基于LCMS技術對牦牛圍產(chǎn)后期的血清動態(tài)代謝組學分析

馬曉玲，彭 巍，舒 適

(青海大學，西寧 810016)

牦牛是主要生活在高海拔地區(qū)的一類珍稀物種，被譽為“高原之舟”[1]。作為青藏高原的唯一大型哺乳動物，牦牛不僅為當?shù)鼐用裉峁┤夂湍?，還被用作貿(mào)易運輸?shù)墓ぞ?。牦牛的皮、毛、絨及角也都具有一定的經(jīng)濟價值，為高原牧民提供了生活必需品與經(jīng)濟支撐[2]。然而，牦牛的繁殖率普遍偏低，成年母牦牛的繁殖率多為兩年一胎，甚至三年一胎[3]。這種較低的繁殖率除了由于牦牛自身的性成熟較晚、生殖發(fā)育緩慢、生長周期較長以外，營養(yǎng)水平、環(huán)境因素、科學的管理模式、發(fā)情配種和疾病都會直接或間接影響繁殖率[3-4]。近年來，雖然國內(nèi)外的研究者已經(jīng)對牦牛繁殖方面進行了深入的研究，但是對于圍產(chǎn)期的研究鮮有報道。圍產(chǎn)期是經(jīng)產(chǎn)母畜極為重要的時期，一般界定為妊娠第31周到產(chǎn)后4周，即產(chǎn)前28天至產(chǎn)后28天[5]。在圍產(chǎn)期，經(jīng)產(chǎn)母畜機體的任何異常變化，都會直接或間接地影響其健康狀況與繁殖性能[6]。基于前期的研究可知，經(jīng)產(chǎn)牦牛在圍產(chǎn)后期發(fā)生了能量負平衡，其酮體含量升高，并且對生殖激素的分泌存在一定的影響[7]。另外也有研究者發(fā)現(xiàn)，在圍產(chǎn)期對牦牛進行不同程度的補飼，可提高牦牛的繁殖率和犢牛的生長性能[8-9]。但是繁殖率的提高是參差不齊的，而且補飼提高繁殖性能的具體機制是不清楚的。這是由于缺乏牦牛圍產(chǎn)期機體代謝的基礎資料。

代謝組學作為系統(tǒng)生物學的重要組成部分，能夠?qū)Ρ确治霾煌±?、生理狀態(tài)下的代謝圖譜，從而揭示疾病機制。液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography mass spectrometry，LCMS)技術作為代謝組學主要技術平臺之一，不僅分離度與靈敏度高、樣品預處理簡單[10-11]，還能夠?qū)颖具M行靈敏和全面的評估[12]。Liu等[13]應用LCMS技術對牦牛瘤胃菌群和代謝產(chǎn)物之間的關系進行了研究，不僅得到了不同飼料對應的瘤胃菌群類型，還通過分析揭示了飼料類型是如何改變瘤胃代謝的產(chǎn)物和模式的。Yang等[14]也利用LCMS技術對比了包括牦牛在內(nèi)的幾種產(chǎn)奶動物的乳汁差異代謝組學，結果發(fā)現(xiàn)了各種動物乳汁中的特有代謝物，以及這些乳汁中獨特的代謝機制。LCMS實際上廣泛的應用于人類、動物和植物，不僅能夠獲得有價值的標志物，還能夠推測構建網(wǎng)絡代謝機制。

本研究應用LCMS技術篩選經(jīng)產(chǎn)母牦牛圍產(chǎn)后期各時期的代謝物表達譜，結合生物信息學分析，旨在闡明經(jīng)產(chǎn)母牦牛圍產(chǎn)后期動態(tài)的代謝情況，并通過代謝物的功能挖掘，構建其代謝網(wǎng)絡以及其對生殖激素影響的機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物的選擇和分組

