不同年齡段牦牛瘤胃組織形態(tài)學(xué)與轉(zhuǎn)錄組研究

唐 嬌，夏 果，劉益麗，閔 奇，冉 嫆，謝書瓊，馬士龍，江明鋒*

(1.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041； 2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041)

瘤胃是反芻動(dòng)物特有的消化器官，從出生到成年，瘤胃結(jié)構(gòu)與功能會(huì)發(fā)生巨大的變化。新生反芻動(dòng)物攝食液體乳時(shí)，經(jīng)食管溝直接進(jìn)入皺胃消化，利用葡萄糖為機(jī)體供能[1-2]；成年反芻動(dòng)物瘤胃是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場(chǎng)所，因此瘤胃充分發(fā)育且功能健全是維持機(jī)體健康和發(fā)揮生產(chǎn)性能的重要前提。瘤胃的發(fā)育對(duì)其進(jìn)入反芻階段極其關(guān)鍵，發(fā)育完全的瘤胃可為反芻動(dòng)物提供儲(chǔ)存食物空間，其發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)可替代葡萄糖供能，VFA代謝可為機(jī)體提供70%～80%能量[3]。瘤胃上皮對(duì)不同VFA的吸收速率不一樣，其中丁酸的吸收速率最高，丙酸次之，乙酸最??；約95%的丁酸在瘤胃上皮細(xì)胞內(nèi)被代謝掉，主要為瘤胃壁的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量[4]，丙酸與乙酸代謝主要為整個(gè)機(jī)體發(fā)育提供能量[2]。

VFA的代謝終產(chǎn)物為酮體與膽固醇，過多酮體轉(zhuǎn)運(yùn)到血液中會(huì)引發(fā)酮病[5]，而細(xì)胞內(nèi)膽固醇及其代謝物(類異戊二烯)積累過多時(shí)會(huì)增大膜通透性，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)[6]。瘤胃VFA累積和生態(tài)失調(diào)會(huì)引發(fā)亞急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis，SARA)[7]。因此，瘤胃VFA代謝與瘤胃及機(jī)體健康息息相關(guān)；瘤胃微生物釋放脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)和組胺等內(nèi)毒素可誘發(fā)疾病，損害機(jī)體健康[8]；SARA使奶牛的牛乳磷脂、乳清酸等營(yíng)養(yǎng)成分降低，導(dǎo)致乳品質(zhì)下降[9]；瘤胃內(nèi)的毒素若進(jìn)入血液循環(huán)可抑制奶牛卵泡發(fā)育、成熟和排卵，甚至直接抑制胚胎的發(fā)育，影響其繁殖性能[10]。上述研究表明，瘤胃的健康與機(jī)體健康、產(chǎn)奶性能和繁殖性能密切相關(guān)。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序被廣泛應(yīng)用于瘤胃發(fā)育的分子機(jī)制研究。Kong等[11]對(duì)相同年齡段不同采食量肉牛瘤胃進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選出的差異表達(dá)基因和通路主要與免疫功能、炎癥、凋亡、細(xì)胞生長(zhǎng)/增殖、營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝途徑相關(guān)。Baldwin等[12]對(duì)14、42、56和70 d斷奶前后的荷斯坦奶牛瘤胃進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究，發(fā)現(xiàn)斷奶前后，荷斯坦奶牛瘤胃上皮從利用葡萄糖過渡到利用VFA為機(jī)體供能。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，日糧的營(yíng)養(yǎng)素和顆粒大小會(huì)影響參與瘤胃上皮細(xì)胞增殖/凋亡過程和補(bǔ)體復(fù)合體的基因表達(dá)。崔占鴻[14]通過轉(zhuǎn)錄組研究相同年齡段不同飼養(yǎng)方式下牦牛瘤胃發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)放牧牦牛瘤胃上皮乳頭發(fā)育緩慢和瘤胃炎癥基因表達(dá)量較高；代乳+補(bǔ)飼組有利于免疫細(xì)胞分化和改善免疫功能，有助于牦牛牛犢瘤胃健康發(fā)育。Li等[15]通過轉(zhuǎn)錄組研究哺乳與斷奶期奶牛瘤胃酸中毒對(duì)瘤胃發(fā)育的影響，富集到細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和形態(tài)發(fā)生等通路，表明瘤胃酸中毒會(huì)影響瘤胃上皮發(fā)育。Mackey[16]通過轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，在SARA奶牛瘤胃中同源細(xì)胞黏附的分子途徑上調(diào)，這表明瘤胃黏膜組織中存在結(jié)構(gòu)性反應(yīng)，以對(duì)抗炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的通透性屏障減弱。

