40]的研究結(jié)果進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，抗體產(chǎn)生的速率與多種因素存在直接聯(lián)系，其與目的蛋白的特性，所混弗氏佐劑的劑量，所免疫試驗(yàn)動(dòng)物物種的特性都存在著一定的關(guān)系。這在一定程度上可為動(dòng)物免疫試驗(yàn)提供參考數(shù)據(jù)。本研究在綿羊早期胚胎細(xì)胞發(fā)育階段通過(guò)熒光顯微鏡可觀察到綠色熒光，表明PLC-γ1重組質(zhì)粒可在綿羊早期胚胎細(xì)胞中發(fā)揮作用。且提取綿羊各時(shí)期早期胚胎的mRNA及全蛋白進(jìn)行RT-qPCR及WB檢測(cè)表明，PLC-γ1在綿羊早期胚胎各時(shí)期均有表達(dá)。且在綿羊早期胚胎細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中PLC-γ1表達(dá)量在不同時(shí)期呈現(xiàn)出不同的趨勢(shì)，表明PLC-γ1在綿羊早期胚胎細(xì)胞不同的發(fā)育階段發(fā)揮著不同的作用。

綿羊是一種常見(jiàn)的家養(yǎng)動(dòng)物，同時(shí)也經(jīng)常是人類(lèi)某些疾病研究的動(dòng)物模型，因此，接下來(lái)的研究重點(diǎn)將是以綿羊卵母細(xì)胞為研究對(duì)象，進(jìn)一步探索PLC-γ1蛋白對(duì)早期胚胎發(fā)育的分子機(jī)制。筆者后期打算應(yīng)用基因沉默、流式分選、共聚焦監(jiān)測(cè)鈣離子波動(dòng)等技術(shù)和方法，篩選關(guān)鍵的作用因子和信號(hào)通路，為探索PLC-γ1在綿羊卵母細(xì)胞中蛋白表達(dá)的作用機(jī)理提供新的理論依據(jù)，也為探索PLC-γ1通過(guò)信號(hào)通路調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟的作用機(jī)理研究提供新的理論依據(jù)，為后續(xù)一系列揭示綿羊早期胚胎發(fā)育的分子機(jī)制試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，對(duì)動(dòng)物胚胎過(guò)程的發(fā)展及提高人類(lèi)輔助生殖健康具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了PLC-γ1真核過(guò)表達(dá)載體并制備了綿羊PLC-γ1多克隆抗體，通過(guò)顯微注射技術(shù)將重組質(zhì)粒注入卵母細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)表達(dá)，證明PLC-γ1在綿羊早期胚胎發(fā)育各時(shí)期均有表達(dá)，且具有作為新的卵母細(xì)胞激活因子的潛能。既為探索綿羊PLC-γ1基因?qū)β涯讣?xì)胞激活作用及早期胚胎發(fā)育的影響提供了科學(xué)依據(jù)，也為進(jìn)一步提升綿羊的繁殖性能研究奠定了基礎(chǔ)。