試驗自4月起在青海省海北藏族自治州海晏縣隨機選取經(jīng)產(chǎn)牦牛8頭，所選牦牛年齡、胎次和體況均相近，飼養(yǎng)管理方式為自由放牧，且無任何補飼措施。自牦牛分娩之日起，每隔7 d采集1次血液，并根據(jù)時間點進行分組，分別為分娩日(A組)、產(chǎn)后7天(B組)、產(chǎn)后14天(C組)、產(chǎn)后21天(D組)和產(chǎn)后28天(E組)。試驗母牦?；拘畔⒁姳?。

表1 試驗母牦?；拘畔?/p>

1.2 血液樣本采集

采用頸靜脈采血的方法，采集全血，不加任何抗凝劑。室溫靜置3 h后，收集血清。3 000 r·min-1離心5 min，提取上清液，-80 ℃保存。

1.3 樣品前處理

取100 μL或100 mg樣品，液氮研磨，加入3倍體積的 lysis buffer(80%甲醇)，渦旋混勻，組織破碎儀45 Hz 研磨處理4 min，超聲5 min(冰水浴)。于-20 ℃靜置30 min，14 000g離心 30 min，取上清，用0.45 μm的濾膜過濾，待上機。取上清20 μL于進樣瓶中上機檢測。所有樣品另取等量上清混合成質(zhì)控(quality control，QC)樣品上機檢測。

1.4 質(zhì)譜鑒定

樣品按儀器要求上高效液相色譜儀(Thermo，系統(tǒng)： Thermo ScientificTMDionexTMltiMateTM3000 Rapid Separation LC (RSLC))檢測，其中質(zhì)譜系統(tǒng)為Thermo，型號：Q Exactive。Loading Pump流速0.25 mL·min-1，20 min。流動相參數(shù)設置見表2，離子源參數(shù)為噴霧電壓2 500 V，毛細管溫度320 ℃，離子源為HESI；質(zhì)譜采用70000 FWHM方法，全掃描目標為3e6，全掃描最大值100 ms，掃描范圍為100～1 500 m·z-1；二級質(zhì)譜采用17500 FWHM方法，目標和最大值分別為1e5和50 ms。

表2 流動相參數(shù)設置

1.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)經(jīng)過歸一化及降噪處理后，進行數(shù)據(jù)庫檢索。數(shù)據(jù)庫包括METLIN數(shù)據(jù)庫(https://metlin.scripps.edu)、Human Metabolome Database數(shù)據(jù)庫(https://metlin.scripps.edu)和ChemSpider數(shù)據(jù)庫(www.chemspider.com)。將質(zhì)譜檢測得到的原始文件(.uep)導入 Progenesis QI 2.3 (PQI)軟件中，對不同樣品根據(jù)保留時間偏差 0.2 min 和質(zhì)量偏差 5 ppm 進行數(shù)據(jù)對齊，CV(coefficient of variance)值30%、信噪比3、最小信號強度100 000、加和離子等信息進行峰提取反褶積，峰值提取。對峰面積進行定量，再整合目標離子，然后通過分子離子峰和碎片離子進行分子式的預測并與數(shù)據(jù)庫進行比對，對定量結果進行歸一化和標記矩陣的生產(chǎn)和識別，最后得到數(shù)據(jù)的鑒定和定量結果。

1.6 差異代謝物的篩選

為了更好的顯示經(jīng)產(chǎn)母牦牛圍產(chǎn)期代謝的動態(tài)變化，試驗篩選每2個時間點之間的差異代謝物，旨在構建經(jīng)產(chǎn)母牦牛在圍產(chǎn)后期的代謝情況。試驗采用多元統(tǒng)計分析的方法，在最大程度保留原始信息的基礎上對采集的多維數(shù)據(jù)進行降維和回歸分析，然后進行差異代謝物的篩選及后續(xù)分析。主要包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS_DA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。通過計算第一主成分的變量投影重要度(variable importance in projection，VIP)值以及差異性(P值)和差異倍數(shù)進行差異代謝物的篩選。