牦牛(Bosgrunniens)是一種大型反芻家畜，全球95%的牦牛分布在我國(guó)青海、西藏、四川、甘肅、云南及新疆等地。牦牛作為一種全能經(jīng)濟(jì)家畜，為當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民提供肉、皮、毛、乳、牛糞等生活和生產(chǎn)資料[17]。牛屬動(dòng)物瘤胃轉(zhuǎn)錄組研究主要集中在肉牛和奶牛，牦牛相關(guān)研究較少。不同年齡段牦牛瘤胃轉(zhuǎn)錄組研究鮮有報(bào)道。鑒于此，本研究依據(jù)瘤胃組織形態(tài)發(fā)育的3個(gè)階段：非反芻階段(0～3周)、過渡階段(3～8周)和反芻階段(8周后)[18]，選取1日齡、20日齡、60日齡、15月齡和3歲齡的放牧牦牛作為研究對(duì)象，對(duì)瘤胃組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)合組織形態(tài)學(xué)鑒定對(duì)不同發(fā)育階段牦牛瘤胃進(jìn)行研究，以期為提高牦牛的生產(chǎn)性能提供理論參考與新思路。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣牦牛培育方式多采用自然放牧，即出生后隨母哺乳，并自由采食牧草與飲水。本試驗(yàn)選取非反芻階段(1日齡與20日齡)、過渡階段(60日齡)和反芻階段(15月齡與3歲齡)的健康牦牛作為研究對(duì)象，共5個(gè)年齡組，每組3頭。用滅菌剪刀取瘤胃1 cm×1 cm上皮及皮下組織塊，DEPC水沖掉附著的雜質(zhì)后迅速置于液氮中保存；取1.5 cm×1.5 cm瘤胃上皮及皮下組織塊放入4%多聚甲醛固定液中固定，用于瘤胃組織形態(tài)觀察。

1.2 瘤胃指數(shù)測(cè)量

準(zhǔn)確測(cè)量樣本體重，屠宰后取出復(fù)胃，將瘤胃、瓣胃、網(wǎng)胃和皺胃上相連部位結(jié)扎并將4個(gè)胃室分開，解剖發(fā)現(xiàn)剛出生的1日齡組瘤胃無(wú)固體內(nèi)容物；20日齡組瘤胃中有極少量牧草和大量奶塊；60日齡組瘤胃中有部分牧草和大量奶塊；15月齡與3歲組瘤胃中只有牧草。清空胃室內(nèi)容物，準(zhǔn)確測(cè)量瘤胃重量并記錄。瘤胃指數(shù)為瘤胃重(g)/體重(kg)，利用SPSS23.0軟件對(duì)瘤胃重量和瘤胃指數(shù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析(ANOVA)，差異顯著性使用Duncan’s法進(jìn)行多重比較(LSD)，定義P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示。

1.3 瘤胃組織切片制作及指標(biāo)測(cè)量

取4%多聚甲醛固定48 h的瘤胃組織，進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋處理，在切片機(jī)上切成厚約5 μm的切片，進(jìn)一步粘片、脫蠟至水和蘇木素伊紅(hematoxylin eosin，H.E)染色5 min，最后用中性樹膠固定，用顯微鏡對(duì)染色切片進(jìn)行觀察并拍照記錄。用DM750型光學(xué)顯微鏡在40倍下觀測(cè)瘤胃的乳頭數(shù)量與肌層厚度，采用case viewer圖像分析軟件進(jìn)行測(cè)量。

1.4 RNA提取與cDNA文庫(kù)構(gòu)建

使用mirVanaTMmiRNA ISOlation Kit(ambion-1561)試劑盒提取15個(gè)牦牛瘤胃組織總RNA，使用nanodrop-2000核酸蛋白測(cè)定儀(thermo fisher scientific)測(cè)定總RNA的濃度、純度(OD260 nm/OD280 nm)和RIN值。RNA提取后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，質(zhì)檢合格的RNA放入-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

使用I llmina?Tru SeqTMRNA樣品制備試劑盒構(gòu)建cDNA文庫(kù)。主要步驟包括： oligo(dT)的磁珠富集mRNA并將mRNA打斷成短片段。以打斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，合成雙鏈cDNA后使用試劑盒純化雙鏈cDNA；末端修復(fù)純化的雙鏈cDNA、加A尾并連接測(cè)序接頭，然后進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；構(gòu)建好的文庫(kù)用agilent 2100 bioanalyzer檢測(cè)文庫(kù)大小、濃度及質(zhì)量，得到合格cDNA文庫(kù)。

1.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與數(shù)據(jù)處理

利用Illumina二代高通測(cè)序平臺(tái)(Illumina HiSeq X ten)，采用PE150測(cè)序方式對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，獲得原始序列信息。利用trimmomatic軟件[19]對(duì)原始序列數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行質(zhì)控，去除帶接頭(adaptor)和低質(zhì)量的reads，過濾掉低質(zhì)量堿基以及N堿基得到有效數(shù)據(jù)(clean reads)，統(tǒng)計(jì)clean reads的Q30、GC含量。最后用Hisat2[20](版本：2.2.1，http://ccb.jhu.edu/software/hisat2)將clean reads與牦牛參考基因組(GCF_000298355.1)進(jìn)行序列比對(duì)。

1.6 主成分分析

使用HTSeq-count[21]軟件獲取比對(duì)到蛋白編碼基因上的reads數(shù)，cufflinks[22]軟件計(jì)算蛋白編碼基因的表達(dá)量FPKM值，用R語(yǔ)言繪制主成分分析(principal component analysis，PCA)二維圖。

1.7 差異表達(dá)基因篩選

使用HTSeq-count[21]軟件獲取每個(gè)樣本中比對(duì)到蛋白編碼基因上的reads數(shù)，使用DESeq (2012) R package[23]的estimateSizeFactors函數(shù)對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，使用nbinomTest函數(shù)計(jì)算差異顯著性(P-value)和差異倍數(shù)(Fold Change)，將P<0.05，log2(Fold Change)>2作為篩選差異表達(dá)基因(DEGs)的標(biāo)準(zhǔn)。

1.8 差異表達(dá)基因GO與KEGG富集分析

以1日齡樣本為參照，利用GOSeq對(duì)20日齡、60日齡、15月齡和3歲組牦牛瘤胃DEGs進(jìn)行GO富集分析，基于GO數(shù)據(jù)庫(kù)功能，將4個(gè)年齡段的DEGs按照生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)進(jìn)行分類，P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選顯著富集的GO條目和KEGG[24]信號(hào)通路。在顯著性通路中篩選與放牧牦牛瘤胃發(fā)育相關(guān)的基因。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

選取關(guān)鍵差異表達(dá)基因，利用 Primer BLAST 網(wǎng)站設(shè)計(jì)引物(表1)。將樣品測(cè)序返回的RNA通過TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)為 cDNA， 以gapdh作為內(nèi)參基因， 通過 Quant Studio 5 儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，采用 2-△△ct法分析數(shù)據(jù)，驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果。