1.7 差異代謝物的生物信息學分析

試驗對篩選的差異代謝物進行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)功能注釋、HMDB(Human Metabolome Database)注釋和LIPID注釋分析。KEGG功能注釋主要通過信號通路挖掘代謝物參與的主要生化代謝路徑和信號轉導途徑，數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址https://www.genome.jp/kegg/；HMDB注釋是與人類相關的小分子代謝物的詳細信息，雖然人類與牦牛物種之間有所差異，但是HMDB的注釋可以在一定程度上幫助理解代謝物的主要功能，數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址https://hmdb.ca/；LIPID注釋主要用于挖掘脂質(zhì)類的差異代謝物的結構和功能；應用的數(shù)據(jù)庫為LIPID MAPS Structure Database(LMSD)，網(wǎng)址http://www.lipidmaps.org/data/structure/。3個數(shù)據(jù)庫的結合可以更好的構建經(jīng)產(chǎn)母牦牛圍產(chǎn)后期的動態(tài)代謝變化。

2 結 果

2.1 LCMS質(zhì)譜鑒定結果

試驗對正、負離子模式下的QC樣本進行了相關性分析，結果發(fā)現(xiàn)，負離子模式下QC樣本之間均無顯著性差異，且相關性顯著(圖1)，正離子模式下QC樣本之間雖無完全相關，但相關性均高于0.99。LCMS聯(lián)用在正離子模式下檢測到5 801個代謝物信號，其中2 841種代謝物得到定性分析結果。負離子模式下檢測到2 813個代謝物信號，其中1 326種代謝物得到定性分析結果。定性鑒定代謝物的聚類分析和PCA分析結果見圖2。

A.正離子模式下QC樣品之間的相關性；B.負離子模式下QC樣品之間的相關性

A, C.分別為正離子模式下代謝物的聚類分析和PCA分析；B, D. 為負離子模式下代謝物的聚類分析和PCA分析

2.2 差異代謝物的篩選

試驗對差異代謝物的篩選標準為：1)根據(jù)原始數(shù)據(jù)進行每兩個時間點的T-test統(tǒng)計分析，計算P值，P<0.05為統(tǒng)計學意義的差異；2)差異倍數(shù)(Fold change，F(xiàn)C)，根據(jù)原始數(shù)據(jù)進行每兩個時間點的相對定量均值的比值來計算FC，設定FC>2.0或FC<0.5為本試驗的FC閾值；3)VIP值的計算，根據(jù)對原始數(shù)據(jù)進行多元統(tǒng)計分析計算VIP值，設置閾值為VIP>1.0。

根據(jù)設置的閾值進行差異代謝物的篩選，在正離子模式下篩選出差異代謝物共65個，其中4個重復結果，故為61種差異代謝物；負離子模式下篩選的差異代謝物共57個，其中1個重復結果，故為56種差異代謝物。整合結果共篩選出122個差異代謝物，除去重復的結果，共獲得117種差異代謝物。圖3是以E組和C組為例的對比分析結果。

A. E組和C組的聚類分析；B. E組和C組差異代謝物的篩選

2.3 生物信息學分析

2.3.1 KEGG數(shù)據(jù)庫功能分析 試驗對117種差異代謝物進行KEGG數(shù)據(jù)庫檢索，結果得到21個信號通路，歸屬于6個分類，包括細胞過程(cellular process)、藥物開發(fā)(drug development)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、人類疾病(human diseases)、新陳代謝(metabo-lism)和生物系統(tǒng)(organismal systems)(圖4)。

圖4 差異代謝物的KEGG功能注釋

2.3.2 HMDB數(shù)據(jù)庫分析 試驗對117種差異代謝物進行HMDB數(shù)據(jù)庫檢索，結果得到11個結果，包括脂質(zhì)和類脂分子(lipids and lipid-like molecules)、有機雜環(huán)化合物(organoheterocyclic compounds)、有機酸及其衍生物(organic acids and derivatives)、苯環(huán)型化合物(benzenoids)、有機氧化合物(organic oxygen compounds)、苯丙烷和聚酮(phenylpropanoids and polyketides)、有機氧化合物(organooxygen compounds)、生物堿及其衍生物(alkaloids and derivatives)、核苷、核苷酸和類似物(nucleosides, nucleotides, and analogues)、有機氮化合物(organic nitrogen compounds)和木脂素、新木脂素及相關化合物(lignans, neolignans and related compounds)(圖5)。