表1 引物信息

2 結(jié) 果

2.1 瘤胃重量分析

1、20和60日齡牦牛的瘤胃重量與瘤胃指數(shù)差異不顯著(P>0.05)，15月齡與3歲牦牛的瘤胃重量與瘤胃指數(shù)顯著增加(P<0.05，圖1)。瘤胃重量與指數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)一致，非反芻階段至過渡階段幾乎無(wú)變化，反芻階段顯著增長(zhǎng)。

橫坐標(biāo)表示年齡，N=3/組；縱坐標(biāo)(左)表示瘤胃重量，縱坐標(biāo)(右)表示瘤胃指數(shù)

2.2 瘤胃組織形態(tài)學(xué)分析

組織切片H.E染色結(jié)果顯示(圖2)，1日齡和20日齡，瘤胃肌纖維排列密集，乳頭排列緊密，相較于1日齡，20日齡的瘤胃高度和寬度有所增加，但不明顯； 60日齡的瘤胃肌纖維出現(xiàn)間隔，乳頭高度和寬度明顯增加；15月齡和3歲牦牛的瘤胃的肌纖維間隙明顯，乳頭高度與寬度進(jìn)一步增加。統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表2)顯示，牦牛瘤胃的肌層厚度隨著日齡的增加顯著增加(P<0.05)；1日齡和20日齡牦牛的瘤胃乳頭高度和寬度均差異不顯著(P>0.05)，20日齡后，瘤胃乳頭高度和寬度隨著日齡的增加顯著增加(P<0.05)。切片形態(tài)變化與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果基本一致。

A-E. 1日齡、20日齡、60日齡、15月齡和3歲齡

表2 不同年齡放牧牦牛瘤胃上皮的形態(tài)結(jié)構(gòu)(Mean±SD)

2.3 總RNA質(zhì)量與測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

總RNA濃度均大于100 μg·μL-1，RIN值大于7，純度(OD260 nm/OD280 nm)均在2.0～2.2之間，28S/18S核糖體RNA條帶清晰且≥0.7，表明提取的RNA完整性較好，RNA質(zhì)量檢驗(yàn)合格，可用于后續(xù)試驗(yàn)分析。Agilent 2100 bioanalyzer檢測(cè)文庫(kù)的片段大小符合預(yù)期；文庫(kù)有效濃度大于4 nmol·L-1，結(jié)果表明高質(zhì)量cDNA文庫(kù)構(gòu)建成功。

15個(gè)瘤胃組織樣本得到720.41 Mb的clean reads，其中Q30百分比均在90%以上，GC含量在50%左右，比對(duì)到參考基因組的reads與clean reads的比率均在90%左右，表明測(cè)序質(zhì)量高，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，所選參考基因組的組裝滿足分析要求。

2.4 瘤胃基因表達(dá)水平分析

PCA圖結(jié)果顯示(圖3)，1日齡、20日齡、60日齡、15月齡和3歲牦牛的瘤胃基因表達(dá)水平組間獨(dú)立分散，形成非反芻階段(1日齡和20日齡)、過渡階段(60日齡)和反芻階段(15月齡和3歲)3個(gè)獨(dú)立子群。

圖3 不同年齡放牧牦牛瘤胃PCA圖

2.5 差異基因表達(dá)分析

以1日齡組為對(duì)照，在20日齡、60日齡、15月齡和3歲組中分別鑒定到1 462、2 146、3 454和3 003個(gè)DEGs，去掉重復(fù)后共獲4 635個(gè)DEGs(圖4A)；20日齡、60日齡、15月齡和3歲組特有DEGs分別為163、298、688和511個(gè)，4個(gè)年齡組共有基因782個(gè)，包括SLC26A3、PPARG、HMGCS2等基因。差異基因聚類分析結(jié)果顯示，20與60日齡組差異基因表達(dá)譜相近，15月齡與3歲組差異基因表達(dá)譜相近，提示20日齡與60日齡組發(fā)育情況相近，15月齡與3歲組發(fā)育情況相近(圖4B)。

A.不同年齡放牧牦牛瘤胃差異表達(dá)基因韋恩圖；B. 不同年齡放牧牦牛瘤胃差異表達(dá)基因表達(dá)量層次類聚圖

2.6 差異表達(dá)基因的GO富集分析與KEGG富集分析

對(duì)4個(gè)年齡組的DEGs進(jìn)行GO富集分析，在20日齡、60日齡、15月齡和3歲組中分別有2 501、2 891、3 565和3 219條顯著條目。按P值排序篩選BP、CC和MF三大類的前10條顯著性GO條目(圖5A、B、C)。結(jié)果表明，不同年齡組的前10條顯著性GO條目中有共有的，也有各年齡階段特有的。如在生物過程中，20日齡和15月齡富集到膽固醇生物合成顯著性條目；60日齡組富集到脂肪酸代謝顯著性條目；15月齡和3歲組富集到脂肪酸β-氧化顯著性條目。

分別對(duì)4個(gè)年齡組的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG功能富集分析，在20日齡、60日齡、15月齡和3歲組中分別有86、89、97和99條顯著通路。按P值排序篩選4個(gè)年齡組的前30條顯著性KEGG通路(圖5D)。結(jié)果顯示，每個(gè)年齡組前30條顯著通路同樣存在共有的，也有各年齡階段特有。如20日齡組富集到丁酸代謝通路；60日齡、15月齡、3歲組富集到丙酸代謝通路；4個(gè)年齡組共有的P450對(duì)外源性物質(zhì)的代謝和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用途徑。

2.7 瘤胃發(fā)育候選基因篩選

本研究富集12條到參與瘤胃發(fā)育的通路，篩選到36個(gè)候選基因(表3)。其中HMGCS2、SLC26A3、PPARG和PPARD與瘤胃營(yíng)養(yǎng)吸收和代謝相關(guān)的重要候選基因，CCL5研究相對(duì)較少。

表3 參與瘤胃VFA吸收與代謝的候選通路與基因

2.8 RT-qPCR驗(yàn)證

驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果顯示(圖6)，以1日齡為對(duì)照，CCL5和PPARG基因在20日齡、60日齡、15月齡和3歲組顯著上調(diào)；ATP1B1在20日齡、60日齡、15月齡和3歲組顯著下調(diào)；COL1A1在15月齡和3歲組顯著下調(diào)。上述所挑選的差異表達(dá)基因的RT-qPCR變化規(guī)律與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)表達(dá)規(guī)律一致，進(jìn)一步表明所分析的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可信。

圖6 差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

(轉(zhuǎn)下頁(yè)Carriedforward)

(續(xù)圖5Continued)

A-C.分別指4個(gè)年齡組DEGs在BP、CC、MF三大類中前10個(gè)GO條目；D. 4個(gè)年齡組DEGs富集的前30條KEGG通路。氣泡大小表示DEGs的數(shù)量，氣泡顏色表示錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR P-value)，橫軸為-lg(P-value)值，縱軸顯示GO條目或者KEGG通路