圖5 差異代謝物的HMDB功能注釋

2.3.3 LMSD脂類注釋分析 試驗對117種差異代謝物進行LMSD數(shù)據(jù)庫檢索，結果得到13個結果，包括類固醇(steroids)、分泌腺(secosteroids)、神經(jīng)酰胺(ceramides)、黃酮類化合物(flavonoids)、芳香聚酮(aromatic polyketides)、甘油磷酸膽堿(glycerophosphocholines)、甘油磷酸乙醇胺(glycerophosphoethanolamines)、脂肪酸和共軛物(fatty acids and conjugates)、脂肪酯(fatty esters)、脂肪酰胺(fatty amides)、二十烷酸(eicosanoids)、脂肪醇(fatty alcohols)和含氧碳氫化合物(oxygenated hydrocarbons)(圖6)。

圖6 差異代謝物的LMSD功能注釋

2.4 關鍵差異代謝物的篩選和網(wǎng)絡機制的構建

根據(jù)對差異代謝物的篩選和生物信息學分析結果，篩選出與繁殖、脂類代謝和氨基酸代謝相關的關鍵差異代謝物30個，通過歸類篩選出18種關鍵代謝物(表3)。其中，隨時間推移表達上調(diào)的有9種，表達下調(diào)的有6種，表達不規(guī)則的有3種。

表3 篩選的關鍵差異代謝物

與繁殖性能相關的有3種，包括隨時間推移表達上調(diào)的β-皮質(zhì)醇(beta-cortol，Cor)和四氫皮質(zhì)醇(tetrahydrocortisol，TH-Cor)，表達下調(diào)的真菌毒素T2(mycotoxin T2，MT2)；與脂類代謝相關的有7種，包括隨時間推移表達上調(diào)的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)和甘油三酯(triglyceride，TG)，表達下調(diào)的丙酸(propanoic acid，Pac)、13S羥基十八碳二烯酸(13S-hydroxyoctadecadienoic acid，13-HODE)和9S羥基十八碳二烯酸(9S-hydroxyoctadecadienoic acid，9-HODE)，表達不規(guī)則的磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)；與氨基酸代謝相關的有8種，包括隨時間推移表達上調(diào)的精氨酰苯丙氨酸(arginyl-Phenylalanine，Arg-Phe)、D-谷氨酸(D-glutamic acid，D-Glu)、γ-谷氨酰半胱氨酸(gamma-glutamylcysteine，Gln-Cys)、甘氨酸(glycylleucine，Gly)和吲哚丙酮酸(indolepyruvate，Ipa)，表達下調(diào)的5-甲氧基色氨酸(5-methoxytryptophol，Trp)和酪氨酸苯丙氨酸(tyrosyl-phenylalanine，Tyr-Phe)，表達不規(guī)則的色氨酸谷氨酰胺(tryptophyl-glutamine，Trp-Gln)。

(轉下頁 Carried forward)

根據(jù)篩選的關鍵代謝物及其生物信息學的功能挖掘，試驗構建了經(jīng)產(chǎn)母牦牛圍產(chǎn)期代謝情況，以及對生殖激素的影響(圖7)。根據(jù)代謝物隨時間變化的趨勢，模擬在圍產(chǎn)后期相應代謝過程的動態(tài)變化(圖8)。

圖中藍色字體代謝物表示隨著時間的推移表達下調(diào)，紅色字體代謝物表示表達上調(diào)，既存在藍色字體又存在紅色字體的代謝物表示隨著時間的推移發(fā)生不規(guī)則變化；“×”表示通路受阻；“√”表示通路順暢；“→”表示代謝物的轉化和生成；“─┄→”表示通路部分步驟省略；“┤”表示代謝物抑制作用

圖8 圍產(chǎn)后期動態(tài)代謝作用

3 討 論

3.1 母牦牛圍產(chǎn)后期的糖代謝

葡萄糖是動物機體主要的能量來源[15]，葡萄糖的代謝一般分為無氧條件下的糖酵解過程和有氧條件下的三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle；TCA)，這兩個代謝途徑均能分解葡萄糖產(chǎn)生能量，以供給機體的正常生理需要[16]。葡萄糖在糖酵解的作用下產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸的出路主要有兩個，其中一個就是進入TCA，進一步分解產(chǎn)生能量供給機體。丙酮酸的另一條出路是糖異生，糖異生是葡萄糖合成的主要機制。母畜在分娩日由于分娩給機體帶來的能量消耗而導致血糖含量的降低，這在奶牛中早已被證實[17-18]。當機體血糖含量降低時，糖酵解和TCA過程效率降低，機體就會啟動葡萄糖的合成機制，用以提供能量[19]。但是，當糖酵解過程效率降低時，產(chǎn)生的丙酮酸也會隨之降低，糖異生過程的主要原料不足，葡萄糖的合成受阻。有研究報道[20]，母牛產(chǎn)后因采食量降低和泌乳增加，其體內(nèi)糖異生過程被抑制，從而引起血糖穩(wěn)態(tài)失衡[21]。隨著葡萄糖供能效率的降低，TCA過程中的草酰乙酸發(fā)生積累，草酰乙酸是糖異生過程中丙酮酸的下游代謝物，機體的草酰乙酸則會直接進入糖異生，開始合成葡萄糖。而這一過程可能導致母牦牛圍產(chǎn)后期葡萄糖呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，這與前期的研究結果相一致[7]。

3.2 母牦牛圍產(chǎn)后期的脂類代謝

試驗結果發(fā)現(xiàn)，TG，脂肪酸中的Pca，游離脂肪酸的一類甘油磷脂代謝物PS、PE、PC，以及脂肪酸中亞油酸的代謝物13-HODE和9-HODE等7種代謝物，在5個不同的時間點之間表現(xiàn)出了差異性。脂肪是動物主要能量儲藏形式，主要以TG的形式存在。隨著時間的推移，TG下調(diào)，這說明母牦牛在圍產(chǎn)后期發(fā)生了脂肪動員。當機體主要能量來源受阻時，為了獲取更多能量維持自身需求，便會動員脂肪以提供能量[22]。

大量脂肪被動員后，首先被分解為脂肪酸，Pca和亞油酸都屬于脂肪酸的一種。Pca是一種三碳短鏈脂肪酸，能夠維持腸道和免疫穩(wěn)態(tài)[23]。作為脂肪酸，它能夠直接影響脂肪細胞調(diào)節(jié)脂肪酸的代謝[24]。亞油酸屬于不飽和脂肪酸家族的一員，13-HODE和9-HODE是亞油酸的衍生物[25]。在人類的研究中發(fā)現(xiàn)，與健康女性相比，患有多囊卵巢綜合癥的女性血液中13-HODE和9-HODE水平升高，說明這兩種代謝物與生殖機能有關[26]。但是，在牦牛的研究中未見相關的報道。在本研究中，13-HODE和9-HODE隨著時間的推移表達下調(diào)，說明以其上游代謝物亞油酸和Pca為代表的脂肪酸在圍產(chǎn)后期的末期開始降低，推測脂肪動員可能在圍產(chǎn)后期的前期作用效率較高，直到中期開始降低，末期恢復糖代謝供能后，脂肪動員恢復正常。另外，發(fā)現(xiàn)幾種甘油磷脂隨著時間的推移表現(xiàn)不同的表達情況。甘油磷脂包含1個極性的磷酸頭部基團和1個或2個非極性脂肪?；膊炕鶊F，是所有活體細胞膜的主要成分[27]。甘油磷脂與脂肪酸之間可以通過水解合成作用相互轉化，與此同時，甘油磷脂之間也可以相互轉換。本研究中，3類甘油磷脂分別表現(xiàn)上調(diào)和下調(diào)，PC更是表現(xiàn)為先上調(diào)后下調(diào)，結果說明脂肪代謝在產(chǎn)后母牦牛機體內(nèi)發(fā)生變化，作為機體能量供給不足時的能量補充機制發(fā)揮了作用。