3 討 論

牦牛瘤胃發(fā)育與其機(jī)體健康和生產(chǎn)性能的發(fā)揮緊密相關(guān)，引起了廣泛的關(guān)注，但目前牦牛瘤胃發(fā)育機(jī)理尚不清楚，還需進(jìn)一步研究相關(guān)分子機(jī)制，為牦牛生產(chǎn)提供理論參考和新思路。瘤胃發(fā)育涉及組織形態(tài)以及代謝等多個(gè)層面的變化，研究表明瘤胃上皮乳頭高度與寬度、肌層厚度是衡量瘤胃發(fā)育程度的重要指標(biāo)[14]，上皮乳頭可以增加瘤胃上皮的吸收表面積[25]；瘤胃肌層厚度的增加，在瘤胃容積和重量的擴(kuò)增、蠕動(dòng)性增強(qiáng)方面發(fā)揮積極作用[26]。本研究中，隨著年齡增長(zhǎng)，牦牛瘤胃重量與指數(shù)增長(zhǎng)速率增加，提示隨著年齡增加瘤胃發(fā)揮更重要的作用。20日齡、60日齡、15月齡和3歲組牦牛瘤胃中均有內(nèi)容物；組織切片結(jié)果顯示，乳頭與肌層發(fā)育良好，肌層厚度顯著增加(P<0.05)，20日齡后瘤胃乳頭高度與寬度隨著年齡增加而顯著增加(P<0.05)，肌層厚度發(fā)育較乳頭發(fā)育更早，而張科[27]研究表明，28日齡絨山羊瘤胃乳頭發(fā)育比肌層厚度發(fā)育更早。原因在于牦牛以放牧方式培育，開食較早，在20日齡時(shí)已經(jīng)開食牧草，因此牦牛瘤胃肌層厚度發(fā)育更早；另外可能由于物種特異性，牦牛瘤胃乳頭發(fā)育更晚。

研究表明，粗飼料對(duì)瘤胃肌層厚度起到物理刺激作用[28]，牧草進(jìn)入瘤胃，經(jīng)瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)生VFA，可刺激瘤胃乳頭發(fā)育[29]。本研究中GO富集分析顯示，20日齡與15月齡DEGs富集到膽固醇生物合成通路，該通路參與瘤胃上皮細(xì)胞膽固醇平衡，而瘤胃上皮細(xì)胞膽固醇濃度與VFA代謝相關(guān)[30]，推測(cè)以放牧方式培育的牦牛在20日齡時(shí)可能已經(jīng)開始采食牧草，并經(jīng)瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)生VFA，此時(shí)瘤胃可能己經(jīng)開始進(jìn)行VFA吸收與代謝。60日齡DEGs富集到脂肪酸代謝，15月齡和3歲DEGs富集到β脂肪酸-氧化，研究表明這些通路與瘤胃反芻階段轉(zhuǎn)變?yōu)橐訴FA氧化供能相關(guān)[12]，提示60日齡時(shí)牦牛瘤胃可能轉(zhuǎn)變?yōu)橐訴FA代謝供能。本研究中KEGG富集結(jié)果顯示，20日齡的DEGs富集到丁酸代謝通路與PPAR信號(hào)通路，已有研究報(bào)道丁酸可促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞的有絲分裂與增殖，進(jìn)而促進(jìn)瘤胃乳頭生長(zhǎng)發(fā)育[31]，PPAR信號(hào)通路可能通過調(diào)控VFA代謝影響瘤胃發(fā)育[32]，進(jìn)一步說明20日齡牦牛瘤胃開始進(jìn)行VFA代謝，以促進(jìn)瘤胃快速發(fā)育，與GO分析結(jié)果一致。60日齡、15月齡和3歲組DEGs富集到丙酸代謝通路，3歲組DEGs富集到丙酮酸代謝通路，丙酸是反芻動(dòng)物瘤胃中主要的VFA之一，最后轉(zhuǎn)化為糖類為機(jī)體供能[33]，丙酮酸是糖、蛋白質(zhì)、脂肪三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的重要樞紐[34]，因此推測(cè)丙酸代謝通路和丙酮酸代謝通路可能參與調(diào)控60日齡牦牛瘤胃發(fā)育；60日齡和15月齡組DEGs富集到礦物質(zhì)吸收通路，礦物質(zhì)是細(xì)胞的重要組成部分，參與營(yíng)養(yǎng)吸收代謝，與VFA吸收相關(guān)[32]。上述結(jié)果表明，20日齡放牧牦牛瘤胃可能開始VFA代謝，通過VFA吸收與代謝相關(guān)通路調(diào)控瘤胃快速發(fā)育。

GO富集分析顯示，20日齡、60日齡和15月齡組DEGs富集到免疫反應(yīng)生物過程，15月齡和3歲組DEGs富集到與LPS刺激瘤胃上皮細(xì)胞遷移相關(guān)的細(xì)胞粘連生物過程[35]。KEGG富集結(jié)果顯示，20日齡、60日齡、15月齡和3歲組DEGs均顯著富集到細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路，3歲組DEGs富集到PI3K-Akt信號(hào)通路，與LPS刺激瘤胃上皮細(xì)胞遷移相關(guān)[35]；20日齡、15月齡和3歲組DEGs富集到Th17細(xì)胞分化通路，該通路與免疫細(xì)胞分化與改善免疫功能相關(guān)[14]。20日齡、60日齡、15月齡和3歲組DEGs顯著富集到細(xì)胞色素P450外源性物質(zhì)的代謝途徑，20日齡、15月齡和3歲組DEGs顯著富集到類固醇生物合成途徑，均致力于消除瘤胃上皮細(xì)胞內(nèi)的飲食副產(chǎn)物、外源性物質(zhì)和環(huán)境污染物，表明上皮可能受到來(lái)自內(nèi)腔的大量異源抗原的侵襲[36]； 15月齡和3歲組DEGs富集到ECM受體相互作用途徑，分布在細(xì)胞間的膠原蛋白、絲蛋白和纖維連接蛋白等生物大分子，維持瘤胃上皮的完整性和屏障功能[37]。提示可能由于高原環(huán)境污染，牦牛瘤胃上皮受到侵襲；而20日齡牦牛瘤胃開始通過調(diào)控免疫和上皮維護(hù)相關(guān)通路促進(jìn)瘤胃健康發(fā)育。

在上述通路中篩選到HMGCS2、SLC26A3、PPARG、PPARD和CCL5等與瘤胃營(yíng)養(yǎng)吸收、代謝和免疫相關(guān)的候選基因。3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A合成酶2(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 2，HMGCS2)是瘤胃上皮細(xì)胞酮體合成的限速酶，調(diào)控VFA代謝[38-39]，其表達(dá)受過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)的調(diào)控[40]。溶質(zhì)載體家族26成員3(solute carrier family 26 member 3，SLC26A3)編碼的蛋白質(zhì)是一種跨膜糖蛋白，通過細(xì)胞膜運(yùn)輸氯離子以交換碳酸氫根離子，參與VFA/HCO3交換，對(duì)瘤胃VFA吸收起作用[41]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)和過氧化物酶體增殖物激活受體δ(PPARD)均屬于PPARs家族，PPARG調(diào)控瘤胃內(nèi)細(xì)胞分化，影響瘤胃發(fā)育[42]；PPARD在瘤胃上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化中起作用，是瘤胃上皮發(fā)育的重要調(diào)控因子[43]。C-C基序趨化因子配體5(C-C motif chemokine ligand 5，CCL5)是CC亞家族趨化因子基因，具有調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的功能，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放，參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程[44]。研究表明，CCL5分布在瘤胃上皮的基底和棘突層，CCL5可能是瘤胃免疫系統(tǒng)關(guān)鍵角色之一，在瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[45]。

4 結(jié) 論

本研究中，牦牛瘤胃形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育較早，20日齡是其發(fā)育的重要臨界點(diǎn)。牦牛瘤胃肌層厚度發(fā)育相較于瘤胃乳頭更早，肌層厚度從20日齡快速增加，瘤胃乳頭從20日齡后快速發(fā)育；20日齡開始VFA代謝，促進(jìn)瘤胃快速健康地發(fā)育。本研究為牦牛瘤胃發(fā)育機(jī)理研究提供理論參考，同時(shí)為牦牛生產(chǎn)提供新思路。但與瘤胃營(yíng)養(yǎng)吸收、代謝和免疫相關(guān)的候選基因HMGCS2、SLC26A3、PPARG、PPARD和CCL5等未進(jìn)行驗(yàn)證，后期可以在細(xì)胞水平進(jìn)行基因的功能驗(yàn)證，以及結(jié)合多組學(xué)研究，探究牦牛瘤胃發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。