脂肪酸經(jīng)過反應生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A能夠進入TCA進行完全氧化，也可以通過脂肪酸代謝的逆方向合成脂肪酸[28]。然而，在母牦牛圍產(chǎn)后期，乙酰輔酶A的這兩條出路由于糖代謝的停滯以及脂肪的過度動員都不能進行，為了提供能量，乙酰輔酶A可以轉化為乙酰乙酰輔酶A，進而形成酮體，即乙酰乙酸、β-羥丁酸和丙酸[29]。酮體作為奶牛在圍產(chǎn)期發(fā)生能量負平衡的金標準，在牦牛的前期研究中也報道過。

本研究篩選的與脂類代謝相關的關鍵代謝物，通過構建網(wǎng)絡機制發(fā)現(xiàn)，脂類代謝在母牦牛圍產(chǎn)后期的前期為了提供能量，啟動脂肪動員。過度的脂肪動員產(chǎn)生了乙酰輔酶A，進一步反應產(chǎn)生了酮體，以供給牦牛機體能量需求。說明母牦牛圍產(chǎn)后期發(fā)生了嚴重的能量負平衡。

3.3 母牦牛圍產(chǎn)后期的氨基酸代謝

機體發(fā)生能量缺口時，蛋白質(zhì)代謝也為機體提供能量[30]。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本單位，可以分為生糖氨基酸和生酮氨基酸。

3.3.1 生糖氨基酸 生糖氨基酸主要通過作用于丙酮酸或α-酮戊二酸，本試驗結果中發(fā)現(xiàn)了Gln-Cys復合體，其中Cys就是作用于丙酮酸的生糖氨基酸。Cys是一種非必需中性氨基酸，為三羧酸循環(huán)提供碳源[31]。另外一個作用于丙酮酸的生糖氨基酸是Gly，它在分解過程中經(jīng)過氨基酸脫氨基、轉氨基，再經(jīng)氧化分解生成二氧化碳和水[32]。Gln-Cys復合體中Gln是作用于α-酮戊二酸的生糖氨基酸，其通過分界代謝和谷氨酸脫氫酶轉化為α-酮戊二酸參與TCA[33]。Arg-Phe中的Arg是作用于α-酮戊二酸的生糖氨基酸，Arg通過脫氨基作用轉變?yōu)樘钱惿緩降闹虚g產(chǎn)物，從而異生成葡萄糖。D-Glu同樣是作用于α-酮戊二酸的生糖氨基酸，它能夠被氧化后在轉氨基作用下生成α-酮戊二酸進入TCA[34]。

試驗發(fā)現(xiàn)的生糖氨基酸及氨基酸復合體均表達上調(diào)，說明機體在血糖較低的情況下，機體氨基酸代謝效率升高用以補充血糖。但是由于圍產(chǎn)后期的起初糖異生和TCA作用效率過低，生糖氨基酸并沒有發(fā)揮作用發(fā)生積累導致的升高。

3.3.2 生酮氨基酸 本試驗結果還發(fā)現(xiàn)了Trp和Tyr-Phe復合體，它們均為生酮氨基酸，其中Phe和Trp還分別從Arg-Phe和Trp-Gln復合體中被發(fā)現(xiàn)了。生酮氨基酸可直接作用于乙酰乙酰輔酶A，進而生成酮體。Trp作為必需氨基酸之一，是機體無法合成的，需要通過食物來獲得。Trp經(jīng)過催化和甲?；傅纫幌盗兴庾饔眯纬杀?，丙酮酸脫羧生成乙酰乙酸[35]；Tyr是一種含有酚羥基的芳香族極性氨基酸[36]，Tyr通過各種代謝催化后生成尿黑酸，再通過氧化和水解作用下合成延胡索酸和乙酰乙酸[37-38]；Phe是哺乳動物必需的氨基酸，是蛋白質(zhì)生物合成的底物[39]，它能夠通過酪氨酸轉氨酶催化后生成乙酰乙酸[40]。

本試驗發(fā)現(xiàn)既存在表達上調(diào)的生酮氨基酸及氨基酸復合體，也存在表達下調(diào)的生酮氨基酸及氨基酸復合體。Phe與其他生酮氨基酸表達相反可能是由于在產(chǎn)后初期，與Arg結合的復合體利用Arg的生糖功能大量產(chǎn)生，但機體沒有啟動糖異生所產(chǎn)生的累積導致的。Tyr與Trp表達下調(diào)，說明其參與了脂肪動員啟動，產(chǎn)生的乙酰輔酶A大量的轉化為酮體，以給機體提供能量。

3.4 母牦牛圍產(chǎn)后期生殖激素的合成與分泌

圍產(chǎn)后期生殖激素的分泌與合成不僅能夠反映母牦牛的生殖系統(tǒng)恢復情況，也在一定程度上決定了母牦牛下一次妊娠的時間。圍產(chǎn)期經(jīng)產(chǎn)母牦牛由于能量的流失，糖代謝發(fā)生障礙，過度的脂肪動員使機體產(chǎn)生酮體供給能量，發(fā)生了能量負平衡。與此同時，由于脂肪的過度動員產(chǎn)生的乙酰輔酶A也有部分在循環(huán)血液中形成了部分膽固醇。類固醇激素(甾體激素)是由膽固醇經(jīng)過一系列酶解反應產(chǎn)生的一類環(huán)脂肪烴化合物，主要包括糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素和性腺皮質(zhì)激素[41]。循環(huán)血液中的膽固醇主要作用于性腺，對性腺產(chǎn)生配子及分泌激素起著至關重要的作用[42]。有研究證實，膽固醇被催化合成類固醇激素后可進行機體代謝過程，而此時可生成皮質(zhì)醇和孕酮[43-44]。在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，嚴重控制飲食后，腎上腺皮質(zhì)細胞中膽固醇轉為類固醇激素的代謝通路活躍，大量合成皮質(zhì)醇以此適應外界應激[45]。這些也與本研究的結果相一致，代謝組學結果顯示作為產(chǎn)生P4的終端產(chǎn)物THCor和Cor在D和E兩個時間點分別顯著性升高，說明P4在后期開始形成并產(chǎn)生終端產(chǎn)物。另一方面，膽固醇也可以形成E2。E2作為最主要的雌性激素，其合成過程受到多種蛋白的共同調(diào)控作用[46]。作為卵巢類固醇激素的E2，在作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，可與P4協(xié)同促進子宮發(fā)育并誘導母畜發(fā)情[47-48]。另外，在差異代謝物的結果中還發(fā)現(xiàn)了MT2，有多個研究報告指出，奶牛產(chǎn)奶量和乏情都與MT2有關[49]。但是相關機制尚不清楚。

根據(jù)研究結果可以推測，過度脂肪動員后產(chǎn)生的乙酰輔酶A除了大量產(chǎn)生酮體以外，少部分形成了膽固醇，而僅有的膽固醇形成了P4導致最終產(chǎn)物THCor和Cor的上調(diào)。但是，膽固醇并沒有過多的形成E2，這一推測也與前期的研究結果相一致[7]。母牦牛在圍產(chǎn)后期，調(diào)節(jié)發(fā)情的主要生殖激素濃度不對等，這可能是經(jīng)產(chǎn)母牦牛產(chǎn)后生殖系統(tǒng)恢復困難、產(chǎn)犢間隔過長的主要原因之一，具體的發(fā)生機制還需要進一步驗證。

4 結 論

本研究對經(jīng)產(chǎn)母牦牛圍產(chǎn)后期血液代謝譜進行分析，通過關鍵代謝物的篩選及生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)產(chǎn)母牦牛圍產(chǎn)后期發(fā)生能量負平衡，糖代謝、脂類代謝和氨基酸代謝發(fā)生不同程度的代謝障礙，對生殖激素的合成和分泌造成影響，導致產(chǎn)后生殖系統(tǒng)恢復困難，但具體機制需要進一步驗證。本研究結果為高原地區(qū)母牦牛營養(yǎng)代謝和繁殖性能的研究提供了基礎資料和數(shù)據(jù)，為牦牛產(chǎn)業(yè)研究提供了新的方向。